Eine schnelle Silber Färbung Protokoll ermöglicht einfache und effiziente Erkennung von SSR-Marker mit einem Non-denaturierenden Polyacrylamid-Gel

Summary

Hier berichten wir über eine einfache und kostengünstige Silber Färbeprotokoll erfordert nur drei Reagenzien und 7 min von Verarbeitung und eignet sich für schnelle Generierung von qualitativ hochwertigen SSR Daten in der genetischen Analyse.

Abstract

Einfache Sequenz wiederholen (SSR) ist eine der effektivsten Marker in pflanzlichen und tierischen Genforschung und molekulare Zuchtprogramme verwendet. Silberne Färbung ist eine weit verbreitete Methode zur Erkennung von SSR-Marker in einem Polyacrylamid-Gel. Konventionelle Protokolle für die silberne Färbung sind jedoch technisch anspruchsvoll und zeitaufwändig. Wie viele andere biologische Labor wurden Techniken, silberne Färbung Protokolle stetig optimiert, um nachweiseffizienz zu verbessern. Hier berichten wir über eine vereinfachte silberne Färbung Methode, die deutlich reduziert Reagenz Kosten und verbessert die Erkennung Auflösung und Bildqualität. Die neue Methode erfordert zwei wesentliche Schritte (Imprägnierung und Entwicklung) und drei Reagenzien (Silbernitrat, Natriumhydroxid und Formaldehyd) und nur 7 min Verarbeitung für ein nicht denaturierenden Polyacrylamid-Gel. Im Vergleich zu bereits gemeldeten Protokolle, diese neue Methode ist einfacher, schneller und verwendet weniger chemische Reagenzien für SSR-Erkennung. Somit profitieren diese einfache, kostengünstige und effektive Silber Färbeprotokoll genetische Zuordnung und markergestützte Züchtung durch eine schnelle Erzeugung von SSR-Marker-Daten.

Introduction

Die Entwicklung von PCR-basierten Markern revolutioniert die Wissenschaft der Pflanzengenetik und Zucht¹. Einfach wiederholende (SSR) Sequenzmarken gehören zu den vielseitigsten und am häufigsten verwendeten DNA-Markern. Ihre breiten Genom Abdeckung, Fülle, Genom Spezifität und Reproduzierbarkeit sind nur einige von den Vorzügen des SSR-Marker neben ihrer Vererbung Vererbung für die Erkennung von heterozygote Genotypen². Mehrere Studien haben SSR-Marker zu untersuchen genetischen Vielfalt, Abstammung zu verfolgen, genetische kopplungskarten zu konstruieren, und ordnen Sie Gene für wirtschaftlich wichtige Eigenschaften

Protocol

1. Vorbereitung der PCR-Produkte von SSR-Marker

1. Bereiten Sie alle Chemikalien und Reagenzien für PCR-Reaktionen einschließlich Vorlage DNA (30 ng/µL), 2 × PCR-master-Mix (mit 2 × PCR Puffer, 0,4 mM jedes dNTP, 3 mM MgCl₂, 0,1 U/µL Taq-DNA-Polymerase und Farbstoffe), 10 µM jedes weiterleiten und reverse Primer , und destilliertem oder entionisiertem Wasser (dH₂O).
   Hinweis: Die SSR-Marker verwendet, die in der vorliegenden Studie wurden PT51333 (Primer Sequenz vorwärts: 5 ' - GCACCTTTGGTTATCCGACA - 3' und rückwärts-Primer Sequenz: 5 "- TGCTTTAAGTCATGTACCAAATTGA - 3") und PT50903 (Primer Sequenz vorwärts: 5 ' - AAATTTCTTTCGGTGTGATAACTG ....

Results

Der PCR-Amplifikate wurden mit den korrespondierenden SSR Grundierung Paare in Blüte Chinakohl und Tabak hergestellt. Nach Elektrophorese waren die Polyacrylamid-Gele befleckt mit dem oben genannten Silber Färbeprotokoll, die eindeutig die Streifenbildung Muster des SSR-Marker (Abbildung 1) entdeckt.

Um die nachweiseffizienz verschiedene Silber Färbung Protokolle vergleichen, PCR-Produkte von SSR-Ma.......

Discussion

Das Waschen von Gel nach der Imprägnierung ist ein entscheidender Schritt. Unzureichende Reinigung Zeit und Wasser Volumen kann dazu führen, dass die unvollständige Entfernung der Imprägnierung Lösung auf der Oberfläche der Platte und das Gel und führen zu einem dunklen Hintergrund. Die entsprechenden Entwicklungszeit ist ein weiterer wichtiger Schritt, übermäßige Entwicklung kann dazu führen, dass ein dunkel-braunen Hintergrund mit kontrastarmen Bild von DNA-Fragmenten. Darüber hinaus beeinflusst die Imprägnierung Schri.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PCR-Mastermix (Green Taq Mix)	Vazyme Biotech Co. Ltd, China	#P131-03
50-2000 bp DNA Ladder	Bio-Rad, USA	#170-8200
DL500 DNA-Marker	Takara Bio Inc., Japan	#3590A Tris-Base
	Sangon Biotech Shanghai, China	#77-86-1
Borsäure	Sangon Biotech Shanghai, China	#10043-35-3
EDTA-Na2	Guangzhou Chemical Reagent Factory, China	#6381-92-6
Acrylamid	Sangon Biotech Shanghai, China	#79-06-1
N,N'-Methylen-bis-acrylamid	Sangon Biotech Shanghai, China	#110-26-9
N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin	Sangon Biotech Shanghai, China	#110-18-9
Ammoniumpersulfat	Guangzhou Chemische Reagenzfabrik, China	# 7727-54-0
Bind-Silan	Solarbio Beijing, China	#B8150
AgNO3< / sub>	Sinopharm Chemisches Reagenz Beijing Co., Ltd, China	# 7761-88-8
Formaldehyd	Tianjin DaMao Chemische Reagenzfabrik, China	# 50-00-0
NaOH	Guangzhou Chemische Reagenzfabrik, China	#1310-73-2
Essigsäure	Guangzhou Chemische Reagenzfabrik, China	#64-19-7
Na2CO3	Tianjin DaMao Chemische Reagenzfabrik, China	#497-19-8
Ethanol	Guangzhou Chemische Reagenzfabrik, China	#64-17-5
HNO< sub>3	Guangzhou Chemische Reagenzfabrik, China	#7697-37-2
Na2S2O3.5H2O	Sinopharm Chemisches Reagenz Beijing Co., Ltd, China	#10102-17-7
Eriochromschwarz T (EBT)	Tianjin DaMao Chemische Reagenzfabrik, China	#1787-61-7
Kunststofftablett	Shanghai Yi Chen Plastic Co., Ltd,	China-TS-1
Shaker	Qilinbeter JiangSu,	China-BenQ
M800 Scanner	BenQ,
Stromversorgung	Beijing Liuyi Instrument Factory,	China-High
durch vertikale Gelsysteme, JY-SCZF	Beijing Tunyi Electrophoresis Co., Ltd, China	-