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Methodenartikel

Eine Methode, um die Auswirkungen der Umweltanreicherung Doppelpunkt Microbiome Biodiversitätskonvention in einem Mausmodell Doppelpunkt Tumor definieren

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DOI:

10.3791/57182

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28. Februar 2018

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1Division of Gastroenterology, Hepatology, and Nutrition, Department of Internal Medicine, University of Utah, 2Huntsman Cancer Institute, University of Utah

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Environmental Enrichment (EE) ist eine Unterbringung von Tieren, die verwendet wird, um Mechanismen zu offenbaren, die die Zusammenhänge zwischen Lebensstil, Stress und Krankheit zugrunde liegen. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren, das verwendet ein Maus-Modell der Doppelpunkt Tumorgenese und EE speziell Veränderungen in Mikrobiota Artenvielfalt definieren, die tierischen Sterblichkeit auswirken können.

Zusammenfassung

Mehrere neuere Studien haben gezeigt, dass die positiven Auswirkungen des Lebens in einer angereicherten Umgebung auf die Verbesserung der menschlichen Krankheit. Bei Mäusen Umweltanreicherung (EE) reduziert Tumorgenese durch die Aktivierung des Immunsystems Maus oder Tumor tragenden Tiere überleben durch die Stimulierung der Wunde Reparatur Reaktion, einschließlich der verbesserten Microbiome Vielfalt in der Mikroumgebung Tumor betrifft. Hier liegt ein detailliertes Verfahren zur Beurteilung der Auswirkungen von Umweltanreicherung auf die Biodiversität des Mikrobiom in einem Mausmodell für Darm-Tumor. Vorsichtsmaßnahmen bezüglich Tierzucht und Überlegungen für die Tier-Genotyp und Maus-Kolonie-Integration werden beschrieben, die letztendlich auf mikrobielle Artenvielfalt auswirken. Diese Vorsichtsmaßnahmen beachtet kann mehr einheitliche Microbiome Übertragung, und folglich wird lindern Nichtbehandlung abhängige Effekte, die Studienergebnisse verwirren können. Weitere, in diesem Verfahren Mikrobiota Änderungen sind mit 16 s rDNA Sequenzierung der DNA isoliert vom Hocker, gesammelt aus dem distalen Dickdarm nach langfristigen Umweltanreicherung charakterisiert. Darm Microbiota Ungleichgewicht ist verbunden mit der Entstehung von entzündlichen Darm-Krankheit und Darmkrebs, aber auch von Fettleibigkeit und Diabetes unter anderem. Wichtig ist, kann dieses Protokoll für EE und Mikrobiom Analyse genutzt werden, um die Untersuchung der Rolle von Microbiome Pathogenese über eine Vielzahl von Krankheiten, wo robuste Mausmodelle existieren, die menschliche Krankheit rekapitulieren kann.

Einleitung

Umweltanreicherung (EE) Studien nutzen komplexe Gehäuse Parameter um soziale Stimulation (großes Gehäuse Käfige, größere Gruppen von Tieren), kognitive Stimulation (Hütten, Tunnel, Verschachtelung Materialien, Plattformen) und körperliche Aktivität (laufen zu beeinflussen Räder). EE ist durch viele Labore zu verstehen, die Auswirkungen der erhöhten Aktivität und verbesserte soziale und kognitive Interaktionen auf Krankheit Initiation und Progression mit einer Vielzahl von Mausmodellen, einschließlich Barbe induzierte Alopezie, Alzheimer-Krankheit verwendet worden, Rett-Syndrom und mehrere Tumor und Magen-Darm-Krankheit-Modelle1,2,3,4,5,6.

Mehrere Maus-Modelle wurden entwickelt, um Doppelpunkt Tumorgenese bei Mäusen zu studieren. Vielleicht ist das am meisten klar definierte Modell der ApcMin -Maus. Die Apc-Min -Maus wurde im Labor von William Dove in 19907entwickelt und wird als ein Maus-Modell der Mutationen im APC -gen, die häufig im Zusammenhang mit menschlichen colorectal Krebs sind. Im Gegensatz zu Menschen beherbergen APC Mutationen entwickeln ApcMin Mäuse in erster Linie kleinen Darmtumoren mit sehr seltenen Auftreten von Dickdarm-Tumoren. Ein Tcf4Het Allel mit einer einzigen Profi-Ko heterozygote Mutation im Tcf4, erhöht jedoch erheblich Doppelpunkt Tumorgenese in Kombination mit dem ApcMin -Allel-8. Vor kurzem wurde diese Maus-Modell der Doppelpunkt Tumorgenese Ermittlung die Auswirkungen von EE auf Doppelpunkt Tumorgenese6eingesetzt. Im Bice Et Al. studieren, die physiologischen und phänotypischen Auswirkungen von EE auf Männchen und Weibchen von vier verschiedenen Mauslinien (Wildtyp (WT), Tcf4Het / + Apc+ / +, Tcf4+ / + ApcMin / +, und Tcf4 Het / + APCMin / +)) definiert wurden. Vielleicht war die interessanteste Erkenntnis, dass EE wesentlich die Lebensdauer der männlichen und weiblichen Doppelpunkt Tumor-tragenden Tieren erhöht. Dies zeigte, dass EE zumindest reduzieren kann einige der Symptome verbunden mit Doppelpunkt Tumorgenese und Verbesserung der Tiergesundheit. Bemerkenswert ist, diese verbesserte Lebensdauer bei Männern ist keine direkte Folge der reduzierten Tumorgenese und stattdessen auf die Einleitung einer Tumor-Wundheilung Reaktion, einschließlich verbesserte Microbiome Biodiversität6verknüpft war.

Mehreren EE spezifische Studien wurden mit interessanten Ergebnissen veröffentlicht. Aus technischer Sicht sind wichtige Ergebnisse oft nicht übersetzbar an andere Laboratorien. Identische EE Methoden zwischen verschiedenen Labors ist ein unglaublich komplexes Thema, nicht nur wegen Bereicherung Geräte und Gehäuse eingesetzt, aber auch Bettwäsche, Essen, Belüftung, Zucht, Genetik, Aktivität in den Raum, und Tier-Protokoll Anforderungen, unter anderem9,10,11. Ein Beispiel ist Tier Integration, wo müssen Tiere stabil in der Kolonie Maus integriert werden daher Normalisierung der genetische Hintergrund und Ernährung Zusammensetzung, um verwandte Behandlungseffekte zu vermeiden. Weitere, viele EE-Studien vor der Realisierung der Bedeutung des Mikrobiom in Krankheit und die Art und Weise, dass gemeinsame Maus Haltungspraktiken können Einfluss auf die Zusammensetzung der Darm Microbiome10,12abgeschlossen wurden.

Zucht-Strategie und Tier Platzierung in EE kann Stress erhöhen, wenn Sie nicht korrekt ausgeführt. Da EE Studien viele männliche und weibliche Tiere und mehrere Genotypen nutzen, kann Versuchsaufbau schwierig sein angesichts der Forderung für Tiere aus mehreren Würfen kombiniert werden. Daher wurde eine Zucht und Entwöhnung Strategie entwickelt, damit für die Kombination der entwöhnte Tiere von der richtigen Genotyp aus verschiedenen Würfen. Der primäre Grund dafür war die Mikrobiota unter Würfe zu normalisieren und Stress zu reduzieren, wenn Tiere in die experimentelle Umgebung verschoben wurden. Das Mikrobiom wurde aus dem Damm10übertragen. Um mikrobielle Vielfalt in die Kolonie zu bieten, wurden Weibchen von Jackson Labs gekauft und in die Kolonie für einen Monat vor Beginn des Experiments9,10,12integriert. Um weitere Microbiome Biodiversität zwischen Tieren zu normalisieren, waren Frauen vor der Zucht zusammen untergebracht. Nach Zucht, kommunale Wohnraum während der Aufzucht und die Fähigkeit, entkommen verbesserte Pflege Welpen den Stress der mütterlichen Fürsorge13,14, eventuell Förderung Microbiome Normalisierung. Um zu verhindern, dass nicht-EE im Zusammenhang mit Auswirkungen auf das Mikrobiom, dieses kommunale Gehäuse alle Versuchstiere verhindert kämpfen und zusätzliche Stress, die aufgetreten sind, wenn mehrere Männchen aus verschiedenen Würfen in einem experimentellen Käfig kombiniert. Zu guter Letzt wurden paritätisch von Tieren alle Genotypen in den Käfigen. Dies bot die Gelegenheit für verbesserte Mikrobiota Biodiversität über Genotypen und entfernt den Beitrag der Koprophagie (das Tier tendenziell Hocker verbrauchen) oder möglichen Genotyp-spezifische Verhaltensunterschiede der gesamten Studie.

Dieses Protokoll sieht eine Strategie, die EE Vorgängerstudien um unbekannte Aspekte des Mikrobiom Forschung, einschließlich Mikrobiota Übertragungs- und Tier Kolonie Integration für Mikrobiota Normalisierung ermöglichen mehr einheitliche Microbiome Populationen erweitert erweitert zwischen den Versuchstieren. Beherzigen diese Vorsichtsmaßnahmen unbedingt aufgrund der Fähigkeit von Nichtbehandlung Verwandte Mikrobiota Unterschiede um Studienergebnisse zu verwirren. Beseitigung von nicht-EE bezogene Mikrobiota Änderungen, speziell die Rolle von EE auf Mikrobiota Zusammensetzung während der Entwicklung der Krankheit und das Fortschreiten definieren erlauben werden.

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Protokoll

Alle hier beschriebene Methoden wurden gemäß Protokollen vom institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) an der University of Utah genehmigt durchgeführt.

1. Versuchsanordnung und EE und Kontrolle Käfig Setup

Hinweis: Als Referenz, wird ein Überblick über das experimentelle Design dargestellt (Abbildung 1).

  1. Steuerung (NE) und EE Käfige einrichten (Abbildung 2).
    1. Um NE Käfige einzurichten, verwenden Sie autoklaviert konventioneller Ansteuerung Käfige (Tabelle 1), die Anreicherung Geräte fehlen.
    2. Bohren Sie für große Käfige ein Loch pro Käfig, der groß genug für eine Öse und einen Tunnel (Table of Materials) ist.
    3. Zum Einrichten der Aufzucht von Welpen und EE Käfige verbinden Sie zwei große autoklaviert Käfige mit einem sterilisierten Öse gesicherten Tunnel und 2 sterilisierte Plattformen Bodenfläche (Tabelle 1) zu erhöhen. EE-Experimente vorsehen Sie, sterilisierte laufen Räder, Tunnel, Iglus, Hütten, Crawl Kugeln und Verschachtelung Material innerhalb der EE-Käfige.
    4. EE und NE Käfige in einem belüfteten Rack gleich Belüftung zu platzieren.
      Hinweis: Zwei große Käfige mit 2 Plattformen (Tabelle 1) zu ermöglichen, für maximal 12 trächtige Weibchen pro Welpe Aufzucht Setup15 (siehe Tabelle der Materialien, Schritt 3.2 im Dokument und Tabelle 2).
    5. Füttern Sie Mäuse, Ad Libitum bestrahlt standard Chow und autoklaviert Umkehr-Osmose-Wasser.
    6. Bieten Sie Mäuse mit sterilen Bettzeug-Materialien.
      Hinweis: Alle Manipulationen von leeren Käfigen und Gehegen mit Tieren erfolgt in der Haube, um Kontaminationen zu vermeiden. Decken Sie für Käfig Manipulation des großen Käfigen das Loch in den Käfig mit einer Klebefolie ab.
  2. Bereiten Sie Tiere für die Zucht. Haus 15 2 - Monate altes Weibchen in einem einzigen großen Käfig (Tabelle 1) für 2 Wochen vor der Paarung zu gruppieren. Separat Haus 2 - Monate alten stellt Männer für 2 Wochen vor der Paarung.
    Hinweis: Die Anzahl der Weibchen für die Zucht ist das Experiment und die Anzahl der Tiere abhängig. In dieser Studie 15 Weibchen wurden eingesetzt um 12 verstopften Weibchen zu erhalten ist die maximale Anzahl in den Welpen Aufzucht in 1.1.2 (Tabelle 2) beschriebene Setup erlaubt.
  3. Kombinieren Sie für die Zucht Vater und Mutter Tiere pro 2 Weibchen 1 Rüde. Die erste Check-in am Morgen sollte für vaginalen Stecker, die ein visuellen Zeichen sein kann, die die Tiere in der Nacht gepaart haben.
    Hinweis: Haus Rüden und Hündinnen zusammen, bis jedes Weibchen angeschlossen hat. Ein vaginaler Stecker kann visuell identifiziert werden, wenn es extern ist.
    1. Um internalisierte Stecker zu erkennen, wird eine Sonde in die vaginale Öffnung eingefügt und wenn der vaginal Plug vorhanden ist, ist die Sonde nicht leicht einführen (16; siehe Abschnitt 4.3.6).
      Hinweis: Notieren Sie am Morgen, die, den ein Stecker als ½ Tag erkannt wird, da die Paarung in der Nacht auftrat.
    2. Sobald Frauen vaginale Stecker haben, übertragen Sie sie auf einen großen Welpen Aufzucht Käfig für Gruppenhaltung mit anderen begatteten Weibchen (Setup im Schritt 1.1.2 ohne Anreicherung Geräte).
    3. Ersetzen verpaart Weibchen mit neuen unbegatteten Gruppe untergebracht Weibchen zur Paarung und weiter Paarung um eine maximale Anzahl von Würfen in einem Zeitraum von 7 Tagen zu erhalten.
      Hinweis: Alle Tiere müssen einen Liefertermin innerhalb von 7 Tagen von einander haben.
  4. Können Sie trächtige Weibchen gebären in Gruppenhaltung, so dass alle Würfe innerhalb eines großen Welpen Aufzucht Käfig (Setup im Schritt 1.1.2 ohne Anreicherung Geräte) ausgelöst werden.
    1. Behalten Sie den Überblick Welpen Zahlen und Geburtsdaten und Genotypisierung Welpen im Alter von 7 Tagen zu beginnen.
      1. Tattoo-Welpen auf ihren Zehen in 7 Tage alt mit einem Zahlencode, sie13,17zu identifizieren.
      2. Reinigen Sie den Zeh mit 70 % Ethanol und sanft fügen Sie ein Mikro-Tattoo-Gerät mit Tinte in der Hautoberfläche parallel zur Zehe17 (siehe Tabelle der Materialien).
      3. Sammeln Sie Gewebe mit einer Schere für die Genotypisierung von den Schweif Spitzen durch Eingrabung ein kleines Stück Gewebe aus 7 - Tage alten Neugeborenen.
    2. Isolieren von genomischer DNA aus Gewebe und führen Sie PCR unter Verwendung einer herkömmlichen HotSHOT-Methode, wie beschrieben in 18.
    3. Separate Tiere nach Geschlecht bei 14-21 Tage in großen Käfigen mit Müttern.
      Hinweis: Sicherstellen Sie, dass die älteren Welpen sind in der Lage, ihre eigenen feed auf, und jüngere Welpen weiterhin bis alt genug, um ihre eigenen ernähren sich von Krankenschwester.
    4. 21-28 Tage verteilen Sie männliche und weibliche Tiere separat vom Genotyp in NE oder EE Umgebungen, und achten Sie auf gleich große Anteile von jeder Genotyp pro Käfig (Abb. 2A) zu halten.
      Hinweis: Stellen Sie sicher, dass die Gesamtzahl der Tiere in jeder NE oder EE Käfig erlaubt auf die maximale Anzahl von IACUC (Tabelle 2) erlaubt. Die NE Käfige haben höchstens 5 Tiere (Tabelle 2). In EE Käfigen für soziale Stimulation, nicht weniger als 20 und mit Raumbeschränkungen darf nicht mehr als 41 Tiere in den EE-Käfig (Tabelle 2).

(2) Hocker Sammlung 16 Wochen alt

  1. Beginnen Sie Hocker Sammlung 1 bis 2 Tage vor dem zu opfern, und sammeln Sie Hocker auf dem Tag der Opfer während der Präparation mit sterilen Werkzeugen getrennt zu.
    Hinweis: Sammeln von Hocker zur gleichen Zeit 1-2 Tage vor der Entnahme kann helfen, um den Verlust einer Probe durch die Möglichkeit zu vermeiden, dass kein Hocker zum Zeitpunkt der Sammlung vorhanden ist.
    1. Zum Sammeln von lebenden Tieren, sorgfältig Genick des Tieres über einen sauberen Käfig Hocker. Hocker mit sterilen Pinzette in eine sterile Microfuge Rohr zu sammeln.
      Hinweis: Tiere werden in der Regel beseitigen Hocker wenn immobilisiert, ermöglicht eine schnelle Hocker Sammlung direkt in ein steriles Microfuge Rohr. Wenn ein Tier nicht sofort Stuhlgang, wenn immobilisiert, legen Sie sie in einen sauberen Käfig und warten auf das Tier zu verrichten (in der Regel bis zu 1 h).
    2. Sammeln Sie Hocker auf dem Tag der Opfer.
      1. Legen Sie für euthanizing das Tier, das Tier unter einer Glasglocke mit einem kleinen Behälter mit einem Wattebausch, getränkt in Isofluran. Nach Beendigung der Atmung (in der Regel nach 2 min) beobachtet wird, legen Sie das Tier auf den Rücken Doppelpunkt Dissektion zu ermöglichen.
      2. Die Maus-Bauch 70 % igem Ethanol zuweisen.
      3. Heben Sie die Haut vor der Harnröhrenöffnung mit Zange, und mit einer Schere schneiden Sie entlang der ventralen Mittellinie bis zum Erreichen des Brustkorbs und Schneiden von der Basis des ersten Schnittes auf jedem Bein. Klappen Sie die Haut und mit einer Schere durchschneiden der peritonealen Wand in dem gleichen Muster.
      4. Verwenden Sie Pinzetten erfassen der distalen Colon am After zu zerlegen und trennen den distalen Doppelpunkt aus dem Rektum. Beim Ziehen der Doppelpunkt vertikal mit der Pinzette, mit einer Schere durchschneiden das Mesenterium des Dickdarms zu veröffentlichen.
      5. Den Doppelpunkt direkt unterhalb der Blinddarm und legen Sie es auf Filterpapier. Verwenden Sie Zange, heben Sie die Spitze der Doppelpunkt-Röhre, öffnen das Lumen damit einseitig offenen Schere eingefügt werden kann. Geschnitten Sie längs auf, distal, proximal und Spreizfuß des Doppelpunkts in Längsrichtung.
      6. Hocker aus dem distalen Dickdarm in ein steriles Microfuge Rohr mit steriler Pinzette zu sammeln.
  2. Lagern Sie Hocker bis zur Zeit der bakteriellen DNA-Isolation in einer Microfuge Röhre bei-80 ° c.
    Hinweis: Am Tag der Opfer, neben dem Hocker sammeln Sie andere Proben wie Blut, Serum, Plasma, normal und Tumorgewebe von Dickdarm und Dünndarm, Microsomen, Fettgewebe, etc.. in der Studie definierte Fragen.

(3) genomische DNA isoliert vom Hocker

Hinweis: Nutzen Sie eine kommerzielle Kit zur mikrobiellen DNA vom Hocker nach einem Hocker Erreger Erkennung Protokoll zu isolieren. Proben für die-80 ° c Gefrierschrank und Store auf Trockeneis direkt beim Wiegen zu entfernen.

  1. Bis zu 220 mg des Hockers auf eine saubere Microfuge Röhrchen mit 1,4 mL der Raumtemperatur (RT) Hocker Lyse Puffer übertragen (siehe Tabelle der Materialien).
  2. Vortex-Probe für 1 min um Feststoffe (Abbildung 2B) gründlich zu homogenisieren. Erhitzen Sie die Aussetzung bis 95 ° c für 5 min um alle Bakterien (einschließlich grampositive Bakterien) zu lösen.
  3. Vortex-Proben für 15 s und dann Zentrifuge bei 20.000 x g für 1 min um die Hocker Feststoffe pellet. Übertragen Sie überstand auf ein 2-mL Microfuge Rohr. Jede Probe zu absorbieren PCR-Inhibitoren, Wirbel, bis sich die Tablette aufgelöst hat, eine Tablette hinzu, und inkubieren Sie die Probe bei RT für 1 min.
  4. Die Probe bei 20.000 x g für 3 min Zentrifugieren und den Überstand auf eine neue Microfuge Rohr übertragen. Zentrifugieren Sie bei 20.000 x g für 3 min. aliquoten 15 μl von Proteinase K (20 mg/mL Brühe) in ein neues 1,5 mL Microfuge Rohr. Pipette 200 μl der Probe in das Rohr mit Proteinase K.
  5. Fügen Sie 200 μL des Guanidinium Chlorid Lyse Puffer am Rohr, Vortex gründlich für 15 s (siehe Tabelle der Materialien) und inkubieren Sie Probe bei 70 ° c für 10 min. Fügen Sie 200 μl Ethanol (96-100 %) an den Rohren und mischen Sie gut durch aufschütteln.
  6. Ort eine Kieselsäure basierte Spin-Spalte in der Sammlung 2-mL-Tube und gelten die Proben für die Spalte. Schließen Sie den Deckel und Zentrifuge für 1 min bei 20.000 x g.
  7. Die Spalte an eine neue 2 mL Sammelröhrchen übertragen und 500 μl Waschpuffer 1 auf die Spalte, Kappe, die Spalte und die Zentrifuge für 1 min bei 20.000 x g. Übertragung der Spalte an eine neue 2 mL Sammelröhrchen und 500 μl Waschpuffer 2 hinzufügen der Spalte hinzufügen , schließen Sie die Kappe und Zentrifuge bei 20.000 x g 3 Minuten lang.
  8. Mit dem Deckel geschlossen die Spalte an eine neue 2 mL Sammelröhrchen übertragen, und Zentrifugieren für eine zusätzliche 1 min bei 20.000 x g, passives Waschpuffer zu entfernen. Die Spalte auf einen 1,5 mL beschriftet Microfuge Rohr übertragen und eluieren Probe durch Zugabe von 200 μl der Elution Puffer mit EDTA an die Membran (siehe Tabelle der Materialien).
  9. Schließen Sie den Deckel und 1 min. Zentrifuge der Probe für 1 min bei 20.000 x g. verwerfen die Spalte bei RT inkubieren.

4. DNA Konzentrationsbestimmung und Probenvorbereitung für PCR

Hinweis: Nutzen Sie ein Fluorometer und einem handelsüblichen DsDNA fluoreszierende Assay genomische DNA-Konzentration in jeder Probe zu bestimmen (siehe Tabelle der Materialien). Der Fluoreszenzfarbstoff muss doppelte stranded DNA spezifisch binden.

  1. Bereiten Sie eine Verdünnung von 1: 200 von jeder Probe (1 µL jeder Probe in 199 µL DsDNA-master-Mix) und eine 01:50 Verdünnung der Standards. Analysieren Sie auf einem Fluorometer mit DsDNA-Einstellung.
    Hinweis: Ein hohes Volumen an DNA in PCR kann hemmende, das Volumen der DNA verwendet, muss deshalb nicht mehr als 10 % der letzte Band der PCR. Ein Fluorometer ermöglicht genaue Messung der DNA in der Probe nur DNA gebunden, der Fluoreszenzfarbstoff fluoreszieren wird, Beseitigung des möglichen Beitrags der Verunreinigungen, die letzte berechnete DNA-Konzentration. Diese genaue Quantifizierung ist essentiell für die nachgelagerte Sequenzierung Anwendung.
  2. Bereiten Sie PCR Vorlagen verdünnt, um 5 ng/μl mit dem entsprechenden Volumen von 10 mM Tris, pH 8,5, funktionierende Vorlage Aktien jeder Probe zu machen.
  3. Shop-Proben bei-20 ° C.

5. Design Primer an die 16 s gewünscht V-Regionen

  1. Design-Primer an die gewünschten V 16 s rRNA Regionen gezielt zu verstärken.
  2. Analysieren Sie Primer mit Sonde Match aus der ribosomalen Datenbankprojekt19, um die ungefähre Trefferrate für verschiedene Stämme zu bestimmen.
    Hinweis: V1-V3 Regionen veröffentlicht die aktuelle Studie verwendet Primer Bosshard vorwärts20, die auf Position 8 in der V1-Region und 533 umgekehrte21, die an Position 533 innerhalb der V3-Region bindet binden. Grundierungen müssen Überhang Adapter Sequenzen für die Indizierung enthalten.
  3. Beim Entwerfen von Grundierungen sind Adapter-Sequenzen an den 5'-enden jeweils Fibel für 16 s Metagenomik Sequenzierung Bibliothek Vorbereitung22 (Tabelle 3) empfohlen.
  4. Diese große Primer mit Patrone Reinigung zu synthetisieren. Ausgetrocknete Primer wiederherzustellen und eine PCR arbeiten Lager 1 μM in 10 mM Tris, pH 8,5 zu verdünnen.

6. Amplikons PCR V Region(en) mit Überhang Adapter Sequenzen verstärken Anhang 22

  1. Einrichten der Amplifikate PCR Reaktion Mischung wie in Tabelle 4beschrieben.
  2. Platzieren Sie eine klare PCR Platte Klebeplombe auf dem Teller und führen Sie der Amplifikate PCR mit den Parametern in Tabelle 5.
  3. (Optional) Führen Amplikons PCR-Produkte auf einem Agarosegel oder eine hohe Empfindlichkeit DNA-Test, die quantitative Messung der Amplifikate Größe ermöglicht (siehe Tabelle der Materialien).
    Hinweis: Die Größe der Amplifikate aus dieser Studie beträgt 550 bp(Abbildung 3).

(7) PCR Bereinigung mit magnetischen Beads 22

  1. Zentrifugieren der Amplifikate PCR Platte schnell bei 1.000 x g für 1 min um Kondensation zu sammeln.
    Hinweis: PCR-Röhrchen Streifen können anstelle von PCR-Platten verwendet werden, um Kontamination zu minimieren. Verwerfen Sie Rohr Deckel und nie wieder verwenden.
  2. Wirbel der magnetischen Beads zu gleichmäßig verteilen sie, und fügen Sie 20 μL der magnetischen Perlen zu jeder PCR-Amplifikate gut, dann pipette das gesamte Volumen nach oben und unten langsam 10 Mal.
  3. Inkubieren Sie bei RT 5 min. Platz die PCR-Platte auf einem Magnetstativ für 2 min bis magnetische Beads gesammelt werden und der Überstand klar ist. Entfernen und entsorgen des Überstands.
  4. Wash-Perlen mit 200 μL frisch 80 % Ethanol während die PCR-Platte auf die magnetische stehen und inkubieren Sie für 30 s bei RT auf dem magnetischen Stand. Entfernen Sie vorsichtig den überstand.
  5. Wiederholen Sie die Wäsche ein zweites Mal. Verwenden Sie nun eine feine Pipettenspitze, entfernen alle verbleibenden Ethanol aus den Vertiefungen und Luft für 10 min trocknen lassen.
  6. Die PCR-Platte aus dem Magnetstativ entfernen und Hinzufügen von 52,5 μl 10 mM Tris pH 8,5 in jede Vertiefung. Pipette und unten 10 Mal aussetzen Perlen und in 2 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  7. Übertragen Sie die PCR-Platte auf Magnetstativ magnetische Beads zu sammeln und 50 μl des Überstands auf eine saubere PCR-Platte übertragen. Eine klare PCR Platte Klebeplombe auf die Teller legen und bei-20 ° c bis zu einer Woche aufbewahren.

8. Vorbereitung einer Platte Regelung für PCR-Index

Hinweis: Um eine V1-V3-Bibliothek zu generieren, eine zweite PCR wurde durchgeführt mit einem Index kit (siehe Tabelle der Materialien). Eine Indizierung Standardschema wurde verwendet, um eine einzigartige dual Index Kombinationen für jede Probe (Abbildung 3B und 23).

  1. Sicherzustellen, dass jede Probe eine einzigartige Kombination aus 2 Index Primer hat (d.h., dual Indizierung).

9. führen Sie Index PCR fügen Sie Barcodes auf die Adapter-Sequenzen wie beschrieben 22 .

  1. Übertragen Sie 2,5 μl des PCR-Amplifikate (saubere Amplifikate) in eine neue 96-well-Platte und Ort in einem Index Platte Vorrichtung zur Unterstützung bei der Indizierung.
  2. Ordnen Sie den Index 1 und index 2 Primer wie im Beispiel der vorbereiteten Platte Grafik (Abbildung 3B).
    Hinweis: Visuelle Hinweise dienen der um Grundierung Verwechslungen zu vermeiden: Index 2 Grundierung Röhren sollten haben weiße Mützen und klare Lösung, während Index 1 Grundierung Röhren orange Kappen und gelbe Lösung haben sollte.
  3. Montieren Sie den Index PCR Mix Reaktion, wie in Tabelle 6beschrieben. Mischen Sie, indem Sie nach oben und unten 10 Mal pipettieren. Mit einer klaren PCR Platte Klebeplombe abdecken und sammle 1.000 x g bei Raumtemperatur für 1 min zentrifugieren.
  4. Führen Sie den Index PCR unter Verwendung der Parameter in der Tabelle 7.

10. abschließende PCR Bibliothek reinigen

Hinweis: Diese PCR-Bereinigung ist identisch mit Schritt 7 oben und nutzt magnetische Beads, PCR Clean-Up des Indexes PCR22durchzuführen.

  1. Zentrifugieren Sie die PCR-Platte aus Schritt 10 schnell bei 1.000 x g für 1 min um Kondensation zu sammeln.
  2. Wirbel der magnetischen Beads zu gleichmäßig verteilen sie, und fügen Sie dann 20 μL der magnetischen Perlen zu jeder PCR-Amplifikate gut, dann pipette das gesamte Volumen nach oben und unten langsam 10 Mal zu mischen.
  3. 5 min bei RT inkubieren.
  4. Ort PCR Platte auf einem Magnetstativ für 2 min bis magnetische Beads gesammelt und überstand sind ist klar. Entfernen und entsorgen des Überstands.
  5. Wash-Perlen mit 200 μL frisch 80 % Ethanol während die PCR-Platte auf die magnetische stehen und inkubieren Sie für 30 s bei Raumtemperatur auf dem magnetischen Stand. Entfernen Sie vorsichtig den überstand.
  6. Wiederholen Sie die Wäsche ein zweites Mal.
  7. Verwenden Sie nach der zweiten Wäsche eine feine Pipettenspitze, entfernen alle verbleibenden Ethanol aus den Vertiefungen und Luft für 10 min trocknen lassen.
  8. Die PCR-Platte aus dem Magnetstativ entfernen und Hinzufügen von 52,5 μl 10 mM Tris pH 8,5 in jede Vertiefung. Pipette und unten 10 Mal aussetzen Perlen und in 2 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  9. Übertragen Sie die PCR-Platte auf Magnetstativ magnetische Beads zu sammeln und 50 μl des Überstands auf eine saubere PCR-Platte übertragen. Eine klare PCR Platte Klebeplombe auf die Teller legen und bei-20 ° c bis zu einer Woche aufbewahren.
  10. (Optional) Führen Sie Index-PCR-Produkte auf einem Agarosegel oder eine hohe Empfindlichkeit DNA-Test, die quantitative Messung der Amplifikate Größe ermöglicht (siehe Tabelle der Materialien).
    Hinweis: Die endgültige indizierten Bibliotheksgröße aus dieser Studie wurde 668 bp (Abbildung 3C-D).

11. zu quantifizieren Sie, normalisieren Sie und bündeln Sie die indizierten Bibliotheken für die Sequenzierung

  1. Bestimmen Sie die DNA-Konzentration von jeder Probe mit einem Fluorometer und ein DsDNA fluoreszierende Assay Kit (siehe Tabelle der Materialien).
    1. Bereiten Sie eine 1: 200-Verdünnung der Probe (1 µL jeder Probe in 199 µL DsDNA master-Mix, der Puffer und Reagenz enthält) für jede der indizierten Proben und Standards (190 µL DsDNA-master-Mix und 10 µL Standard). Analysieren Sie auf einem Fluorometer mit DsDNA-Einstellung.
  2. Im Anschluss an die DNA-Konzentration-Berechnung normalisieren Sie die Bibliotheken durch die Berechnung der durchschnittlichen Bibliotheksgröße. Dazu summieren Adapter Längen, Index Längen und V Amplikons Größe von Grundierungen und anzeigen Produkte von Agarosegel, um sicherzugehen, dass die tatsächliche Größe ist ähnlich wie die berechnete Größe (sieheAbbildung 3C, 22).
    1. Alternativ nutzen Sie eine hohe Empfindlichkeit DNA-Test, die quantitative Messung des DNA-Integrität, Amplifikate Größe und Konzentration (Table of Materials, Abbildung 3D) ermöglicht.
      Hinweis: In dieser Studie wurde die durchschnittliche Bibliotheksgröße berechnet auf Zusammenfassung Adapter Längen, Index Längen und V1-V3 Amplikons Größe von Primern. Die durchschnittliche Größe war 668 bp.
    2. Konzentrationen der Proben werden mit Hilfe der Formel in Tabelle 8normalisiert.
  3. Verdünnen Sie Proben zu 4 nM und Pool 5 μL jeder 4-nM-Probe in ein einzelnes Rohr für die Sequenzierung.

12. Sequenz der Bibliothek mit einem Next Generation Sequencing-System und die Daten analysieren

  1. Reihenfolge der Bibliothek.
    Hinweis: Für diese Studie durchgeführt der University of Utah hohen Durchsatz Genomics Core Bibliothek Denaturierung und Probe-Sequenzierung (wie beschrieben in 6,22).
  2. Die Daten zu analysieren.
    Hinweis: Um Daten von Mischproben zu trennen, wurden Index liest identifiziert und getrennt (siehe 22).
  3. Generieren Sie FASTQ Dateien zu und nutzen Sie dies für anschließende Datenanalyse.

13. sequenzierten Datenanalyse aus der 16 s Amplikons Bibliothek

Hinweis: Dieser Schritt wird ausgeführt, wie im Bice Et al.beschrieben., 20176.

  1. Installieren Sie frei verfügbare Daten-Analyse-Tools (siehe Tabelle der Materialien; 24).
  2. Montieren Sie demultiplexed Fastq Dateien aus den sequenzierten Daten (wie beschrieben in25,26). Entsorgen Sie alle unmontiert Sequenzen.
  3. Analysen Sie nach einer de Novo offenen taxonomischen Einheit (OTU) Kommissionierung Protokoll (wie beschrieben in 27).
    1. Bin Sequenzen in einer einzigen Fastq-Datei von SampleID und Gruppe-Sequenzen mit 97 % oder größere Ähnlichkeit in OTUs, wie in 28beschrieben. Richten Sie repräsentative Sequenzen von Core set mit minimalen Sequenz Länge von 150 und 75 % Prozent Identität29,30. Weisen Sie Taxonomie als beschrieben28.
      Hinweis: Proben können klassifiziert und analysiert31, gefolgt von taxonomische Zuordnung und OTU Tabelle Bau32.
    2. Erstellen Sie eine Mapping-Datei, die angibt, beschreibende Namen und Eigenschaften der Proben zu verbinden Probenidentifikation und validieren die Mapping-Datei33,34.
    3. Machen Sie eine OTU-Netzwerk, die OTUs links zu Probenbeschreibungen mit einer Mapping-Datei35.
    4. Berechnen Sie durch Zusammenfassen von Taxa durch Grundstücke36Taxonomie Zusammenfassungen in Bezug auf die relative Häufigkeit.
    5. Erkunden Sie alpha-Diversität Proben bei einheitlichen Sequenzierung Tiefe zu Proben. Definieren Sie die entsprechende Tiefe für alpha-Diversität, fassen Sie insgesamt zählt beobachtet in jeder Probe mithilfe des Biom zusammenfassen-Table-Befehls, wie in 37beschrieben.

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Ergebnisse

Mehrere Studien haben gezeigt, dass die Praxis des Geist-Körper-Medizin Gesundheit verbessert. Ebenso verbessert Umweltanreicherung bei Mäusen, einschließlich verbesserte Lebensdauer und Tumor Wunde Reparatur6Ergebnisse. Daher wurde eine EE-Verfahren entwickelt, mit dem Ziel der Bestimmung der Rolle der Mikrobiota in diesem Phänotyp beim ersten Normalisierung Microbiome vor Einleitung des Experiments (Abbildung 1). Wichtig ist, alle Zu...

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Diskussion

Dieses Verfahren ermöglicht die Analyse der Mikrobiota isoliert vom Hocker nach Umweltanreicherung Normal oder Tumor mit Tieren. Da das große Experimente die Zucht sind um viele Tiere unterschiedlichen Geschlechts und Genotypen zu erhalten einbeziehen, Normalisierung der Microbiome zwischen Tieren vor Beginn des Experiments ist wichtig im Zusammenhang mit nicht-EE zu vermeiden Auswirkungen auf Microbiome biologische Vielfalt.

Aus Gründen der Kohärenz zwischen NE und EE Bedingungen wird Zuchtpr...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

Danksagungen

Wir danken B. Dalley in der University of Utah Genomik-Kern für Bibliothek Sequenzierung und K. Boucher in der University of Utah Biostatistik-Kern für statistische Beratung und Zugang zu diesen technischen Kerne vom National Cancer Institute Award P30 CA042014 unterstützt. Das beschriebene Projekt wurde von der National Cancer Institut Zuschüsse P01 CA073992 und K01 CA128891 und Huntsman Cancer Foundation unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Teklad Diets/Harlan Labs ChowHarlan Labs3980XStandard bestrahltes Chow, formuliert von Dr. Mario Capecchi in Zusammenarbeit mit Harlan Labs.
Cell-Sorb Plus EinstreuFangman Specialties82010Autoklav vor dem Gebrauch.
AIMS Tätowiersystem für NeugeboreneAIMSNEO-9https://animalid.com/neonate-rodent-tattoo-identification/32. Andere Tattoo-Systeme und -Tinten in Tierqualität können mit ähnlichen Ergebnissen verwendet werden, einschließlich des Aramis Micro Tattoo Kits.
Zyfone One Cage 2100 AllerZone Maus Mikro-Isolator-System Komplett mit Käfig, AllerZone-Filteraufsatz und modularem FutterabgabesystemLaborprodukte82120ZFJeder EE-Käfig benötigt je einen aus dem Katalog # 82120ZF, 82100ZF und 82101ZF sowie zwei von 82109ZF. Essen ist nur auf einer Seite.
Zyfone One Cage 2100 Gerät zur Anreicherung der LebensspanneLaborprodukte82109ZFJeder EE-Käfig benötigt je einen aus dem Katalog # 82120ZF, 82100ZF und 82101ZF sowie zwei von 82109ZF. Essen ist nur auf einer Seite.
Zyfone One Cage 2100 Käfig 13-7/8" Länge x 19-1/16" Breite x 7-3/4" TiefeLaborprodukte82100ZFJeder EE-Käfig benötigt einen von jedem Katalog # 82120ZF, 82100ZF und 82101ZF sowie zwei von 82109ZF. Essen ist nur auf einer Seite.
Zyfone One Cage 2100 AllerZone Micro-Isolator Filter topLab Products82101ZFJeder EE-Käfig benötigt je einen aus dem Katalog # 82120ZF, 82100ZF und 82101ZF sowie zwei von 82109ZF. Essen ist nur auf einer Seite.
TunnelBio-ServK3323 oder K3332Verbinden Sie die Käfige miteinander und verwenden Sie sie zur Anreicherung
Tücke zum Verbinden des Tunnels mitden Käfigen Hergestellt von der University of Utah Machine Shopn/aStellen Sie sicher, dass das Material kaufest und autoklavierbar
ist Fast-Track-RadBio-ServK3250 oder K3251Verwendung mit Maus-Iglu und Boden
Maus-IgluBio-ServK3328, K3570 oder K3327Verwendung mit Fast-Track Rad und Boden
Maus Iglu BodenBio-ServK3244Verwendung mit Maus Iglu und Fast-Track
Maus HütteBio-ServK3272, K3102 oder K3271
KrabbelballBio-ServK3330 oder K3329
Bio-HütteBio-ServK3352Zellstoffhütte zum Schutz und Vernisten
Klebefolie VWR60941-072Zur vorübergehenden Abdeckung eines Bohrlochs in einem großen Käfig, um ein Entweichen von Mäusen zu verhindern
Belüftetes Laminar-Flow-GestellTechniplastBio-C36Der Schrank, den wir in dieser Studie verwendet haben, wird derzeit nicht geliefert. Der Bio-C36 ist sehr ähnlich.
1,5 mL Microfuge Tube - RNAse und DNAse freiJeder Lieferant
QIAamp DNA Stool MiniKitQiagen51504Dieses Kit enthält Reagenzien für 50 DNA-Präparate. Stuhllysepuffer = ASL; Guanidiniumchlorid-Lysepuffer = AL; Waschen Sie Puffer 1 mit Guanidiniumchlorid = AW1; Waschpuffer 2 = AW2; Elutionspuffer mit EDTA=AE
Wasserbad (erhitzbar auf 95)Jeder AnbieterFür die 94-Grad-Inkubation von Stuhlproben zur Lyse von Zellen.
Wasserbad (in der Lage, auf 70 Grad zu erhitzen)Jeder LieferantFür die 70-Grad-Inkubation von Stuhlproben 
Ethanol (200 proof)Sigma AldrichE7023
Fluorometer: QubitThermoFisherScientific Q33216
Qubit dsDNA Broad Range Assay KitThermoFisherScientific Q32850
EB Puffer oder 10 mM Tris pH 8,5Qiagen19086
Experimentspezifische PrimerJeder Lieferant
PCR-Qualität WasserJeder Lieferant
2X KAPA HiFi HotStart Ready Mix Kapa BiosystemsKK2601für die Amplikon-Amplifikation (1,25 mL ermöglicht 100 rxns).
Agarose zum Ausführen von DiagnosegelenJeder Lieferant
TapeStation High Sensitivity D1000 Screen Tape TraceAgilent5067-5583TapeStation oder Bioanalysator-Instrumente sind in institutionellen Genomik-Kernen üblich, um die Bibliotheksqualität zu analysieren. Alternativ kann ein Bioanalyzer DNA1000 Chip (Agilent, 5067-1504) verwendet werden.
Agencourt AMPure XP Magnetische PerlenBeckman CoulterA63880Magentische Kügelchen Für die PCR-Reinigung - 5 ml reinigen 250 PCR-Reaktionen
MagnetständerLife TechnologiesAM10027
Library Preparation GuideIlluminaIllumina. 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation: Vorbereitung von 16S ribosomalen RNA-Genamplikons für das Illumina MiSeq System. https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/16s/16s-metagenomic-library-prep-guide-15044223-b.pdf.
Einzigartige Dual-IndexierungIllumina Illumina Experiment Manager SoftwareFrei verfügbar bei: https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/experiment_manager/downloads.html
Nextera XT 96 Index KitIlluminaFC-131-1002Wird zum Hinzufügen von Barcodes zu Amplikons
verwendet MicroAmp Optical 96-Well-ReaktionsplatteApplied Biosystems/ThermoFisherN8010560
TruSeq Index Plate FixtureIlluminaFC-130-1005
Selbstklebende klare PlattendichtungApplied Biosystems / ThermoFisher4360954Applied Biosystems / ThermoFisher Microamp Klebefilm
Sequenzierung durch MiSeq mit v3 Reagenzien und dualen 300 bp ReadsIlluminaMS-102-3003
PhiX Control KitIlluminaFC-110-3001
Proteinase K (600 mAU/ml)Qiagen19131Entspricht 20 mg/ml Proteinase K. Im Lieferumfang des QiaAmp-Kits
enthalten Datenanalyse-ToolsQiimeQIIME-Software ToolsDie Installation kann je nach System unterschiedlich sein. Auf der QIIME-Website werden mehrere Optionen beschrieben (http://qiime.org/install/install.html). Für diese Studie wurde das MacQIIME-Softwarepaket 1.9.1 verwendet (kompiliert von Werner Lab, SUNY, http://www.wernerlab.org/software/macqiime
Schritt 13.2).QiimeFastQ Join-Methode ( http://code.google.com/p/ea-utils  ).   Für diese Studie wurden mehrere paarige Enden http://qiime.org/scripts/multiple_join_paired_ends.html verwendet. Aronesty, E. ea-utils: Befehlszeilenwerkzeuge zur Verarbeitung biologischer Sequenzierungsdaten. Expressionsanalyse, Durham, NC. (2011).
Schritt 13.3.QiimeDe-Novo OTU Kommissionierprotokollhttp://qiime.org/scripts/pick_de_novo_otus.html.
Schritt 13.3.1.Öffnen Sie taxonomische Einheiten (OTUs) mit UclustEdgar, R.C. Suchen Sie und clustern Sie Größenordnungen schneller als BLAST. Bioinformatik. 26 (19), 2460-2461, doi:10.1093/bioinformatics/btq461 (2010).
Schritt 13.3.1.PynastPynastCaporaso, J.G. et al. PyNAST: ein flexibles Werkzeug zum Ausrichten von Sequenzen an einem Template-Alignment. Bioinformatik. 26 (2), 266-267, doi:10.1093/bioinformatics/btp636 (2010). 
Schritt 13.3.1.PynastPynast_GreengenesDeSantis, T.Z. et al. Greengenes, eine Chimären-geprüfte 16S rRNA-Gendatenbank und Workbench, die mit ARB kompatibel ist. Appl Environ Microbiol. 72 (7), 5069-5072, doi:10.1128/AEM.03006-05 (2006). In dieser Studie wurde Greengenes Version 13_8
13.3.1 verwendet. Hinweis: QiimeMultiple Split Librarieshttp://qiime.org/scripts/multiple_split_libraries_fastq.html.
13.3.1. Anmerkung: QiimePick de novo OTUs Skripthttp://qiime.org/scripts/pick_de_novo_otus.html 
Schritt 13.2.2.QiimeErstellen Sie eine Zuordnungsdateihttp://qiime.org/documentation/file_formats.html.
Schritt 13.2.2.QiimeValidieren Sie eine Zuordnungsdateihttp://qiime.org/scripts/validate_mapping_file.html.
Schritt 13.3.3.QiimeVerknüpfen Sie die OTU mit der Beispielbeschreibung zur Zuordnungsdateihttp://qiime.org/scripts/make_otu_network.html.
Schritt 13.3.4.QiimeFassen Sie Taxa durch Diagrammehttp://qiime.org/scripts/summarize_taxa_through_plots.html.
Schritt 13.3.5.QiimeBiome Summarize Tabellehttp://biom-format.org/documentation/summarizing_biom_tables.html  In dieser Studie wurden alle Proben auf 20.000 OTUs verdünnt, gefolgt von einer Analyse mit Hilfe eines Alpha-Verdünnungsskripts in QIIME.

Referenzen

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