Method Article

Isolierung-Protokoll der Maus Monocyte-abgeleitete Dendritische Zellen und ihre anschließende In-vitro- Aktivierung mit Tumor Immunkomplexe

DOI:

10.3791/57188

⸱

May 31st, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, Sackler School of Medicine, Tel-Aviv University, 2Department of Pathology, School of Medicine, Stanford University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Monocyte abgeleitet DC (MoDC) spürt geringe Mengen an Gefahr-assoziierter Moleküle und sind daher leicht grundiert. Wir bieten ein detailliertes Protokoll für die Isolierung von MoDC aus Blut und Tumoren und ihre Aktivierung mit Immunkomplexen wobei wichtige Vorsichtsmaßnahmen, die berücksichtigt werden sollten, um ihre vorzeitige Aktivierung zu vermeiden.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dendritische Zellen (DC) sind heterogene Zell-Populationen, die sich in ihrer Zellmembran Marker, Migrationsmuster und Verteilung, und in ihrer Antigenpräsentation und T-Zell-Aktivierung-Kapazitäten zu unterscheiden. Da die meisten Impfungen der experimentellen Tumormodellen Millionen von DC benötigen, sind sie weitgehend isoliert aus dem Knochenmark oder Milz. Diese DC deutlich unterscheiden sich jedoch von Blut und Tumor DC in ihren Antworten zu Immunkomplexe (IC) und vermutlich andere Lektin Syk-gekoppelten Rezeptoren. Wichtig ist, angesichts der Sensibilität der DC in Gefahr-assoziierter Moleküle, das Vorhandensein von Endotoxinen oder Antikörper, die Crosslink-Aktivierung-Rezeptoren in der Isolierung eines Schritte könnte führen die Grundierung von DC und beeinträchtigen somit die Parameter oder zumindest die Dosierung, erforderlich, um sie zu aktivieren. Daher beschreiben wir hier ein detailliertes Protokoll zur Isolierung von MoDC aus Blut und Tumoren unter Vermeidung der vorzeitigen Aktivierungs. Darüber hinaus ist ein Protokoll für MoDC Aktivierung mit Tumor IC und ihre späteren Analysen bereitgestellt.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Seit ihrer Entdeckung wurden die Dendritische Zellen (DC) ein Schwerpunkt der umfangreichen Forschung aufgrund ihrer einzigartigen Fähigkeit, T-Zell-Differenzierung1verzerren. In den letzten Jahrzehnten hat eine umfangreiche Forschungsarbeit versucht, die verschiedenen DC-Subsets und ihre Funktion während der Tumorprogression und Immunität 2definieren. DCs bestehen aus heterogenen Zell-Populationen, die in ihre Mustererkennung Rezeptoren, Gewebeverteilung, voneinander unterscheiden und wandernden und Antigen Präsentation Fähigkeiten3,4,5. Im Vergleich zu anderen DC-Teilmengen, Monocyte abgeleitet DC (MoDC) sind weit häufiger in Tumoren und können leicht von zirkulierenden erzeugt werden oder Tumor infiltrieren Monozyten6,7. Viele klinische Studien, die versuchen, ihre relative Prävalenz nutzen basieren daher auf in Vivo und ex Vivo Manipulation von autologen MoDC um T-Zell Immunität 8,9zu entlocken.

In ähnlicher Weise, DC-basierte Impfung von experimentellen Tumormodellen erfordert 2-3 serielle Injektionen, 5-7 Tage auseinander, von 1-2 x 106 aktivierte DC mit Tumorantigenen gepulst. Daher, um diese große Anzahl von DC zu erreichen, die meisten Studien an Mäusen haben in erster Linie verwendet MoDC kultiviert aus dem Knochenmark (BM) Vorstufen in GM-CSF für 7-9 Tage (IL-4 ist nicht erforderlich, in die Maus Einstellung)10,11. Dennoch hat angesichts dieser GM-CSF-Knockout Mäuse haben insgesamt normale DC Abteil 12,13, und die gemischte Bevölkerung aus dieser Kultur gewonnen14 die physiologische Relevanz dieser DC infrage gestellt worden.

Alternativ kann DC von milzzellen routinemäßig isoliert sein. DC umfassen jedoch nur etwa 0,3-0,8 % der gesamten milzzellen (was ca. 7 x 105 DC/Milz), und dieser Zellen, nur CD103+ DC und MoDC können zurück zu den lymphatischen Organen migrieren. Da MoDCs etwa 10-15 % der Milz DC Bevölkerung15,16 umfassen, liefern die meisten Isolierung Protokolle ca. 1 x 105 MoDC pro Milz. Ausbau der MoDC kann erreicht werden, durch die Injektion von transfizierten B16 Zellen, die GM-CSF, was zu einem 100-fold Anstieg in Milz MoDC17absondern. Die Verwendung von MoDC für die Entwicklung von DC Impfstoffe ist jedoch begrenzt, da dieses Verfahren bei Menschen und den erzielten erfolgen kann nicht MoDC sind bereits in hohem Maße aktiviert.

Eine weitere Herausforderung für die Entwicklung von effektiven DC Impfstoffe gegen autologe Krebszellen umfasst neben Erlangung ausreichender Anzahl der DC, den Mangel an ausreichend Gefahrensignale in der Tumor-Einstellung DC voll zu aktivieren. Induktion von co-stimulatory Signalen erfolgt in der Regel durch Aktivierung von Mustererkennung Rezeptoren (PRR), oder c-Art Lectin Signalisierung Wege18,19,20,21. Ein weiterer Ansatz zur Aktivierung DC nutzt ihre Fähigkeit zu nehmen Antigene durch Interaktionen mit Oberfläche Fcγ Rezeptoren (FcγR). In der Tat eine Reihe von wichtigen Handschriften haben gezeigt, dass die Injektion von MoDC aus BM Vorstufen aktiviert mit Tumor-IgG IC Tumorwachstum bei prophylaktischen Einstellungen verhindern können, und führt zur Beseitigung der etablierten Tumoren22,23 .

In zwei Publikationen entdeckt Carmi Et Al. , dass im Gegensatz zu BMDC und Milz DC, MoDC aus dem Blut und Tumoren auf IgG IC ohne zusätzliche Reize reagieren kann. Dies erwies sich durch die Anwesenheit der hohen intrazellulären Tyrosin-Phosphatasen Regulierung Signal24,25FcγR. Definieren Sie einen kritischen Kontrollpunkt in DC, versehen diese Arbeit einen wichtigen Einblick in die Anforderungen an erfolgreiche DC-basierte Impfung. Die Voraussetzung für zusätzliche Reize ermöglichen FcγR Signal- und vermutlich Signalisierung von anderen Lektin-Rezeptoren, die unter Verwendung einer ähnlichen Phosphorylierung Kaskade, unterstreicht damit die Notwendigkeit für die Grundierung von DC während ihrer Isolation zu vermeiden.

Daher dieses Protokoll beschreibt die Isolierung des MoDC von Blut und Tumoren, die sich deutlich von BM und Milz DC unterscheiden, und vorsorgenormen während des Prozesses eine Überlegung.

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Protocol

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Die folgenden Protokolle beziehen sich auf die Isolierung der Maus MoDC, noch für andere DC Teilmengen Zellen, sowie gelten die allgemeinen Grundsätze. 12 - 16 Wochen alten C57Bl/6j Mäuse wurden in ein American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care – akkreditiert Tierhaus beibehalten. Alle Protokolle wurden von der Stanford University und Tel-Aviv Universität institutionelle Animal Care und Use Committee genehmigt.

1. Isolierung von Tumor verbundenen Monocyte abgeleitet DC

  1. Entfernen Sie in einer Laminar-Flow-Haube Tumore von CO2 eingeschläfert Mäuse und Tumoren in RPMI Medium ohne fetalen bovine Serum (FBS).
    Hinweis: Es wird empfohlen, um die Mäuse zu rasieren und sprühen sie mit 70 % Ethanol vor dem Entfernen der Tumoren, um mögliche Verunreinigungen aus dem Fell zu minimieren. Stellen Sie sicher, dass der Tumor 25-40 mm2 nicht überschreitet, da größere Tumoren weniger DC, die tendenziell zerbrechlich und anfällig haben für Zelltod unterziehen. Wenn größere Anzahlen von DC benötigt werden, kann jede Maus mit Tumoren Zellen an mehreren Standorten injiziert werden.
  2. Hacken Sie unter einer sterilen laminar Haube die Tumoren mit Operation Schere in kleine Stücke (ca. 1 x 1 mm2).
    1. Fügen Sie alle Tumor-Fragmente aus einem einzigen Mausklick in ein 30 mL sterile flach-Boden Rohr mit magnetischen rühren Bars, enthält 5 mL Hank es ausgewogen Salzlösung (HBSS), 2 mg/mL Kollagenase IV und 0,01 mg/mL DNase ich.
      Achtung: Myeloische Zellen produzieren Energie durch Glykosylierung, auch unter Steady-State. Daher führt nur Verwendung-Medien, die Glukose (zum Beispiel HBSS RPMI und DMEM), als Glukose Hunger für weniger als 10-15 min enthält im Zelltod und Apoptose innerhalb 24 Std. Nutzung nur eine geringe Endotoxin Kollagenase IV, als Kollagenase von gram-positiven produziert wird Bakterien (Clostridium Histolyticum).
  3. Bei ca. 200-400 u/min in einem Inkubator 37 oC mit einem Magnetrührer für 20-30 min. umrühren.
  4. 5 mL komplette Medien hinzufügen und kräftig wieder auszusetzen.
  5. Filtern Sie Zellen durch ein 70 µm Zelle Sieb. Zentrifugieren Sie bei 4 oC 400 Rcf für ca. 5-10 min zu die Zellen zu Pellets.
    Achtung: Versuchen Sie nicht, die Zellen direkt nach enzymatische Verdauung, da manche Tumoren nekrotische sind und relativ große Mengen an zellenrückstand oder extrazelluläre Matrix enthalten zu isolieren. Tragen Sie Zellen auf 15 % Dichte Gradienten Medium, nur die Zellen zu erhalten.
  6. Aussetzen Sie, 9 mL Dichte Gradienten Medium mit 1 mL 10 X PBS, Osmolalität anzupassen und zu 100 % Percoll-Stammlösung zu erhalten. Mix 1,5 mL Dichte Gradienten Medium Lösung mit 8,5 mL HBSS auf Lager und mischen Sie es kräftig mit Pellet-Zelle Tumor abgeleitet. Sanft Schicht 2 mL DMEM auf der Oberseite 15 % Dichte Gradienten Medium und Zentrifuge bei 400 Rcf für 20 min bei Raumtemperatur. Verwerfen Sie die Überstände, wie die Zellen einen Pellet am Boden des Röhrchens bilden werden.
    1. Waschen Sie die gebeizte Zellen zweimal durch Aussetzung sie erneut in 10 mL HBSS, enthält 2 % FBS, 1 % Penicillin/Streptomycin, und 10 mM EDTA (Isolation Puffer) und Zentrifuge bei 4 oC 400 Rcf für 5-10 min um die Zellen zu Pellets.
    2. Anzahl Zellen auf einem Hemocytometer verwenden Trypan blau unter einem Lichtmikroskop.
  7. Wieder auszusetzen, 1 x 108 Zellen in 1 mL Isolierung Puffern und inkubieren sie bei 4 oC mit 30 μl CD11b+ konjugiert magnetische Beads für 15 Minuten.
    Achtung: Vermeiden Sie die Verwendung CD11c konjugiert Perlen, wie dies die DC aktiviert und Zelltod zu induzieren. Versuchen Sie nicht, FcγRII und FcγRIII mit Anti-CD16/32 Antikörper zu blockieren. Blockieren Antikörper verbinden FcγR und verursachen starke Phosphorylierung von MAP-Kinasen und prime der DC.
    1. Entfernen Sie die überschüssige ungebundenen Perlen, indem 9 mL Isolierung Puffer und Zentrifuge Zellen auf 400 Rcf für 5-10 min bei 4oC.
  8. Aspirieren Sie überstand und auszusetzen Sie Zellen in 1 mL Isolierung Puffer wieder. Die Zellen auf einer vorgewaschen magnetische Spalte anwenden. Waschen Sie die Spalte zweimal mit 3 mL Isolierung Puffer.
    1. Entfernen Sie die Spalte aus der Magnet. Pipette 6 mL Isolierung Puffer auf die Säule und die magnetisch-markierten Zellen in einem sterilen sammelröhrchen durch Drücken des Kolbens durchspülen. Zentrifuge Zellen bei 400 Rcf für 5-10 min bei 4 oC.
    2. Wieder aussetzen Zellen bei 100 μL pro 1 x 107 Zellen und Flecken mit den folgenden Fluorophor-konjugierten Antikörpern: aus negativen (TCRb, Siglec-F, B220, CD19, FceRI und Ly6G), ARBEITSPLATZAUSSTATTUNG, Ly - 6 C.
  9. Zellen nach Anspritzung die kleinen Zellen, mit Side Scatter (SSC) Sortieren und forward Scatter (FSC) und Kultur im kompletten Medium mit 5 ng/mL GM-CSF ergänzt. 1 Stunde bei 3 7 Zellen inkubieren oC um Makrophagen halten die Platte zu ermöglichen. Übertragen Sie anschließend die lose und nicht anhaftende Zellen in eine neue Kulturschale.
    Hinweis: Maus MoDC gelten als CD11b+/CD11c+/MHCIIHallo/Ly6Clo/Int 7,26,27. Ausdruck der Ly6C variieren erheblich zwischen Tumormodellen und bei einigen Modellen (z.B. amp) MoDCs fehlt ganz Ly6C Ausdruck. Alles in allem, eine 100 mm3 B16F10 Tumor in der Regel 5 x 104 DC, was in etwa 4-5 x 106 total Zellen enthält. Dieser Zellen 10-15 % sind Immunzellen und 8-10 % sind MoDC. Die DC-Zahl erhöhen kann erreicht werden, durch die Injektion von Mäusen mit Tumoren an mehreren Standorten. Art nur kleine SSC/FCS-Zellen, können als andere myeloischen Zellen Marker wie CD11c und Ly6C Ausdrücken.
    Optional: Art der Tumor infiltrieren Monocyte als kleine SSC/FSC-Zellen, die express Ly6CHallo und sind negativ für ARBEITSPLATZAUSSTATTUNG. Danach Kultur Monozyten in Vitro mit 50 ng/mL GM-CSF, DC zu erhalten.

2. Isolierung der Monocyte abgeleitet DC aus dem peripheren Blut

Hinweis: Da Reife MoDCs Maus im Blut relativ selten sind, bezieht sich das Protokoll unten auf ihre Ableitung in Vitro aus sortierten Monozyten.

  1. Um die Höhe der Monozyten im Blut erhöhen, Mäuse mit 4 % Isofluran zu betäuben und injizieren sie subkutan (s.c.) mit 1 μg von GM-CSF in 50 μl PBS.
  2. Nach 1-2 h Opfern Sie Mäuse mit CO2.
    Achtung: Opfere Mäuse nicht durch zervikale Dislokation, als innere Blutungen dadurch.
  3. Sofort nach Euthanization Sprühen Sie die Maus mit 70 % Ethanol und entfernen Sie die Haut, die das Herz mit Chirurgische Schere unter einer sterilen Laminar-Flow-Haube bedeckt. Reinigen Sie die Schere mit Ethanol und schneiden Sie den rechten Vorhof des Herzens. Spülen Sie langsam, das Herz durch den rechten Ventrikel mit 20 mM EDTA HBSS mit einem 10-mL-Spritze und Nadel 25 G.
    1. Sammeln Sie das Blut mit einer sterilen Spritze aus der Pleurahöhle in ein steriles Röhrchen mit Heparan Sulfat und EDTA. Weiterhin das Herz bis zur Leber und Lunge werden rosa oder weiß zu spülen.
  4. Blut auf eine Dichte Gradienten Fragenkomplexen Zentrifuge bei 400 Rcf bei Raumtemperatur für 15 min mit niedrigen Bremse auftragen.
    Achtung: Verwendung Endotoxin-freie Dichte Gradienten Medium (in der Regel weniger als 0,12 EU pro mL).
    1. Sammeln Sie MONONUKLEÄRE Zellen in einen neuen Schlauch. Waschen Sie die Zellen wieder aussetzen in 10 mL HBSS, enthält 2 % FBS, 1 % Penicillin/Streptomycin und 10 mM EDTA (Isolierung Puffer) und anschließend Zentrifugieren bei 4 oC 400 Rcf für ca. 5-10 min zu die Zellen zu Pellets.
      Achtung: Verwenden Sie nur Medien, die mindestens 1 g/L Glukose enthält.
  5. Auszusetzen Sie für CD11b positive Selektion 1 x 10-8 -Zellen in 1 mL Isolierung Puffer wieder und inkubieren sie 15 min mit 50 μL von CD11b konjugiert magnetischen Perlen an 4 oC.
    1. Waschen Sie überschüssige Perlen durch Hinzufügen von 9 mL Isolierung Puffer und Zentrifugieren bei 400 Rcf für 5-10 min bei 4 oC. Aspirat die Überstände und wieder auszusetzen Sie, die Zellen in 1 mL Isolierung Puffer. Die Zellen auf einer vorgewaschen magnetische Spalte nach Herstellerangaben auftragen.
    2. Entfernen Sie die Spalte aus der Magnet, pipette 6 mL Isolierung Puffer auf die Säule und spülen Sie die magnetisch-markierten Zellen in einem sterilen sammelröhrchen durch den Kolben drücken. Zentrifugieren Sie Zellen bei 400 Rcf für 5-10 min bei 4 oC. Wash der Spalte zweimal mit 3 mL Isolierung Puffer.
    3. Re Zellen auf 1 x 107 Zellen/100 μL Isolierung Puffer und Fleck mit den folgenden Fluorophor-konjugierten Antikörpern auszusetzen: 0,1 μg CD115 0,25 µg ARBEITSPLATZAUSSTATTUNG und 0,1 μg Ly-6 C/1 x 106 Zellen.
  6. Sortieren Sie Zellen nach Anspritzung auf klein Scatter (SSC) und small forward Scatter (FSC) Zellen.
    Hinweis: Maus entzündliche Monozyten sind in der Regel definiert als CD115+/ARBEITSPLATZAUSSTATTUNGlo/Neg/Ly6CHallound patrouillieren Monozyten werden definiert als CD115+/MHCIIlo/Neg/Ly6CNeg 4,5. In Fällen, wo keine Trennung zwischen den zwei Teilmengen erforderlich, insgesamt SSClo/FCSlo/CD115+/ARBEITSPLATZAUSSTATTUNGlo Zellen sortiert werden können. Naiv und Tumor-tragenden Mäusen enthalten ca. 5-8 x 104 MoDC pro 1 mL Blut und bis zu 4-5 x 105 MoDC folgende Injektion von GM-CSF. Von ihnen etwa 70 % sind entzündliche Monozyten und 30 % Monozyten patrouillieren.
  7. Die Zellen in einer Konzentration von 1 x 106 Zellen/mL in eine komplette Media ergänzt mit 20 ng/mL GM-CSF-Platte. Nach 1 Tag der nicht-Anhänger und lose adhärenten Zellen zum Übertragen einer neuen Platte und Kultur für weitere 4-5 Tage
    Achtung: DC Medien sollten nicht mit Pyruvat ergänzt werden.

3. Vorbereitung des Tumor-IgG Immunkomplexe

  1. Kultur-Tumorzellen in 75 cm2 Kultur Kolben bis 70 % Zusammenfluss in kompletten DMEM Medien.
    1. Fügen Sie 2 mL 0,25 % Trypsin/EDTA, Zellen aus Kultur-Kolben und Monitor Zellmorphologie unter einem Lichtmikroskop zu vermeiden übermäßige Trypsinization zu lösen.
    2. Hinzugeben Sie 8 mL komplette Nährmedien (pro 2 mL Trypsin) hemmen Trypsin-Verdauung und Zentrifugieren bei 4 oC, 400 Rcf für ca. 5-10 min zu die Zellen Pellets.
      Hinweis: Stellen Sie sicher, Tumorzellen für Mycoplasma mithilfe eines kommerziellen PCR-Kits zu überprüfen. Test auf das Vorhandensein von Gram-negativen Bakterien und Pilze Endotoxine Verwendung von Limulus Amebocyte Lysate (LAL) assay28). Serum muss durch 0,22 μM gefiltert und für die 9 Code of Federal Regulations-Viren getestet werden. Darüber hinaus testen Sie, Kultur, Medien und Seren durch Ablegen von 100-200 μL auf LB-Agar oder Bouillon und Kultur 2 Tage bei 37 oC.
    3. Wash Zellen wieder von Trypsin und Serum bleibt dadurch, dass sie wieder in 10 mL PBS und Zentrifuge bei 400 Rcf für 5-10 min. Überstands abzusaugen und die Wäsche 2 weitere Male zu wiederholen.
  2. Zellen in 1,8 % gepuffert Paraformaldehyd für 10 min bei Raumtemperatur zu beheben.
    1. Waschen Sie die Zellen dadurch, dass sie wieder in 10 mL PBS und Zentrifuge bei 4 oC 400 Rcf für 5-10 min.
    2. Zwei weitere Male waschen aspirat Überstände und wiederholen.
      Optional: Für Tumor-Aufnahme-Assays, können Zellen beschriftet werden durch Inkubation sie für 5 min bei 37 oC in PBS mit 1 μM Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester (CFSE-). CFSE wird dann mit kompletten Medien für 10 min in Eis abgeschreckt. Die Zellen sollten ausgiebig mit PBS-Puffer mit 2 % Serum, restliche Farbstoff zu entfernen gewaschen werden.
  3. Wieder auszusetzen Sie, Zellen in FACS Puffer (PBS ergänzt mit 2 % FCS + 5 mM EDTA) und 0,5 μg/mL Anti-CD16/32 um potentielle unspezifische Protein-Protein-Interaktionen zu blockieren. Platte in einer U-Form 96 Wells/Platte in einer Konzentration von 1 x 105 Zellen pro 100 μL.
    1. Fügen Sie verschiedene Verdünnungen des Tumor-bindenden Antikörpern von 5 μg - 5 ng/1 x 105 Zellen. Inkubieren Sie die Platte für 15-20 min auf Eis.
      Hinweis: IgG Antikörper aus dem Serum von naiven 20-24 Wochen alten weiblichen Mäusen auf Protein A-Säulen, wie beschrieben24isoliert wurden.
  4. Waschen Sie Zellen durch Hinzufügen von 150 μL der PBS und die Platte bei 4 oC 400 Rcf für 5-10 min zentrifugieren.
    1. Die Überstände zu verwerfen und die Wäsche zweimal wiederholen. Wieder aussetzen Sie Zellen in 100 μl-FACS-Puffer mit Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörper. Inkubieren Sie Platte auf dem Eis für 20 min.
    2. Waschen Sie Zellen durch Zugabe von 200 μl des FACS-Puffers zu und Zentrifugieren der Plattenrandes bei 400 Rcf für 5-10 min. die Überstände zu verwerfen und wiederholen Sie waschen.
    3. Analysieren Sie Tumor-Bindung durch Durchflusszytometrie und bestimmen Sie die minimale Konzentration erforderlich, um die Zellen zu beschichten.
      Hinweis: Antikörper, die nicht meine Fluoreszenzintensität (MFI) von gefärbten Tumorzellen durch mindestens das Fünffache Isotype Kontrolle erhöhen sollte nicht in nachfolgenden funktionellen Assays verwendet werden.

(4) Aktivierung von MoDC mit Tumor-IgG IC

  1. Tumorzellen mit minimalen IgG-Konzentration zu beschichten, wie in den Abschnitten 3.1 durch 3.4.3 beschrieben
    1. Ersetzen Sie eines Tages vor der Aktivierung MoDC mit Tumor IC, MoDC Kulturmedien, die GM-CSF enthält. Dazu sanft Aspirieren Sie die Medien und waschen Sie die Zellen einmal mit vorgewärmten komplette Nährmedien zu.
      Hinweis: Isolierte Reife Tumor-assoziierten MoDC sollten mindestens 2-3 h (oder sogar über Nacht) nach dem Sortieren in komplette Medien ohne GM-CSF und vor dem Aktivieren sie mit IC kultiviert werden.
    2. Für Tumor-Aufnahme-Analysen MoDC in einem Verhältnis von 1:5 (IC:MoDC) CFSE--markierten Tumors IC hinzu und 12-16 h in 1 mL der komplette Media pro 1 x 106 DC über Nacht inkubieren.
    3. Fügen Sie für FACS Analysen MoDC Aktivierung Experimente Tumor-IC im Verhältnis 1:1 (IC:MoDC hinzu) und inkubieren Sie über Nacht für 12-16 Uhr.
      Hinweis: Es wird dringend empfohlen eine Positivkontrolle gehören, in denen MoDC sind mit 1 μg/mL LPS oder anderen TLR-Agonisten stimuliert.
    4. Nach Übernachtung Aktivierung Aspirieren Sie die Überstände und waschen Zellen sanft dreimal mit Isolierung Puffer oder 10 mM EDTA HBSS.
    5. Um DC von der Platte lösen, brüten Sie Zellen für 2-3 min in 1 mL HBSS mit 10 mM EDTA, und lösen Sie Zellen durch kräftig pipettieren.
    6. Zentrifugieren Sie Zellen bei 400 Rcf und wieder auszusetzen Sie, 1 x 106 DC in 90 μl PBS ergänzt mit 2 % FCS, 5 mM EDTA (FACS-Puffer) und 0,5 μg Antikörper zu blockieren. Inkubieren Sie für 5-10 min auf Eis.
    7. Hinzufügen von 10 μL der Färbung Antikörper-Mischung zu den Zellen und inkubieren Sie für 15 min auf Eis.
    8. Zellen und Zentrifuge bei 4 oC 400 Rcf für 5-10 min 2 mL FACS Puffer hinzufügen.
  2. Wieder aussetzen Sie-Zellen in 200 μl FACS Puffer.
    1. Hinzufügen von 0,5 - 1 μg/mL DAPI 1 – 2 min. vor dem Ausführen der Proben, um tote Zellen von Analysen auszuschließen. Inkubieren Sie nicht übermäßig DAPI, da MoDC es innerhalb von 10-15 min dauern wird.

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Results

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Zunächst verglichen wir die Kapazität von Antikörpern aus naiven Phänomen und allogene Mäuse an Tumorzellen binden. Zu diesem Zweck wurden B16F10 und LMP Tumorzelllinien an Paraformaldehyd fixiert und ausgiebig gewaschen. B16F10 ist ein Melanom-Zelllinie, die ursprünglich von Lungenmetastasen bei C57Bl/6 Mäusen isoliert war. LMP ist ein Pankreas-Tumor-Zelle, die aus KrasG12D isoliert wurde / + LSL-Trp53R172H / + und Pdx-1-Cre Mäuse und wächst stetig in 129F1 Mäuse. Um IC zu erhalten, wurd...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Angesichts der großen Zahl von DC erforderlich für die Impfung Mäuse (ca. 2-4 x 106 DC pro Mausklick), die meisten von der Impfung Strategien bei Mäusen auf Isolierung der DC vom BM und Milz basieren, gefolgt von ihrer ex-Vivo -Aktivierung. Allerdings versucht, Tumor DC in Vivo, mit den gleichen Bedingungen zur Aktivierung der Milz und BM DC aktivieren, oft in der Herstellung von wirksamen Immunität unterlegen. In zwei weiteren Publikationen Carmi Et Al. habe festgestellt, dass Blut ...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle Autoren erklären sie kein Interessenkonflikt haben und, dass sie nichts preisgeben.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Ficoll-Paque PREMIUMGE-Healthcare17-5442-02
OptiPrepStemCell Technologies07820
CD45 MicroBeadsMiltenyi130-052-301
EasySep Monocyte IsolationKit StemCell Technologies19861
Kollagenase IVSigmaC9697-50MGTesten Sie jede Charge auf Endotoxin
DNase ISigmaDN25-10MG
HBSSThermoFisher14025092
FBSThermoFisher16140071Jede Charge auf Endotoxin
PE-CD11cBiolegend117307
APC-CD11bBiolegend101211
Brilliant Violet 650 MHCIIBiolegend107641
AF48- CD86Biolegend105017
APC/Cy7-Ly-C6Biolegend108423
PE/Cy7-CD15Biolegend135523

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