Speicheldrüse Unterfunktion ist eine häufige Folge von Autoimmun-Krankheit und Strahlentherapie. Reproduzierbare Beurteilung der Speicheldrüse Funktion in Mausmodellen dieser Krankheiten ist eine technische Herausforderung. Hier ist eine einfache Methode für die genaue und reproduzierbare Messung der Speichelproduktion bei Mäusen beschrieben.
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Methodenartikel
Eine Methode zur Messung der Speicheldrüse Funktion bei Mäusen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Patienten mit Sjögren Syndrom, eine Autoimmunerkrankung, die Auswirkungen auf die therapeutisches Drüsen, Entzündung der Speicheldrüse zu entwickeln und Speichelproduktion reduziert haben. Ebenso ist Speichelproduktion bei Patienten, die Strahlentherapie bei Kopf-Hals-Tumoren stark beeinträchtigt. Nager-Modelle entwickelt, um diese Krankheitsbilder imitieren ein Verständnis der Pathogenese der Krankheit erleichtern und die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien ermöglichen. Daher ist die Fähigkeit, präzise, reproduzierbar und wiederholt Speicheldrüse Funktion in Tiermodellen messen entscheidend. Aufbauend auf den bisher in der Literatur beschriebenen Verfahren, wurde eine Methode entwickelt, die diese Kriterien erfüllt und wurde verwendet, um die Speicheldrüse Funktion bei Mäusen zu bewerten. Ein weiterer Vorteil dieser neuen Methode ist, dass es problemlos gemeistert und wenig Inter-Operator-Variation hat. Speicheldrüse Funktion wird als die Menge (Gewicht oder Volumen) oder die Rate (mL/min) in Reaktion auf die Pilocarpin Stimulation produziert Speichel ausgewertet. Die gesammelten Speichel ist eine gute Quelle für die Analysen der Eiweißgehalt, Immunglobulin-Konzentrationen und andere Biomoleküle.
Einleitung
Die Speicheldrüsen produzieren Speichel in Reaktion auf eine Vielzahl von neurologischen und mechanische Reize1. Die Reize werden durch die sympathischen und parasympathischen Nervensystem an die adrenergen und cholinergen Rezeptoren in der Drüse durchgeführt. Pilocarpin ist ein cholinergen, Para-Sympathomimetikum, das überwiegend auf Muskarin-Rezeptoren wirkt. In der Speicheldrüse induziert es die Produktion von Speichel durch Einwirkung auf die Muskarin Acetylcholin-Rezeptor M31. Speichelproduktion nach Pilocarpin Gabe ist ein Indikator für die Fähigkeit der Speicheldrüsen, auf Reize reagieren und wird allgemein als ein Maß für die Speicheldrüse Funktion verwendet.
Genaue Messung der Speichelproduktion ist entscheidend für das Studium der Speicheldrüse Krankheiten einschließlich Sjögren Syndrom2 und Strahlung Verletzung nach Kopf und Nacken Krebs Behandlung3. Verschiedene Methoden wurden entwickelt, um die Speichelproduktion bei Nagetieren zu messen. Dazu gehören direkte Kanülierung der Speicheldrüsen Ausführungsgang4, die Sammlung von Speichel aus der Mundhöhle unter Vakuum5und Inkasso mit Glas Kapillaren6 oder einer Mikropipette7,8, 9. direkte Kanülierung der Speicheldrüsen Rohrleitung bietet am meisten präzise und reine Speichel. Aber dies ist eine technisch anspruchsvolle Verfahren und das Potenzial für Umstehende Duktales schließt sich wiederholende Speichel Sammlungen vom selben Tier. Sammeln von Speichel unter Vakuum führen zu unterschiedliche Ergebnisse durch Trocknung des Speichels aus dem Rohr. Dieser Verlust ist bei Mäusen mit reduzierter Speichelfluss weiter übertrieben. Glaskapillaren erlauben die Sammlung des Speichels für spätere Analysen, Veränderungen in der Viskosität des Speichels abgesondert im kranken Zustand verhindert jedoch, dass effiziente Füllung der Kapillare. Darüber hinaus können Versuche die Mundhöhle residual Speichel sammeln zu fegen zu Verletzungen führen. Pipettieren Methode ermöglicht die komplette Sammlung, und für den gleichen Betreiber ist es bemerkenswert konsistent zwischen Experimente. Aus unbekannten Gründen zeigt diese Methode jedoch erhebliche Unterschiede zwischen verschiedenen Betreibern. Daher um entsprechende Vergleiche zu ermöglichen, ist es zwingend notwendig, dass die gleiche Betreiber alle Experimente, die im Zusammenhang mit einem bestimmten Projekt führt. Natürlich ist dies einen großen Nachteil für ein Labor.
Um diese Probleme zu überwinden, wurde ein Verfahren entwickelt, dass verbindet Speichel Erhebungsmethoden für Menschen und Nagern verwendet. Die unten beschriebene, für Pilocarpin induzierten Speichel Messvolumen Tupfer-Methode ist einfach, reproduzierbar und nicht beeinflusst durch den Betreiber und immer wieder in das gleiche Tier durchgeführt werden kann. Darüber hinaus ermöglicht es den Speichel für spätere Analysen von Proteinen, Immunglobuline oder andere Biomoleküle zu sammeln.
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Protokoll
Die nachfolgend beschriebene Protokoll von institutionellen Animal Care und Use Committee genehmigt wurde und es folgt die ethischen Leitlinien durch die National Institutes of Health. Alle Daten, die in diesem Bericht vorgestellten entstanden mithilfe von weiblichen Mäusen, die 10-12 Wochen alt waren. Die folgenden Stämme von Mäusen wurden verwendet: C57BL/6, BALB/c, DBA1, 129S und F1 (B6XA/J). Alle Mäuse waren in Barriere Käfigen (5 Tiere pro Käfig) in bestimmten Pathogen-freies Bedingungen untergebracht und Futter und Wasser ad libitum zur Verfügung gestellt.
1. Vorbereitung
- Zur Vorbereitung einer Stammlösung Pilocarpin Hydrochlorid wiegen Sie 10 mg der Verbindung und durch Vortexen, geben eine Stammlösung von 5,63 mg/mL in 1,776 mL sterile isotonische Kochsalzlösung zu lösen. Es gibt keine Notwendigkeit, diese Lösung zu sterilisieren. Aber wenn gewünscht, durch einen 0,2 µM-Filter filtern. Diese Stammlösung in mehrere Aliquote in einer Gefriertruhe-80 oC für bis zu 3 Monate aufbewahren. Jedes gefrorene Lager ist für den einmaligen Gebrauch. Einmal aufgetaut, nicht wieder einfrieren Sie die Pilocarpin-Lösung.
- Nehmen Sie 0,6 mL Microfuge Röhren und Punsch vorsichtig ein kleines Loch in den Boden des jedes Rohr mit einer beheizten 18-Gauge-Nadel. Diese Rohre in 2 mL Röhrchen gesetzt. Die Rohre müssen nicht steril sein.
- Mit einer scharfen, sterilen Rasierklinge, zylindrische absorbierenden Tupfer in Stücke ca. 2 cm Länge schneiden. Schneiden Sie jedes 2 cm Stück Diagonal um 2 konisch geformte Abstriche geben. Ein Tupfer in jedes 0,6 mL Microfuge Rohre.
- Wiegen der 0,6 mL Microfuge Tube mit den trockenen Tupfer.
- Übertragen Sie die Mäuse in einen neuen sauberen Käfig mit Wasserflaschen untersucht werden. Halten Sie die Mäuse ohne Nahrung für mindestens 2 h vor Beginn der Speichel Sammlung zu verhindern, dass Speisereste verunreinigt den Speichel gesammelt.
Hinweis: Es ist nicht notwendig, 1 Maus pro Käfig für dieses Verfahren zu halten. Allerdings hängt die Anzahl der Mäuse in jedem Käfig platziert auf die spezifische Einrichtung Regeln und Vorschriften für die Verwendung von Tieren. - Kurz vor Ende des 2 h bereiten Sie die Arbeitslösung Pilocarpin (0,0563 mg/mL) durch eine Verdünnung der Stammlösung 100 X in sterile Kochsalzlösung. Es ist nicht notwendig, weitere Filter diese Lösung zu sterilisieren. Halten Sie immer die Arbeitslösung Pilocarpin auf Eis.
Hinweis: Die Tabelle 1 gibt die Menge an Pilocarpin für verschiedenste Maus Körpergewicht zu geben eine endgültige Dosis von 0,375 mg/kg Körpergewicht gespritzt werden.
(2) Verfahren
- Jede Maus wiegen und die Dosis des Narkose-Mix für jede Maus mit Tabelle 1zu bestimmen. Die erste Maus mit den entsprechenden Volumen des Narkose-Mix durch die intraperitoneale Route zu injizieren. Stellen Sie den Timer für 2 min (die meisten Mausstämme getestet in diesem Protokoll schlafen gehen von 2 min). Stellen Sie sicher, dass die Maus richtig, durch Mangel an spazieren betäubt ist, als auf einer ebenen Fläche aufgestellt. Wenn die Maus noch zu Fuß unterwegs ist, warten Sie weitere 2 min bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren. Geben Sie einen Tropfen Gleitmittel ophthalmologischen Salbe auf beiden Augen um Austrocknen zu verhindern.
Hinweis: In der Tabelle 1ist die Dosis des Narkose-Mix 0,007 mL/g Körpergewicht. Der optimale Bereich für dieses Verfahren ist 0,006 bis 0,008 mL/g Körpergewicht. Doch nach 4 min, wenn die Maus ist noch Fuß oder ruckartige Bewegungen ausstellen mit der institutionellen Tierarzt für angemessene Erhöhung der Dosis des Betäubungsmittels zu konsultieren. - Bestimmen Sie die Dosis von Pilocarpin für die Maus mit Tabelle 1 und injizieren Sie die entsprechende Menge durch die intraperitoneale Route. Stellen Sie den Timer für 2 min und legen Sie die Maus in 50 mL Restrainer Rohr, bis der Kopf und die Ohren aus das abgeschnittene Ende kleben. Legen Sie das Rohr in einem Winkel von 45 Grad mit dem Kopf nach unten, und der ventralen Oberfläche nach oben zeigt. Kleben Sie den Schlauch an dem Verfahren-Brett, um es vom bewegen zu halten.
Anmerkung: Tabelle 1 liefert Dosierung für Mäuse mehr als 17 g, da dieses Verfahren nicht an Mäusen mit einem Gewicht von unter 17 g unternommen wurde. - Am Ende 2 min sanft legen Sie ein geschlossenes paar Mikro Zange in den Mund zu zerlegen und heben Sie den Unterkiefer nach oben, um den Mund zu öffnen. Drücken Sie die Zange 1 – 2 mm weiter in den Mund, um sicherzustellen, dass die Zunge ruht auf den oberen Arm der Zange gesehen wird. Halten Sie mit einem anderen paar feine Pinzette die vorgewogene trockenen Tupfer in der Nähe der konische Spitze.
- Ziehen Sie vorsichtig das konische Ende des Tupfers in den Mund. Zurückziehen der Zange beim Verlassen des Ende des Tupfers in die Mundhöhle.
- Fassen Sie das breitere Ende des Tupfers außerhalb der Mündung Verlängerung und drehen Sie ihn um die maximale Fläche des Kontaktes mit dem Mund zu ermöglichen. Halten Sie den Tupfer in dieser Position für 15 min.
Hinweis: Dies stellt sicher, dass die Tupfer für die Dauer der Sammlung im Mund bleibt. Beachten Sie, dass das konische Ende des Tupfers wie ein Docht wirkt und der breitere Teil des Tupfers außerhalb des Mundes bleibt. - Am Ende von 15 min sanft Drehen Sie den Tupfer jede Speichel zu sammeln, die nicht aufgenommen worden und den feuchten Tupfer in der 0,6 mL Microfuge Tube. Verschließen Sie das Röhrchen und setzen Sie ihn in der 2 mL Tube auf Eis gelegt.
Hinweis: Zu diesem Zeitpunkt die Mundschleimhaut vollständig trocken erscheint. Die Maus kann nun wieder in seinem Käfig für die Wiederherstellung aus der Narkose verschoben werden. - Übertragen Sie die Maus in den Käfig. Platzieren Sie feuchte Lebensmittel Pellets in den Käfig nach Speichel Sammlung schneller Rehydratation helfen.
Hinweis: Die Mäuse aufwachen innerhalb von 10 min nach dem Ende der Auflistung. Subkutane Injektion von 0,2 mL vorgewärmten isotonische Kochsalzlösung kann auch gegeben werden, um die Genesung zu beschleunigen. - Fahren Sie mit der nächsten Maus. Alles, was die Mäuse sollten überwacht werden, bis sie sich vollständig erholt haben und sind ambulante.
(3) Messungen
- Am Ende aller Kollektionen wiegen Sie die 0,6 mL Röhrchen mit den feuchten Tupfer. Berechnen Sie die Differenz zwischen dem Frischgewicht und Trockengewicht, das Gewicht der Speichel produziert zu bekommen. Setzen Sie die 0,6 mL-Tube mit Speichel wieder in der 2-mL-Tube.
- Schneiden Sie die Kappen der 2 ml Röhrchen. Zentrifugieren Sie dann die 2 mL Röhrchen für 2 min bei 7500 X g bei 4oC in ein Mikro Zentrifuge, den Speichel zu erholen. Messen Sie das Volumen der Speichel mit einer Mikropipette erzielt.
- Express die Ergebnisse als Speichel Gewicht (mg)10 über 15 min oder als ein Verhältnis von Speichel Gewicht (mg) / Gewicht (g) die Maus.
Hinweis: Wenn das Volumen des Speichels extrahiert aus den Tupfer gemessen wurde, zum Ausdruck bringen die Ergebnisse als das Volumen des Speichels wiederhergestellt (mL) oder das Verhältnis von Speichel Volumen (mL) / Gewicht (g) Maus.
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Ergebnisse
In der experimentellen Maus-Modellsystemen ist die Fähigkeit, Speichel in Reaktion auf die Pilocarpin Stimulation produzieren als Indikator der Speicheldrüse Funktion verwendet. Speichelproduktion wurde in 11 Wochen alten C57BL/6 weiblichen Mäusen durch die Tupfer-Methode gemessen. Die Ergebnisse sind in Abbildung 1Aals die Menge des Speichels (mg) gesammelten nach zunehmenden Dosen von Pilocarpin ausgedrückt. Bei der Dosis von 1 mg/kg Körpergewicht begannen ...
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Diskussion
Speichelproduktion ist ein komplexer Prozess und wird durch viele Faktoren beeinflusst. Daher kann die Messfunktion Speicheldrüse bei Versuchstieren eine Herausforderung sein. Eine zusätzliche Herausforderung ist, dass wiederholte Messungen der Speicheldrüse Funktion im gleichen Tier erforderlich, um den Ausbruch der Krankheit zu etablieren oder zur Erholung nach der Behandlung zeigen.
In diesem Bericht beschriebenen Tupfer-Methode ist technisch einfach mit mehreren Optionen zur Darstellung de...
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenlegen.
Danksagungen
Die Studie wurde unterstützt durch ein Stipendium der National Institutes of Health, National Institut of Dental und Craniofacial Forschung (DE025030).
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Chemikalien für die Speichelsammlung | |||
| Pilocarpinhydrochlorid | Alfa Aesar, Tewksbury, MA, USA | B21410 | In steriler isotonischer Kochsalzlösung verdünnen. Lagern Sie Einmal-Aliquots von 100X Lagerbestand bei -80oC |
| Name | > | Katalognummer | Kommentare |
| Anästhesie-Mix-Lösung | Mix 1 ml Ketaminhydrochlorid + 0,5 mL Xylazin + 8,5 mL sterile isotonische Kochsalzlösung in einem sterilen Fläschchen. Kann 3 Monate lang verwendet werden. | ||
| Zetamin (Ketaminhydrochlorid) | Vet One, Boise, Idaho, USA | C3N VT1 | Bestand beträgt 100 mg/ml |
| Anased (Xylazin) | Med-Vet International, Mettawa, IL, USA | RXANASED-20 | Bestand ist 20 mg/ml |
| isotonische sterile Kochsalzlösung | Vet One, Boise, Idaho, USA | 501032 | Wird als Verdünnungsmittel verwendet |
| Künstliche Tränen (Gleitmittel Augensalbe) | Henry Schien, Dublin, OH, USA | 48272 | Wird verwendet, um das Austrocknen der Augen während des Eingriffs zu verhindern |
| Name | ><>Company | Katalognummer< | strong>Kommentare |
| <>Materialien für die Speichelsammlung | |||
| Speichelbio Kindertupfer | Salimetrics, LLC Carlsbad, CA, USA | N/A | Einzeln verpackte Tupfer |
| 50 mL Polypropylen-Röhrchen | VWR, Radnor, PA, USA | 89004-364 | Schneiden Sie die unteren 1 cm des Röhrchens ab. Achten Sie darauf, dass die Schnittkante glatt ist. |
| Mikrozentrifugenröhrchen 0,6 mL | VWR, Radnor, PA, USA | 87003-290 | Mit erhitzten 18-Gauge-Nadeln Löcher in den Boden des Röhrchens bohren |
| Mikrozentrifugenröhrchen 2 mL | VWR, Radnor, PA, USA | 87003-298 | |
| Insulinspritzen mit fest angebrachten | Nadeln Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 324702 | |
| 18 Gauge reguläre Bevel-Nadeln | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 305195 | |
| Sterile Skalpellklinge #11 | Integra York Inc PA, USA | 4-311 | |
| Mikrodisparierzange | Roboz, Gaithersburg, MD, USA | RS-5139 | Gezahnte eckige Spitze von 0,8 mm, Länge 4 |
| Etikettenband | Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA | sc-224487 | |
| 3-Kanal-Timer | Amazon.com, Seattle, WA, USA | B06W2KCYVN | |
| Analysenwaage | Mettler Toledo, Columbus OH, USA | ||
| strong>Name | Company | Katalognummer | <>Kommentare |
| Chemikalien/ Reagenzien zur Induktion von Speichelfunktionsstörungen | |||
| LPS | Invivogen, San Deigo, CA, USA | tlrl-b5lps | In endotoxinfreiem Wasser auflösen und Stammlösung bei 5 mg/ml lagern. In sterilem HBSS 100 μg/ml verdünnen - 100 μl/μl injizieren Thermo |
| Scientific | 77161 | Adjuvans | :1 in steriler Kochsalzlösung. Intraperitoneal injizieren 0,1 ml/Maus |
| Kaninchen Anti-Ro52 Antiserum | Im Labor | Immunisierung von Kaninchen mit rekombinanter Maus Ro52 | |
| Name< | >Unternehmen< | strong>Katalognummer | Kommentare |
| Chemikalien/ Kits für Speichelanalysen | |||
| Speichel-Lysozym-Schätzung | |||
| EnzChek Lysozym-Assay-Kit | Molekulare Sonden, Eugene, OR, USA | E-22013 | Verwendet gemäß den Anweisungen des Herstellers |
| Name | <>Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
| Speichel-IgA-Schätzung durch Sandwich-ELISA | |||
| Maus | IgA Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 0106-01 | Standards für Sandwich-ELISA - Bereich 30 ng/ml bis 0,5 ng/ml |
| Ziegen-Anti-Maus-IgA unmarkiert | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 1040-01 | Mantel bei 1 μg/ml in Bicarbonat-Puffer |
| Ziegen-Anti-Maus-IgA HRP | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 1040-05 | Nachweis-Antikörper verwendet in 1:4000 Verdünnung |
| TMB-Substrat | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 555214 | Verwendet gemäß den Anweisungen des Herstellers |
| Immulon 4HBX Mikrotiter 96 Well-Platten | Thermo Scientific, Rochester, NY, USA | 3855 | |
| Name | Company | Katalognummer | <>Kommentare |
| Speichelproteinschätzung | |||
| Bio-Rad Protein Assay Farbstoff Reagenzkonzentrat | BioRad, Hercules, CA, USA | 5000006 | Für die Proteinschätzung gemäß den Anweisungen des Herstellers |
Referenzen
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