Isolierung von Mastzellen Bauchfell abgeleitet und deren funktionelle Charakterisierung mit Ca2 +-imaging und Degranulation Assays

Volodymyr Tsvilovskyy; Alejandra Solis-Lopez; Kathrin Öhlenschläger; Marc Freichel

doi:10.3791/57222

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Methodenartikel

Isolierung von Mastzellen Bauchfell abgeleitet und deren funktionelle Charakterisierung mit Ca^{2 +}-imaging und Degranulation Assays

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DOI:

10.3791/57222

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4. Juli 2018

Volodymyr Tsvilovskyy¹ , Alejandra Solis-Lopez¹ , Kathrin Öhlenschläger¹ , Marc Freichel¹

¹Institute of Pharmacology, Ruprecht-Karls Heidelberg University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zu isolieren und kultivieren murinen peritonealen Mastzellen. Wir beschreiben auch zwei Protokolle für ihre funktionelle Charakterisierung: eine fluoreszierende Imaging der intrazellulären freien Ca^{2 +} Konzentration und eine Degranulation Assay anhand der kolorimetrischen Quantifizierung der veröffentlichten β-Hexosaminidase.

Zusammenfassung

Mastzellen (MCs), Rolle als Teil des Immunsystems, eine zentrale bei der Verteidigung der Gastgeber gegen mehrere Krankheitserreger und bei der Auslösung der allergischen Immunantwort. Die Aktivierung des MCs über die Vernetzung der Oberfläche IgE, hohe Affinität IgE-Rezeptoren (FcεRI) sowie durch die Stimulation von mehreren anderen Rezeptoren gebunden, initiiert den Aufstieg des freien intrazellulären Ca^{2 +} Levels ([Ca^{2 +}]_ich) Das fördert die Freisetzung von entzündlichen und allergischen Mediatoren. Die Identifizierung von molekularen Bestandteile dieser Signalwege beteiligt ist entscheidend für das Verständnis der Verordnung der MC-Funktion. In diesem Artikel beschreiben wir ein Protokoll für die Isolierung von murinen Bindegewebe Typ MCs von peritoneal Lavage und Anbau von peritonealen MCs (PMCs). Kulturen von MCs aus verschiedenen Knockout-Maus-Modellen durch diese Methode darstellen einen sinnvoller Ansatz zur Identifizierung von Proteinen in MC Signalwege beteiligt. Darüber hinaus wir auch beschreiben ein Protokoll für die einzelne Zelle Fura-2 imaging wie eine wichtige Technik für die Quantifizierung von Ca^{2 +} Signalisierung in MCs. Fluoreszenz-basierte Überwachung [Ca^{2 +}]_ich ein zuverlässiges und gängigen Ansatz zur studieren Sie Ca^{2 +} Veranstaltungen, darunter Kalzium Shop betrieben Eintrag, die von größter Bedeutung für die MC-Aktivierung-Signalisierung. Für die Analyse von MC Degranulation beschreiben wir einen β-Hexosaminidase-Release-Assay. Die Höhe der β-Hexosaminidase in das Kulturmedium abgegeben wird als Degranulation Marker für alle drei verschiedenen sekretorischen Teilmengen in MCs. β-Hexosaminidase beschrieben durch seine Reaktion mit einem Colorigenic Substrat in leicht quantifizierbar sind ein Mikrotiter-Platte kolorimetrischen Probe. Diese hoch reproduzierbare Technik ist kostengünstiger und erfordert keine spezielle Ausrüstung. Das angegebene Protokoll zeigt insgesamt eine hohe Ausbeute von MCs typischen oberflächenmarker MC zum Ausdruck zu bringen, anzeigen typischen morphologischen und phänotypischen Merkmale der MCs und hoch reproduzierbare Reaktionen auf Secretagogues in Ca^{2 +}- Nachweis Bildgebung und Degranulation Assays.

Einleitung

MCs spielen eine herausragende Rolle bei angeborenen und erworbenen Immunantwort. Insbesondere MCs teilnehmen an der Tötung von Krankheitserreger wie Bakterien und Parasiten, und auch potentiell toxischen endogene Peptide oder Komponenten der Gifte (für Überprüfung siehe Galli Et Al. 2008¹) abgebaut. Die physiologische Rolle von MCs in angeborenen und der adaptiven Immunität ist Gegenstand hitziger Debatten. Daher erfordern zahlreiche Daten Diskrepanzen in den Studien mit verschiedenen MC-defizienten Maus-Modellen eine systematische Neubewertung der immunologischen Funktionen von MCs über Allergie². Reife MCs si....