Hier berichten wir über eine einfache und kostengünstige Silber Färbeprotokoll erfordert nur drei Reagenzien und 7 min von Verarbeitung und eignet sich für schnelle Generierung von qualitativ hochwertigen SSR Daten in der genetischen Analyse.
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Methodenartikel
Eine schnelle Silber Färbung Protokoll ermöglicht einfache und effiziente Erkennung von SSR-Marker mit einem Non-denaturierenden Polyacrylamid-Gel
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Einfache Sequenz wiederholen (SSR) ist eine der effektivsten Marker in pflanzlichen und tierischen Genforschung und molekulare Zuchtprogramme verwendet. Silberne Färbung ist eine weit verbreitete Methode zur Erkennung von SSR-Marker in einem Polyacrylamid-Gel. Konventionelle Protokolle für die silberne Färbung sind jedoch technisch anspruchsvoll und zeitaufwändig. Wie viele andere biologische Labor wurden Techniken, silberne Färbung Protokolle stetig optimiert, um nachweiseffizienz zu verbessern. Hier berichten wir über eine vereinfachte silberne Färbung Methode, die deutlich reduziert Reagenz Kosten und verbessert die Erkennung Auflösung und Bildqualität. Die neue Methode erfordert zwei wesentliche Schritte (Imprägnierung und Entwicklung) und drei Reagenzien (Silbernitrat, Natriumhydroxid und Formaldehyd) und nur 7 min Verarbeitung für ein nicht denaturierenden Polyacrylamid-Gel. Im Vergleich zu bereits gemeldeten Protokolle, diese neue Methode ist einfacher, schneller und verwendet weniger chemische Reagenzien für SSR-Erkennung. Somit profitieren diese einfache, kostengünstige und effektive Silber Färbeprotokoll genetische Zuordnung und markergestützte Züchtung durch eine schnelle Erzeugung von SSR-Marker-Daten.
Einleitung
Die Entwicklung von PCR-basierten Markern revolutioniert die Wissenschaft der Pflanzengenetik und Zucht1. Einfach wiederholende (SSR) Sequenzmarken gehören zu den vielseitigsten und am häufigsten verwendeten DNA-Markern. Ihre breiten Genom Abdeckung, Fülle, Genom Spezifität und Reproduzierbarkeit sind nur einige von den Vorzügen des SSR-Marker neben ihrer Vererbung Vererbung für die Erkennung von heterozygote Genotypen2. Mehrere Studien haben SSR-Marker zu untersuchen genetischen Vielfalt, Abstammung zu verfolgen, genetische kopplungskarten zu konstruieren, und ordnen Sie Gene für wirtschaftlich wichtige Eigenschaften
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Protokoll
1. Vorbereitung der PCR-Produkte von SSR-Marker
- Bereiten Sie alle Chemikalien und Reagenzien für PCR-Reaktionen einschließlich Vorlage DNA (30 ng/µL), 2 × PCR-master-Mix (mit 2 × PCR Puffer, 0,4 mM jedes dNTP, 3 mM MgCl2, 0,1 U/µL Taq-DNA-Polymerase und Farbstoffe), 10 µM jedes weiterleiten und reverse Primer , und destilliertem oder entionisiertem Wasser (dH2O).
Hinweis: Die SSR-Marker verwendet, die in der vorliegenden Studie wurden PT51333 (Primer Sequenz vorwärts: 5 ' - GCACCTTTGGTTATCCGACA - 3' und rückwärts-Primer Sequenz: 5 "- TGCTTTAAGTCATGTACCAAATTGA - 3") und PT50903 (Primer Sequenz vorwärts: 5 ' - AAATTTCTTTCGGTGTGATAACTG ....
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Ergebnisse
Der PCR-Amplifikate wurden mit den korrespondierenden SSR Grundierung Paare in Blüte Chinakohl und Tabak hergestellt. Nach Elektrophorese waren die Polyacrylamid-Gele befleckt mit dem oben genannten Silber Färbeprotokoll, die eindeutig die Streifenbildung Muster des SSR-Marker (Abbildung 1) entdeckt.
Um die nachweiseffizienz verschiedene Silber Färbung Protokolle vergleichen, PCR-Produkte von SSR-Ma.......
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Diskussion
Das Waschen von Gel nach der Imprägnierung ist ein entscheidender Schritt. Unzureichende Reinigung Zeit und Wasser Volumen kann dazu führen, dass die unvollständige Entfernung der Imprägnierung Lösung auf der Oberfläche der Platte und das Gel und führen zu einem dunklen Hintergrund. Die entsprechenden Entwicklungszeit ist ein weiterer wichtiger Schritt, übermäßige Entwicklung kann dazu führen, dass ein dunkel-braunen Hintergrund mit kontrastarmen Bild von DNA-Fragmenten. Darüber hinaus beeinflusst die Imprägnierung Schri.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von der Guangdong Natural Science Foundation of China (2015A030313500), der provinziellen Key International Cooperative Forschungsplattform und der großen wissenschaftlichen Forschung Projekt von Guangdong Higher Education (2015KGJHZ015), die Wissenschaft finanziert und Technologieplan Guangdong Tobacco Monopoly Verwaltung (201403, 201705), der Wissenschaft und Technologieplan von Guangdong China (2016B020201001), der nationalen Innovationssysteme Ausbildungsprojekt für Studierende (201711078001). Erwähnung von Handelsnamen oder kommerzielle Produkte in dieser Publikation ist ausschließlich zum Zweck der Bereitstellung von spezifischen Informationen....
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| PCR-Mastermix (Green Taq Mix) | Vazyme Biotech Co. Ltd, China | #P131-03 | |
| 50-2000 bp DNA Ladder | Bio-Rad, USA | #170-8200 | |
| DL500 DNA-Marker | Takara Bio Inc., Japan | #3590A Tris-Base | |
| Sangon Biotech Shanghai, China | #77-86-1 | ||
| Borsäure | Sangon Biotech Shanghai, China | #10043-35-3 | |
| EDTA-Na2 | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #6381-92-6 | |
| Acrylamid | Sangon Biotech Shanghai, China | #79-06-1 | |
| N,N'-Methylen-bis-acrylamid | Sangon Biotech Shanghai, China | #110-26-9 | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin | Sangon Biotech Shanghai, China | #110-18-9 | |
| Ammoniumpersulfat | Guangzhou Chemische Reagenzfabrik, China | # 7727-54-0 | |
| Bind-Silan | Solarbio Beijing, China | #B8150 | |
| AgNO3< / sub> | Sinopharm Chemisches Reagenz Beijing Co., Ltd, China | # 7761-88-8 | |
| Formaldehyd | Tianjin DaMao Chemische Reagenzfabrik, China | # 50-00-0 | |
| NaOH | Guangzhou Chemische Reagenzfabrik, China | #1310-73-2 | |
| Essigsäure | Guangzhou Chemische Reagenzfabrik, China | #64-19-7 | |
| Na2CO3 | Tianjin DaMao Chemische Reagenzfabrik, China | #497-19-8 | |
| Ethanol | Guangzhou Chemische Reagenzfabrik, China | #64-17-5 | |
| HNO< sub>3 | Guangzhou Chemische Reagenzfabrik, China | #7697-37-2 | |
| Na2S2O3.5H2O | Sinopharm Chemisches Reagenz Beijing Co., Ltd, China | #10102-17-7 | |
| Eriochromschwarz T (EBT) | Tianjin DaMao Chemische Reagenzfabrik, China | #1787-61-7 | |
| Kunststofftablett | Shanghai Yi Chen Plastic Co., Ltd, | China-TS-1 | |
| Shaker | Qilinbeter JiangSu, | China-BenQ | |
| M800 Scanner | BenQ, | ||
| Stromversorgung | Beijing Liuyi Instrument Factory, | China-High | |
| durch vertikale Gelsysteme, JY-SCZF | Beijing Tunyi Electrophoresis Co., Ltd, China | - |
Referenzen
- Jiang, G. L. Molecular markers and marker-assisted breeding in plants. Plant breeding from laboratories to fields. Anderson, S. B. , InTech Press. Croatia. 45-83 (2013).
- Powell, W., Machray, G. C., Provan, J. Polymorphism revealed by simple sequence repeats. Trend Plant Sci. 1, 215-222 (1996).
- Varshney, R. K., Graner, A., Sorrells, M. E.
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Nachdrucke und Genehmigungen
