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Transplantation von Fettgewebe-Derived Stem Cell Blatt, Leckage nach teilweiser Colectomy in einem Rattenmodell zu reduzieren

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DOI:

10.3791/57213

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11. August 2018

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1Department of Clinical Sciences of Companion Animals, Faculty of Veterinary Medicine, Utrecht University, 2Department of Otorhinolaryngology, Erasmus MC University Medical Center, 3Department of Clinical Sciences and Public Health, Faculty of Veterinary Science, Mahidol University, 4Department of Surgery, Erasmus MC University Medical Center, 5Department of Orthopaedics, Erasmus MC University Medical Center, 6Hill's Pet Nutrition Inc.

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die Vorbereitung und die Transplantation von abgeleitet Fettgewebe Stammzellen (ASC) Blätter auf unzureichend genähten kolorektalen Anastomosen in einem Rattenmodell wird vorgestellt. Diese neuartige Anwendung zeigt, dass ASC Blätter kolorektalen Anastomose Leckage reduziert werden können.

Zusammenfassung

Anastomosen Leckage ist eine katastrophale Komplikation nach Kolorektale Chirurgie. Obwohl aktuelle Methoden zur Leckage Prävention unterschiedlicher klinischer Wirksamkeit haben, sind sie bis jetzt unvollkommene Lösungen. Stammzell-Therapie mit ASC Sheets könnte eine Lösung für dieses Problem bieten. ASC gelten als aussichtsreiche Kandidaten für die Förderung der Gewebe, die Heilung aufgrund ihrer trophischen und immunmodulatorische Eigenschaften. Hier bieten wir Methoden, um High-Density-ASC Blätter zu produzieren, die auf einem kolorektalen Anastomose in einem Rattenmodell der Leckage reduzieren verpflanzt werden. ASC gebildet Zelle Blätter in Thermo-responsive Kultur-Gerichte, die leicht abgestellt werden können. Am Tag der Transplantation erfolgte eine teilweise Colectomy mit einem 5-Naht kolorektalen Anastomose. Tiere wurden sofort mit 1 ASC Blatt pro Ratte transplantiert. ASC Blätter eingehalten spontan die Anastomose ohne Klebstoff, Naht oder irgendwelche Biomaterial. Tiergruppen wurden geopfert, 3 bis 7 Tagen nach der Operation. Im Vergleich zu transplantierten Tieren, lag die Inzidenz von Anastomosen Abszesse und Leckage in Kontrolltieren. In unserem Modell war die Transplantation von ASC Blätter nach kolorektalen Anastomose erfolgreich und mit einer geringeren Leckrate verbunden.

Einleitung

Partielle Colectomy mit eine primäre Anastomose ist eine häufig durchgeführte Operation, die für viele Erkrankungen des Dickdarms wie Darmkrebs, Morbus Crohn und Divertikulitis1,2getan werden kann. Die am meisten gefürchtete Komplikation nach kolorektalen Anastomose Anastomosen Leckage3ist. Obwohl mehrere Risikofaktoren im Zusammenhang mit Anastomosen Lecks identifiziert wurden, sind Lösungen zur Vermeidung von Leckagen Unkown4,5.

Fettgewebe gewonnenen Stromazellen Zellen (ASC) werden entzündungshemmende und trophischen Eigenschaften6,7, wodurch diese vielversprechende Kandidaten für regenerative Therapien8Zellen zugeordnet. Die Wirksamkeit des ASC, die Heilung des Gewebes zu fördern wurde in verschiedenen Geweben wie z. B. des Herzmuskels, Haut und Speiseröhre9,10,11,12,13gezeigt. Allerdings gibt es einige Berichte über den Einsatz von ASC, intestinale Heilung zu fördern. Lokale Transplantation von ASC, experimentelle kolorektalen Anastomosen über ASC-beschichtete Biosutures oder serosal Injektionen von ASC zeigte sich entweder keine Besserung bei der Heilung14 nicht verhindern, dass Anastomosen Leckage trotz ein günstigeres Anastomosen 15zu heilen.

Lokale Transplantation des ASC in der Schwebe oder in Kombination mit Biomaterialien möglicherweise unzureichend Zelle Zurückbehaltungs- oder eine unzureichende Verteilung der transplantierten Zellen11zugeordnet. Zelle Blatt Technologie16,17 bietet eine innovative Methode der ASC Lieferung18,19. Daher wurde in einer früheren Studie, ein neuartiger Ansatz vorgeschlagen, in welche ASCs organisiert in einer Zelle auf experimentelle kolorektalen Anastomose20Blatt angewendet werden kann. Diese Studie zeigte, dass ASC Blatt Transplantation erfolgreich bei der Verringerung der kolorektalen Anastomose Leckage nach teilweiser Colectomy in einem Rattenmodell ist. Dieser Artikel berichtet ASC Blatt Vorbereitung und chirurgische Transplantation Technik.

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Protokoll

Subkutane abdominalen Fettgewebe erhielt von menschlichen Spendern mit Genehmigung der medizinischen Ethik-Ausschuß (#MEC-2014-092), Erasmus MC University Medical Center, Rotterdam, Niederlande. Alle Tierversuche stimmten mit den ethischen Komitees der Tier experimentieren, Erasmus MC University Medical Center, Rotterdam, Niederlande (133-14-01).

1. menschliche ASCs Isolation und Kultur

  1. Bereiten Sie 3 mL Isolierung Medium für 1 g des Fettgewebes. Niedrige Glukose Mischung Dulbecco's geändert Eagle Medium (LG-DMEM) mit 10 g/L Bovine Serum Albumin (BSA) und 1 g/L Kollagenase Typ 1.
  2. Sezieren menschlicher subkutane abdominalen Fettgewebe (n = 8, alle weiblich, mittleren Alters 40 ± 9 Jahre alt) in kleine Stücke (0,5 cm) mit einem sterilen chirurgischen Messer Größe 10, Adson-braun Gewebe Zange und metzenbaumschere in einem sterilen biologische SafetyCabinet.
  3. Speichern Sie das sezierte Gewebe in einer sterilen Medien Speicher Glasflasche. Wiegen Sie den Gesamtbetrag der seziert Gewebe und starten Sie die Verdauung mit dem vorbereiteten Isolierung Medium (50 g des Fettgewebes mit 150 mL Isolierung Medium pro Flasche). Das Protokoll kann hier angehalten werden, die Flasche mit dem seziert Fettgewebe und Isolierung Medium bei 4 ° C über Nacht auf eine Walze Mixer gespeichert. Dann prewarm die Flasche am nächsten Tag auf Raumtemperatur 25 ° C für 15 min bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.
    Hinweis: Subkutane abdominalen Fettgewebe von Spendern Chirurgie Brust Wiederaufbau mit Genehmigung der Erasmus MC medizinischer Ethik-Ausschuß (# MEC-200) und nach dem Code of Conduct als Restmaterial erhielt: "richtige sekundäre Nutzung des menschlichen Gewebes"(< Http://www.federa.org>). Übrig gebliebene Fettgewebe diente nur von Spendern, die nicht auf sekundäre Nutzung abmelden.
  4. Verdauen Sie sezierte Fettgewebe in einer sterilen Medien Speicher Glasflasche in einem Shaker-Inkubator bei 150 u/min und 37 ° C für 1 h.
  5. Teilen Sie die verdaute Lösung in 50 mL Röhrchen und Zentrifugieren Sie die Rohre für 10 min bei 390 X g.
  6. Kulturmedium vorbereiten: LG-DMEM mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS), 50 µg/mL Gentamicin und 1,5 µg/mL Ampothericin B. ergänzt
  7. Nach der Zentrifugation den überstand zu entfernen und Aufschwemmen der Zelle-Pellets in 20 mL Kulturmedium (LG-DMEM mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS), 50 µg/mL Gentamicin und 1,5 µg/mL Ampothericin B ergänzt). Die Zellen wieder für 5 min bei 390 X g zentrifugieren und den überstand zu entfernen.
  8. Aufschwemmen der Zelle Pellet mit 10 mL Kulturmedium (LG-DMEM mit 10 % FBS, 50 µg/mL Gentamicin und 1,5 µg/mL Ampothericin B ergänzt) und die Zellsuspension durch einen 100 µm-Filter filtern.
  9. 50 µL Zellsuspension 50 µL der Lösung 3 % Essigsäure/Methylen Blau (für Lyse der roten Blutkörperchen) hinzu, mischen Sie die Lösung und verwenden Sie 10 µL, um die Zellen zu zählen. Durchführen Sie Zelle zählen mit einem Hemocytometer. Dann Platte die Zellen bei einer Dichte von 40.000 Zellen/cm2 in Kulturmedium (LG-DMEM mit 30 % FBS, 50 µg/mL Gentamicin und 1,5 µg/mL Ampothericin B ergänzt).
  10. Inkubation der Zellen bei 37 ° C in einer feuchten Atmosphäre mit 5 % CO2 für 24 h.
  11. Nach der Inkubation, Waschen der Zellen mit Warm (37 ° C) Phosphat Kochsalzlösung (PBS) Zelle Verschmutzungen entfernen und ersetzen Sie die Medien mit 10 % FBS Kulturmedium gepufferte mit frisch hinzugefügt Ascorbinsäure-2-Phosphat (25 µg/mL) und Wachstum der rekombinanten menschlichen Fibroblasten Faktor 2 (FGF2, 1 ng/mL).
  12. Subkultur ASC mit 90 % Zusammenfluss mit standard 0,25 % Trypsin EDTA Lösung (3 mL für T175 Kolben). Neutralisieren Sie nach ca. 3-5 min die 0,25 %-Trypsin-EDTA-Lösung mit 10 mL Kulturmedium (LG-DMEM mit 10 % FBS, 50 µg/mL Gentamicin und 1,5 µg/mL Ampothericin B ergänzt).
    Hinweis: Flow Cytometry Analyse mit gemeinsamen ASC oberflächenmarker und Tri-Linie Differenzierung Assays wurden bereits durchgeführt und ergab, dass ASC isoliert unter Verwendung dieses Protokolls angezeigt ASC Besonderheiten21,22.
  13. Waschen Sie die Zellen mit 10 mL Kulturmedium (LG-DMEM mit 10 % FBS, 50 µg/mL Gentamicin und 1,5 µg/mL Ampothericin B ergänzt) für T175 Kolben und Zentrifugieren der Zellen für 8 min bei 250 X g. Entfernen des Überstands und Aufschwemmen der Zellen in 1 mL Kulturmedium. Zählen Sie die Zellen mit einem Hemocytometer.
  14. Die Zellen in T175 Kulturflaschen bei einer Dichte von 8.000 Zellen/cm2Teller.
  15. Die restlichen ASC in flüssigem Stickstoff mit 10 % Dimethyl Sulfoxid (DMSO) im Kulturmedium vor weiterem Gebrauch einfrieren.

2. ASC-Blatt-Vorbereitung

  1. Pre-bestreichen Sie Thermo-responsive Kultur Gerichte (3,5 cm Durchmesser) mit 1 mL der FBS, dann legen Sie die Gerichte in einem Inkubator bei 37 ° C für mindestens 30 min vor der Aussaat der Zelle.
  2. Trypsinize ASC mit 0,25 % Trypsin EDTA Standardlösung für 3-5 min (3 mL für T175 Kultur Kolben). Nach Trypsinization gibt es Zelle Klumpen, Filtern Sie die Zellen durch einen 100 µm-Filter vor dem zählen.
  3. Neutralisieren die Trypsin-Lösung mit LG-DMEM mit 10 % ergänzt FBS (10 mL für ein T175-Fläschchen) und Zentrifuge die Zellsuspension für 8 min bei 250 X g. entfernen den überstand und Aufschwemmen der Zellen in 1 mL der LG-DMEM mit 10 % ergänzt FBS.
  4. Bewegen Sie nach der Beschichtung die Thermo-responsive Kultur Gerichte mit FBS die Gerichte aus dem Inkubator, eine Warmhalteplatte bei 37 ° C und entfernen Sie FBS aus der Schale zu.
  5. Samen ASC bei 400.000 Zellen/cm2 (insgesamt 3,52 × 106 Zellen in 2 mL Kulturmedium pro Schale verdünnt).
  6. Verteilen Sie sorgfältig die Zellen so gleichmäßig wie möglich durch die Schale sanft schwingen.
  7. Kultur-ASC-Blätter für 48 h bei 37 ° C in einer feuchten Atmosphäre mit 5 % CO2.
    Hinweis: Versuchen Sie, Öffnen der Tür des Inkubators nach der Aussaat ASCs um Temperaturtropfen zu verhindern, die möglicherweise mit ASC Blattbildung stören oder verursachen vorzeitige Ablösung der gebildeten ASC Blätter zu minimieren.

(3) teilweise Colectomy und kolorektalen Anastomose

  1. Induzieren und pflegen männliche Wistar-Ratten (mit einem Gewicht zwischen 250-350 g) mit 1 L/min von Isofluran (1.5-5%)/oxygen Inhalation und 0,05 mg/kg Buprenorphin intramuskulär zu injizieren.
  2. Sobald die Tiere unter Vollnarkose sind, beurteilen Sie Narkose Tiefe mit reflex testen. Gelten Sie Vitamin A enthält Augensalbe für die Augen, um Trockenheit zu verhindern. Anästhesie für Chirurgie ausreichend gilt, aseptisch bereiten Sie den Bauch durch Haare rasieren und Spritzen den OP-Bereich zweimal mit 70 % Ethanol. Drapieren Sie den Bauch mit sterilen Papier drapiert. Verwenden Sie eine aseptische Technik und pflegen Sie den sterilen Bereich während der gesamten chirurgischen Eingriffs.
  3. Machen Sie eine Mittellinie Bauchschnitt von 5 cm mit einer sterilen chirurgischen Messer Größe 10 und verlängern Sie die Inzision mit metzenbaumschere. Identifizieren und exteriorize des Dickdarms und packen den Doppelpunkt Weg vom Rest der Bauchhöhle mit Kochsalzlösung befeuchtet Gazen. Identifizieren Sie rechts, Mitte zu und Koliken Arterien in das Mesenterium verließ, unverblümt um jedes Schiff mit Halsted-Mosquito sezieren und verbinden jedes einzelne Schiff mit nicht resorbierbaren geflochtene Seide 4/0.
  4. Das Kolon Segment zwischen 1,0 cm aborally, der Blinddarm und 0,5 cm oberhalb der kaudalen mesenterialen Arterie zu isolieren. Transekt durch gesunden Darm metzenbaumschere verwenden. Vereinen Sie nach der Resektion des Segments Kolon die proximalen und distalen Enden des Dickdarms durch die Einführung von zwei langen Wattestäbchen Trans Anal durch den distalen Dickdarm, und dann in den proximalen Colon-Ende.
  5. Erstellen Sie mithilfe ein Operationsmikroskop ein ungenügend genähten End-to-End-Anastomose durch einschichtige invertieren Nähen mit 5 unterbrochene Nähte (nicht resorbierbar Monofil Polyamid 8/0). Legen Sie die unterbrochene Nähte durch alle Schichten der Darmwand und positionieren Sie den Knoten Extraluminally.
  6. Teilen Sie die Ratten nach dem Zufallsprinzip in Kontrolle oder ASC-Blatt-Gruppe.

4. ASC Blatt Transplantation

  1. Lassen Sie die Kultur Speisen Abkühlen auf Raumtemperatur 40 min vor der in-Vivo -Transplantation, ASC Blatt Loslösung zu erleichtern.
    Hinweis: Nach der Loslösung ASC Blätter schrumpfen um ca. 2 cm im Durchmesser. ASC Blatt Lebensfähigkeit bleibt nach der Loslösung20hoch für mindestens 3 bis 6 h.
  2. Entfernen Sie das Kulturmedium und ersetzen es mit 1 mL Serum kostenlos LG-DMEM.
  3. Vorsichtig greifen Sie die Felgen des ASC Blattes mit atraumatische Pinzette und setzen Sie die Schale-Seite des ASC Blattes über der Anastomosen Linie.
  4. Vorsichtig dehnen sich die ASC Blatt ca. 0,25 cm oberhalb und unterhalb der Anastomosen Zeile mithilfe der atraumatischen Pinzetten und wickeln das Blatt um den Dickdarm. Heben Sie den Dickdarm bis zu wickeln das ASC-Blatt auf der dorsalen Seite.
    Hinweis: ASC Blätter spontan Anastomosen Linie halten, gibt es keine Notwendigkeit, Gewebekleber oder anderen Biomaterial. Die Kontrollgruppe erhält keine zusätzliche Behandlung.
  5. Die Wattestäbchen zu entfernen und die Handschuhe und die Instrumente zu ändern. Ersetzen Sie den Doppelpunkt in den Bauch. Schließen die Bauch-Linea Alba mit einer Schicht der ausgeführten Nähte mit resorbierbaren geflochtene Polyglycolic Säure 5/0. Naht der Unterhaut und der Cutis zusammen in einer Schicht der ausgeführten Nähte mit resorbierbaren geflochtene Polyglycolic Säure 5/0.

5. postoperative Auswertung und Nachbereitung

  1. Sofort rehydrieren Sie die Tiere mit einer subkutanen Injektion von 5 mL warmen Kochsalzlösung postoperativ. Legen Sie die Tiere unter einer Wärmelampe Körpertemperatur aufrechtzuerhalten und die Vitalfunktionen überwachen, bis Tiere ausreichend Bewusstsein um sternalen liegen beizubehalten wiederhergestellt.
    Hinweis: Tiere, die Operation unterzogen hatte wurden nicht an die Gesellschaft anderer Tiere bis vollständig erholt zurückgegeben. Ermöglichen Sie nach seiner Genesung freien Zugang zu Wasser und regelmäßige Ratte Chow. Verwalten Sie für postoperative Schmerzlinderung Buprenorphin 0,05 mg/kg subkutan alle 6-8 Std. für 3 Tage. Jederzeit in dieser Studie wurden keine Antibiotika verabreicht.
  2. Erhalten Sie tägliche klinische Auswertungen von Wellness und Gewicht. Im Falle einer sehr niedrigen Wellness-Partitur oder starkem Gewichtsverlust sollten Tiere durch Entbluten über Herzpunktion noch unter Narkose eingeschläfert werden.
  3. Am postoperativen Tag 3 bis Tag 7, Betäuben die Ratten wieder mit 1 L/min von Isofluran (1.5-5%)/oxygen Inhalation ohne Buprenorphin, und führen Sie eine Re-Laparotomie mit einem u-förmigen Schnitt. Überprüfen Sie den Bauch auf die Anzeichen einer Bauchfellentzündung, Striktur, fibrösen Adhäsionen und das Vorhandensein von Abszessen. Ergebnis der Schwere von Adhäsionen und Abszess im Bauchraum und im Bereich Anastomosen.
  4. Bestimmen Sie den Anastomosen Berstdruck von Insufflation von Luft in einem geschlossenen Segment des Dickdarms einschließlich der Anastomose. Aufzeichnen des Luftdrucks und der Ort des Bruches, wenn die erste Luft austreten als Berstdruck.
  5. Entfernen Sie den Doppelpunkt von geopferten Tieres und befestigen Sie geschnittenen Segment des Dickdarms - haltigen kolorektalen Anastomose - mit 4 %, gepuffert Formaldehyd, nach durch Paraffin einbetten und 4 μm Dicke Abschnitte des Dickdarms einschneiden.
  6. Die Tiere während der Narkose direkt nach der Entnahme des Segments Anastomose durch Entbluten über Herzpunktion einschläfern. Bestätigen Sie tierischen Tod mit der Abwesenheit von Atmung, Bewegung und einem Herzschlag.
  7. Histochemische Färbungen wie Hämatoxylin und Eosin und Picro Sirius rot und immunhistochemische Färbungen mit Antikörpern gegen menschliche Mitochondrien, Ratte Endothelzellen (Anti-CD34) und Zellen des Immunsystems (CD3 +, CD163 +) durchführen.
  8. Die Folien für computerisierte Auswertung zu digitalisieren und die Tiergruppen zu vergleichen.

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Ergebnisse

Ein Flussdiagramm der Studie Darstellung ASC Blatt Kultur und das Verfahren der Kolon-Resektion und Anastomose ist in Abbildung 1dargestellt. Abbildung 2 zeigt ASC Blatt mikroskopische Morphologie und das makroskopische Erscheinungsbild der ASC-Blatt während und nach der Ablösung. Abbildung 3 zeigt die verschiedenen Stufen des ASC Blatt ablösen und Transplantation. Abbildung 4

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Diskussion

Anastomosen Leckage ist die am meisten Schwerwiegendes unerwünschtes Ereignis nach Kolon-Resektion mit eine primäre Anastomose. Optimale Techniken zur Vermeidung von Anastomosen Störung und Leckage fehlen noch. Lokale Anwendung eines Arrays von Biomaterialien wurde mit unterschiedlichen Ergebnisse25,26,27durchgeführt. Zelltherapien soll Gewebereparatur von Gewebeersatz oder die Stimulation der lokalen Heilung durch Parakrine Sek...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass die Forschung in Ermangelung jeder kommerziellen oder finanziellen Beziehung geführt wurde, die als ein potenzieller Interessenkonflikt ausgelegt werden könnte.

Danksagungen

Die Autoren sind dankbar, dass Prof. Dr. S.E.R Hovius, Dr. M.A.M. Mureau und alle Chirurgen der Abteilung für plastische Chirurgie für die Sammlung des subkutanen Fettgewebes. P. Sukho wird durch einen Zuschuss aus den Niederlanden Fellowship-Programm (NFP-12/435), während der Durchführung der Studie unterstützt. Y.M. Bastiaansen-Jenniskens wird unterstützt durch Zuschüsse aus niederländischen Arthritis Foundation (LP11).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
LG DMEMGibco, Life Technologies22320022ASC-Isolierung und -Kultur
Kollagenase Typ IGibco, Life Technologies17100-01ASC-Isolierung
RinderserumalbuminSigma-AldrichA9418ASC-Isolierung
Fötales RinderserumGibco, Life Technologies10270-106FBS, ASC-Isolierung und Kultur
3% Essigsäure Säure mit MethylenblauStemcell Technologies7060ASC Isolierung
GentamicinGibco, Life Technologies15750-037ASC Isolierung und Kultur
Ampothericin BGibco, Life Technologies15290-018ASC Isolierung und Kultur
Schüttler (Gallenkamp Environmental Shaker Modell 10X 400)Akribis ScientificF240ASC Isolierung
ZentrifugeHettichlabRotina380ASC-Isolierung und -Kultur
Phosphatpuffer KochsalzlösungGibco, Life Technologies14190-094PBS, ASC-Isolierung und -Kultur
Ascorbinsäure-2-phosphatSigma-AldrichA8960ASC-Isolierung und -Kultur
Humaner rekombinanter Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2AbD SerotecAF-100-15FGF2, ASC-Isolierung und -Kultur
Trypsin EDTAGibco, Life Technologies25200-056ASC-Kultur
DimethylsulfoxidSigma-AldrichD2650-5xDMSO, ASC Gefrieren
Thermo-responsive KulturschalenNunc Thermo wissenschaftliche174904ASC-Blattvorbereitung
Nicht resorbierbare geflochtene Seide 4/0B Braun21151042Chirurgie
Nicht resorbierbares Monofilament Polyamid 8/0B BraunG1118170die
Chirurgie Resorbierbare geflochtene Polyglykolsäure 5/0B BraunC1048207die Chirurgie

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Schlagwörter

Stammzellen aus FettgewebeASC Zellschicht Transplantationkolorektale Anastomosethermoreaktive KulturschalenAbl sung von ZellschichtenPr vention von AnastomosenleckagenIsolation der stromalen vaskul ren FraktionZellz hlung mit dem H mozytometer

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