Methodenartikel

Hochdurchsatz-Identifizierung von synergistischen Wirkstoffkombinationen durch die Überlappung2 Methode

DOI:

10.3791/57241

⸱

21. Mai 2018

 , 
1Microbiology and Immunology Division, Department of Pathology, University of Utah

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Synergistische Wirkstoffkombinationen sind schwierig und zeitaufwändig, empirisch zu identifizieren. Hier beschreiben wir eine Methode zur Identifizierung und Validierung von synergistischen kleine Moleküle.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obwohl antimikrobielle Medikamente erheblich die Lebensdauer und die Qualität des Lebens im20. Jahrhundert zugenommen haben, droht Antibiotikaresistenz unsere gesamte Gesellschaft Fähigkeit, systemische Infektionen zu behandeln. In den Vereinigten Staaten allein töten Antibiotika-resistente Infektionen etwa 23.000 Menschen pro Jahr und rund 20 Milliarden US-Dollar im Gesundheitswesen zusätzliche Kosten. Ein Ansatz zur Bekämpfung der Antibiotikaresistenz ist die Kombinationstherapie, die in der kritischen frühen Phase der Infektion, besonders nützlich ist, bevor der infizierenden Organismus und seine Droge-Widerstand-Profil identifiziert wurden. Viele antimikrobielle Behandlungen verwenden Kombinationstherapien. Jedoch die meisten dieser Kombinationen sind additiv, d. h., dass die kombinierte Wirkung die gleiche wie die Summe der einzelnen antibiotische Wirksamkeit ist. Einige Kombinationstherapien sind synergistische: die kombinierte Wirkung ist viel größer als Additiv. Synergistische Kombinationen sind besonders nützlich, weil sie das Wachstum von Antibiotika resistente Stämme hemmen können. Diese Kombinationen sind jedoch selten und schwer zu identifizieren. Dies ist aufgrund der schieren Anzahl der Moleküle, die in gewissem Sinne paarweise getestet werden: eine Bibliothek mit 1.000 Moleküle hat 1 Million Kombinationsmöglichkeiten. So wurden Anstrengungen unternommen, Moleküle für Synergie vorherzusagen. Dieser Artikel beschreibt unsere Hochdurchsatz-Methode für die Vorhersage synergistische niedermolekularer Paare als Überlappung2 Methode (O2M) bekannt. O2M verwendet Muster aus chemisch-genetische Datasets Mutanten zu identifizieren, die überempfindlich auf jedes Molekül in einem synergistischen paar aber nicht auf andere Moleküle. Die braunen Lab nutzt dieses Wachstum Unterschied durch Ausführen eines Hochdurchsatz-Bildschirms für Moleküle, die das Wachstum von Mutant aber nicht Wildtyp-Zellen hemmen. Das Labor Arbeit zuvor identifizierten Moleküle, die mit dem Antibiotikum Trimethoprim und der antimykotische Wirkstoff Fluconazol mit dieser Strategie synergize. Hier präsentieren die Autoren eine Methode, um Bildschirm für neuartige synergistische Kombinationen, die für mehrere Mikroorganismen verändert werden kann.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Antibiotika-resistente Bakterien dazu führen, dass mehr als 2 Millionen Infektionen und 23.000 Todesfälle jährlich in den Vereinigten Staaten nach der CDC-1. Neue Behandlungen sind erforderlich, um diese Infektionen zu überwinden. Strategien zu identifizieren, diese neuen Behandlungen umfassen die Entwicklung neuer antimikrobielle Medikamente oder die Wiederverwendung von kleinen Molekülen, die für andere Bedingungen zur Behandlung von mikrobiellen Infektionen2,3,4zugelassen. Neue Drogeentdeckung ist jedoch sehr kostspielig und zeitaufwendig. Wiederverwendung von Drogen kann nicht identifizieren neuartiger Medikamente oder Drogen richtet sich an5,6. Unser Labor konzentriert sich auf eine dritte Strategie als synergistische Kombinationstherapien bekannt. Synergistische Kombinationen auftreten, wenn zwei kleine Moleküle zusammen eine Wirksamkeit größer als die additive Wirkung von ihrer individuellen Wirksamkeiten7haben. Darüber hinaus können synergistische Kombinationen gegen einen Erreger resistent gegen eines der kleinen Moleküle des Paares neben mit weniger unerwünschten Wirkungen Ziel, wodurch sie große potenzielle8,9wirksam, 10.

Synergistische Paare sind selten, auftreten bei etwa 4-10 % der Droge Kombinationen11,12,13. So sind traditionelle Techniken wie paarweisen Bildschirmen schwieriger und zeitaufwendiger, mit Tausenden von möglichen Kombinationen aus einer kleinen Bibliothek von hundert Moleküle. Synergistische Wechselwirkungen können darüber hinaus in der Regel von der Aktivität der Verbindungen14vorhergesagt werden. Jedoch entwickelten die Autoren einen Hochdurchsatz-Ansatz für Bildschirm für synergistische Paare, genannt die Überlappung2 Methode (O2M)12. Diese hier beschriebene Methode ermöglicht schnellere, effizientere Identifikation dieser synergistischen Paare. O2M erfordert den Einsatz eines bekannten synergistische Paares und ein Chemie-Genetik-Dataset. Chemie-Genetik-Datasets werden generiert, wenn eine Bibliothek von Knockout-Mutanten in Anwesenheit von vielen verschiedenen kleinen Molekülen angebaut wird. Wenn ein Molekül in einem bekannten synergistische paar den gleichen Phänotyp aus einer bestimmten ko-Mutante als das zweite synergistische Molekül induziert, sollten alle anderen kleines Molekül, das den Phänotyp aus diesem gleichen Mutant entlockt auch mit jedem Mitglied der bekannten synergize. synergistische Paar. Diese Begründung wurde in der braunen Lab verwendet, um synergistische Antibiotika wirksam gegen Escherichia coli (E. Coli) und synergistische pilzbefallverhütende Droge Paare aktiv gegen die pathogenen Pilzes Cryptococcus Neoformans (C. identifizieren Neoformans)11,12. O2M ist nicht nur anpassungsfähig für verschiedene Krankheitserreger, sondern ermöglicht für das Screening der großen Bibliotheken der Moleküle, synergistische Paare einfach und schnell zu identifizieren. Screening mit der genetischen Mutant bezeichneten O2M ermöglicht es uns, nur diesen kleinen Molekülen vorhergesagt für Synergie zu validieren. So würde eine 2.000-Molekül-Bibliothek paarweise testen Monate dauern, während gäbe es nur 20 Moleküle in dieser Bibliothek synergize voraussichtlich, Test für Synergie jetzt eine Frage von Tagen dauert. O2M erfordert keine Programmierkenntnisse und das benötigte Equipment gibt es in den meisten Labors oder zentrale Einrichtungen. Neben der Forscher Wirkstoffkombinationen interessieren ist O2M Analyse für jeden von Interesse, die hat einen Drogentest absolviert und will ihre Hits zu erweitern, indem Sie wichtige Wechselwirkungen zu identifizieren. Unten ist das Protokoll für synergistische kleine Moleküle in Bakterien zu identifizieren, sowie die Validierung der vorhergesagten synergistischen Interaktionen in bekannten Assays15,16.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Identifizierung Synergie Vorhersage Mutanten aus chemisch-Genetik Dataset durch die Überlappung2 Methode (O2M)

Hinweis: Dies ist die Methode zur Identifizierung von Synergie Vorhersage Mutanten mit der veröffentlichten Dataset von Nichols Et Al. 17 in E. Coli. Allerdings kann dies auf alle chemisch-Genetik-Dataset und Mikroorganismus erfolgen. Diese Datensätze enthalten eine Bibliothek von Ko-Mutanten gewachsen in Anwesenheit von mehr als 100 kleine Moleküle geben ein quantitatives Wachstum Punktzahl für jede Mutante in jedem kleinen Molekül. Eine synergistische Paar muss bekannt sein sollte, und es Wachstum Noten für beide kleine Moleküle, die in dem Dataset enthalten.

  1. Berechnen Sie die mittlere Wachstum Partitur und Standardabweichung für alle Mutanten in Anwesenheit einer einzigen Konzentration jedes kleine Molekül gewachsen.
    Hinweis: Dies kann mit jedem Tabellenkalkulations-Software. Die braunen Lab verwendet Excel und die Funktionen =AVERAGE(B3:B3981) und =STDEV(B3:B3981) für die Berechnungen der einzelnen Spalten kleiner Moleküle.
    1. Berechnen Sie die Mittel und die Standardabweichungen aus jeder Spalte kleiner Moleküle, obwohl diese Ausrichtung unterschiedlich sein kann, wenn ein anderes Dataset verwenden.
  2. Z-Scores für jede Konzentration kleiner Moleküle mit der gleichen Dataset von Nichols Et al.zu berechnen. 17 in einem Tabellenkalkulationsprogramm. Hierzu werden negative Z-Scores Z(2.5) = bedeuten - 2,5 * Standardabweichung und positive Z-Scores werden Z(2.5) = Mittelwert + 2,5 * Standardabweichung.
  3. Bestimmen Sie, welche gen Mutanten enthalten bedeutende Z-Scores in den kleinen Molekülen, aus denen das bekannte synergistische Paar, als sicher zu betrachten alle Konzentrationen von diesen Molekülen besteht. Wenn das Wachstum, das Ergebnis einer Mutante ist weniger als die negative Z (2.5) Punkten oder größer als die positive Z (2.5) Punktzahl für dieses kleine Molekül ist, ist es als signifikant betrachtet.
  4. Festzustellen Sie, ob eines der bedeutenden gen Mutanten zu einem Operon gehören.
    Hinweis: Für E. Coli, die Autoren empfehlen "Ecoli Wiki" für Informationen bezüglich wenn Gene als Bestandteil einer Polycistronic RNA transkribiert werden.
  5. Gen/Operon Mutanten, die für die Mehrzahl der kleinen Moleküle von Interesse bei verschiedenen Konzentrationen sind zu identifizieren (z. B.., bei der Suche nach Molekülen, die mit dem Antibiotikum Trimethoprim synergize identifizieren Mutanten, die eine signifikante Z zeigen Ergebnis, wenn in Gegenwart von Trimethoprim und ihren bekannten synergistischen Partnern wie Sulfamethizole oder Sulfamethoxazole gewachsen). Dies sind vermeintliche Synergie Vorhersage Mutanten.

(2) Vorhersage von Synergizers innerhalb der Chemie-Genetik-Dataset von O2M

  1. Rückkehr in das Dataset17, identifizieren Sie jede Konzentration von kleines Molekül, das eine deutliche Zuwächse Punktzahl aus der Synergie Vorhersage Mutante entlockt. Dies geschieht anhand der Z-Scores berechnet für jede Konzentration von kleinen Molekülen. Wiederum ist ein signifikantes Wachstum Ergebnis kleiner als der negativen Z-Score oder größer als die positive Z-Score für diese Konzentration kleiner Moleküle.
    Hinweis: Wenn ein Molekül auch nur eines ihrer Konzentrationen angezeigt wird, wird das Molekül eine prognostizierte Synergizer betrachtet. Jedes Molekül, das kein deutliches Wachstum Partitur entlocken ist eine vorhergesagte nicht Synergizer.

3. Überprüfung der vorhergesagten synergistische Wechselwirkungen

  1. Suche nach minimalen inhibitorischen Konzentration (MIC) der prognostizierten Synergizers.
    1. Wachsen einer Übernachtung Kultur von E. Coli in M9 minimal Media bei 37 ° C.
      Hinweis: Jede Nacht Kultur kann in angemessen definierte Medium für den Organismus von Interesse gewachsen. Die braunen Lab empfiehlt nicht rich-Media wie LB oder YPD. M9 minimalste Medien besteht aus 10,5 g/L M9 Brühe, 0,2 % Casamino Säuren, 0,1 M CaCl2, 0,4 % Glukose, 1 M MgSO4, Nikotinsäure 0,25 % und 0,33 % Thiamin in H2O.
    2. Wenn keine MHK-Daten für Erreger von Interesse in der Literatur nach Erhalt die kleinen Moleküle gefunden wird in Dimethyl Sulfoxid (DMSO) in einer hohen Konzentration auflöst (> 10 mg/mL).
    3. Fügen Sie mithilfe einer 96-Well-Platte 100 µL der M9 Medien in jede Vertiefung. Fügen Sie eine zusätzliche 100 µL der M9 Medien in Spalte 1, so es eine Gesamtmenge von 200 µL enthält.
    4. Fügen Sie eine beliebige Anzahl (~ 10 µL) konzentrierte niedermolekularer Lösung in Spalte 1. Ein kleines Molekül pro Bohrloch von Spalte 1 (8 kleine Moleküle pro Platte).
      Hinweis: Dies sind die kleinen Moleküle des Interesses, die voraussichtlich synergize. Das braune Labor fügt in der Regel 10 µL der hochkonzentrierten niedermolekularer Lösung, die unter dem Betrag von 100 % DMSO ist, die E. Colihemmen können.
    5. Sobald die kleinen Moleküle hinzugekommen sind, verdünnen Sie die kleinen Moleküle auf der x-Achse der Platte. Nehmen Sie 100 µL Lösung von Spalte 1, in Spalte 2 und vermischen. Nehmen Sie 100 µL aus Spalte 2, Spalte 3 und vermischen. Fortfahren Sie, bis 100 µL in Spalte 11 platziert sind. Spalte 11 mischen, dann nehmen Sie 100 µL aus der Spalte und verwerfen. Lassen Sie die Spalte 12 mit nur Medien, die Daten zu normieren.
    6. Die Platte zu impfen. Erhalten Sie die optische Dichte (OD600) von einer Übernacht-Kultur. Bereiten Sie eine Lösung mit der Kultur und M9-Medien auf einem OD-600 von 0,002 (oder entsprechende Konzentration, die 500 Zellen/µL für den gewünschten Organismus von Interesse darstellt). Pipette 2 µL Kulturlösung in jede Vertiefung der Platte, so gibt es 1.000 Zellen pro Bohrloch.
    7. Schütteln Sie die Platte und erhalten Sie die OD600 für die 0 h lesen. Lassen Sie die Platte bei 37 ° C für 24 Std. erhalten die OD600 für die 24 h lesen wachsen.
      Hinweis: Verwendung geeigneten Anbaubedingungen für andere Organismen von Interesse.
    8. Berechnen Sie die Netto-Wachstum für jeden gut mit einem Tabellenkalkulationsprogramm.
    9. Durchschnitt der Nettozuwachs der Spalte 12 im Durchschnitt keine Droge Wachstum zu erhalten. Die weiteren Bohrungen auf den Durchschnitt der kein Medikament Wachstum mit einem Tabellenkalkulationsprogramm zu normalisieren. Suchen Sie nach jeder gut mit weniger als 10 % Wachstum, die MIC90 zu identifizieren. Alle gut mit weniger als 50 % Wachstum zeigt die MIC50. Berechnen Sie die Konzentration der kleinen Molekül in den Brunnen.
  2. Schachbrett-Assays für die synergistische Wechselwirkungen
    1. Wachsen Sie eine Übernachtung Kultur von E. Coli in M9 minimal Medien wie vor.
      Hinweis: Verwendung geeigneten Anbaubedingungen für andere Organismen.
    2. Jede Vertiefung einer 96-well-Platte und eine zusätzliche 100 µL in Spalte 1 100 µL der M9 Medien hinzufügen.
    3. Fügen Sie das Test kleines Molekül (~ 8 x MIC) zueinander auch in Spalte 1 und fügen Sie verdoppeln die Konzentration (~ 16 x MIC) gut a1 (ein kleines Molekül getestet pro Platte).
      Hinweis: Dieser Betrag ergibt sich aus der MIC Test abgeschlossen vor und unterscheidet sich für jede mögliche Synergizer.
    4. Erstellen Sie eine Farbverlauf Verdünnung auf der x-Achse von 100 µL aus Spalte 1 und Spalte 2. Fortfahren Sie, bis 100 µL, Spalte 11 hinzugefügt wird. Mischen, dann 100 µL aus Spalte 11 nehmen und entsorgen. Spalte 12 (Abbildung 1A) keines Medikament hinzufügen.
    5. Das zweite Medikament Gefälle über die y-Achse für die Eingabe Droge eingerichtet. Fügen Sie 100 µL Medium mit 2 x MIC input Moleküls in Zeile A. Mix und als vor dem verdünnen, wobei 100 µL aus Zeile A und Platzierung in B. weiter bis 100 µL in Zeile G. Mix platziert wird, nehmen Sie 100 µL und entsorgen, Gewährleistung nicht fügen Sie jede Eingabe Droge in Reihe H. Dadurch können Zeilen-H und 12 einzelne Mikrofone der Droge paar getestet (Abbildung 1 b) enthalten.
    6. Die Platte zu impfen. Fügen Sie 2 µL einer E. Coli -Kultur von OD600 0,002 in jede Vertiefung (1.000 Zellen pro Well).
    7. Messen Sie die OD600 von jedem Bohrloch in der Platte für die 0 h Lesung.
    8. Inkubieren Sie die Platte für 24 h bei 37 ° c
    9. Messen Sie die OD600 von jedem Bohrloch um 24 Uhr.
  3. Berechnung des fraktionierten hemmende Konzentration Index (FICI) von Schachbretter
    1. Berechnen Sie die Netto-Wachstum für jede Vertiefung der Platte durch Subtraktion der OD600 um 0 Uhr die OD600 bei 24 h in einem Tabellenkalkulationsprogramm.
    2. Das Wachstum in der Software durch Teilung jedes gut durch gut H12, enthält kein kleines Molekül zu normalisieren.
    3. Finden Sie die MIC90 des Eingabe-Moleküls in Spalte 12 und die MIC90 von potenziellen Synergist in Reihe H.
    4. Suchen Sie nach alle Brunnen, die 90 % Wachstum zu hemmen.
    5. Berechnen Sie die FICI90 für die gut, die entweder die niedrigste unten (synergistische) oder oben (antagonistisch) höchste beide MIC90 Werte, unter Verwendung der Gleichung:
      FIC-Indexformel, Gleichung für die Analyse von Arzneimittelwechselwirkungen, Methode zur Quantifizierung von Synergien.
    6. Betrachten alle FICI ≤ 0,5 als synergistische und FICI ≥ 4 als antagonistisch (Abbildung 2).
      Hinweis: Dies geht auch mit MIC50 (50 % Hemmung des Wachstums), ein FICI50, basierend auf diesen Werten MIC zu bekommen.
  4. Bliss-Unabhängigkeit-Assay
    Hinweis: Bliss Unabhängigkeit wird mit jeder möglichen Synergist geführt, die nicht über ein Mikrofon auf eigene.
    1. Wie zuvor wachsen Sie eine Nacht Kultur von E. Coli in M9 Medien bei 37 ° C.
      Hinweis: Können geeignete Wachstumsbedingungen für andere Organismen von Interesse in diesem Schritt wiederverwendet werden.
    2. Bereiten Sie 96-Well Platten für die Prüfung der potentiellen synergistischen Molekül, das Eingabe-Molekül und die Kombination einer unbehandelten Kontrolle vor.
    3. Erstellen Sie die potenziellen Synergist Platte durch Zugabe von 50 µL der M9 Medien in jede Vertiefung. Jede Vertiefung einer Zeile fügen Sie 50 µL der Medien mit einer bestimmten Konzentration (10 µM oder 100 µM hinzu) von den potenziellen Synergist. Testen Sie 8 Moleküle pro Platte.
    4. Erstellen Sie die Eingabe-Molekül-Platte durch Zugabe von 50 µL der Medien in jede Vertiefung. Fügen Sie 50 µL mit 4 X MIC input Droge in jede Vertiefung in Spalte 1. Erstellen Sie eine Farbverlauf Verdünnung entlang der x-Achse ähnlich MIC Platten, wobei 50 µL aus Spalte 1, Dispergieren und mischen in Spalte 2. Fortfahren Sie, bis Spalte 12, 50 µL aus Spalte 12 Entsorgung. Fügen Sie eine zusätzliche 50 µL der Medien in jede Vertiefung, also Ende insgesamt für jedes gut 100 µL.
    5. Fügen Sie die Kombination Platte mithilfe einer 96-well-Platte erstellen hinzu, 50 µL der Medien in jede Vertiefung. Fügen Sie 50 µL mit 4 X MIC input Droge in jede Vertiefung in Spalte 1. Verdünnen Sie entlang der x-Achse ähnlich wie MIC Platten, wobei 50 µL aus Spalte 1, Dispergieren und mischen in Spalte 2. Auch weiterhin diese den ganzen Weg bis Spalte 12, 50 µL aus Spalte 12 Entsorgung. Fügen Sie 50 µL Medium, das die potenziellen Synergisten bei 10 µM oder 100 µM in jede Vertiefung einer Zeile enthält. Auch hier sollte eine Konzentration oder Medikament pro Zeile.
    6. Erstellen der unbehandelten Kontrolle durch Zugabe von 100 µL der M9 Medien in alle Vertiefungen der Platte.
    7. Impfen Sie alle Platten durch Zugabe von 2 µL der Bakterienkultur mit einem OD-600 von 0,002 oder 1.000 Zellen in jede Vertiefung als vor.
    8. Messen Sie die OD600 von jedem Bohrloch bei 0 und 24 h.
  5. Berechnung der Glückseligkeit Unabhängigkeit Gäste
    1. Berechnen Sie die Netto-Wachstum für jede Vertiefung der Platte durch Subtraktion der OD600 um 0 Uhr vom Wachstum um 24 Uhr mit einem Tabellenkalkulationsprogramm.
    2. Normalisieren der Brunnen, das durchschnittliche Wachstum von der keine Droge-Platte in einem Tabellenkalkulationsprogramm.
    3. Berechnen Sie Tabellenkalkulations-Software verwenden, die Hemmung durch Subtrahieren der Nettozuwachs von 1.
    4. Durchschnitt der Spalten in der Steuerelement-Platte, die nur die Eingabe Gradienten in der Tabellenkalkulations-Software enthalten.
    5. Berechnen Sie die Glückseligkeit Score für jede Vertiefung durch die Gleichung:
      Bliss-Score = (auch X + Eingabespalte X) – kombiniert gut X
    6. Suchen Sie nach negativen Punktzahlen in Brunnen unter die MIC90 des Eingangs.
      Hinweis: Negative Resultate über mehrere Konzentrationen würde eine synergistische Interaktion zeigen.

4. Hochdurchsatz-Screen mit Synergy Vorhersage Mutanten, neuartige synergistische Paare zu identifizieren

  1. Synergie-Vorhersage-Mutanten zu identifizieren
    Hinweis: Schritt 1.5 identifiziert vermeintliche Synergie Vorhersage Mutanten. Hier bestimmen wir, welche diese Mutanten funktioniert am besten in einem Hochdurchsatz-Bildschirm für synergistische Drogen. Dieser Assay in einer Bioscreen-Maschine durchgeführt, aber 96-well-Platte-Leser sollte auch akzeptabel.
    1. Wachsen Sie jede vermeintliche Synergie Vorhersage Mutanten und Wildtyp Zellen in M9 minimal Medien.
    2. Richten Sie die 100 gut Waben-Platte (oder 96-well-Platte) mit dem entsprechenden Wachstumsmedium, Wachstumsmedium + Eingabe Medikament, Wachstumsmedium + bekannte synergistische Partner der Eingabe Droge und Wachstumsmedium + bekannte nicht synergistische Droge. Sicherstellen Sie, dass Fahrzeug Steuerelemente enthalten.
      Hinweis: Wir empfehlen, dass vier Brunnen für jede Belastung/Wirkstoffkonzentration replizieren.
    3. Impfen Sie 1.000 Zellen pro Bohrloch, einschließlich der leeren Kontroll-Vertiefungen.
    4. 48 h bei 37 ° C mit schütteln, zu wachsen und alle 20 min OD600 zu lesen.
    5. Bestimmen Sie Medikament Konzentration und Zeit-Punkt, der das größte Wachstum Unterschied zwischen Wildtyp und Synergie Vorhersage mutierten Zellen in Anwesenheit der Eingabe Medikament und seine bekannten synergistische Partner zeigt. An der optimalen Zeitpunkt und Konzentration sollte nicht viel Wachstum Unterschied zwischen Wildtyp und Synergie Vorhersage mutierten Zellen wenn in Gegenwart von Drogen bekannt Handlungsfähigkeit nicht synergistisch mit dem Eingang Medikament (Abbildung 3) gewachsen.
  2. Hochdurchsatz-Bildschirm für synergistische Drogen
    1. Wachsen Sie Wildtyp Zellen und Synergie Vorhersage mutierten Zellen in M9 minimal Medien.
      Hinweis: Verwenden Sie geeignete Wachstumsmedium für Organismus von Interesse.
    2. Fügen Sie Medikamente aus der Bibliothek hinzu, um Medien so dass jeder auch die 100 µL Medien mit kleinen Molekülen in festgelegten Konzentration enthält, die im vorherigen Schritt ermittelt wurde. Sind leere Brunnen (ohne Zellen) und Brunnen mit Fahrzeug-Kontrollen (ez., DMSO) zu einer Wachstumshemmung durch das Medikament Verdünnung Fahrzeug entfallen.
      1. Bereiten Sie mindestens vier Fahrzeug-Kontroll-Vertiefungen pro Platte, im Idealfall verstreut über die Platte gut Positionseffekte berücksichtigen. Wenn Assays variabel sind, dann gehören Sie mindestens eine Fahrzeugkontrolle auch pro Zeile/Spalte und verwenden Sie jede Zeile/Spalte Kontrolle sowie die Steuerung, um Z-Scores für jede Zeile/Spalte anstatt für eine ganze Platte (Schritt 4.2.5) zu berechnen.
    3. Fügen Sie 2 µL der Kultur in jede Vertiefung als vor. (Eine Platte für Wildtyp-Bakterien und eine Platte für die vorhergesagten Synergie mutierten Bakterien).
    4. Beurteilen Sie die OD600 bei 0 und 18 h für E. Coli oder 48 h für C. Neoformans.
    5. Berechnen Sie Tabellenkalkulations-Software verwenden, die Netto-Wachstum durch Subtraktion der OD-600 von leeren Brunnen aus der Fahrzeug-Kontroll-Vertiefungen. Brunnen mit einem Z-Score von-2,5 identifizieren (Z-Score = Mittelwert - 2,5 * Standardabweichung). Diese Vertiefungen enthalten ein potenzieller Synergist kleines Molekül.
    6. Validieren Sie Bildschirm-Hits mit den Methoden in Schritt 3 beschrieben.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Schachbrett-Assays sind eine semi-quantitative Methode zur Messung von synergistischer Interaktionen. Das Endergebnis ausgegeben, FICI, bestimmt wenn eine Arzneimittelkombination synergistische (FICI ≤0.5) gilt, nicht-wechselwirkenden (0,5 < FICI < 4), oder antagonistischen (FICI ≥4.0). Abbildung 1 veranschaulicht, wie die Droge Gradienten in einem Schachbrettmuster-Assay einrichten. Abbildung 2 veranschaulicht gemeinsame E...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Synergistische niedermolekularer Paare können ein mächtiges Werkzeug in der Behandlung von mikrobiellen Infektionen, doch sie haben nicht ihre volle klinische Potenzial erreicht, weil synergistische Paare schwierig zu identifizieren sind. Dieses Dokument beschreibt eine Methode zur Identifizierung von synergistischen Paare viel schneller als einfache paarweisen Kombinationen. Durch die Verwendung chemischer Genetik Datasets, identifiziert O2M Mutanten mit Gen-Knockouts, die dann als einer Anzeige auf Bildschirm große Bib...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde unterstützt durch einen Start-Zuschuss von der Abteilung für Pathologie, Universität von Utah, J.C.S.B.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Bioscreen CInstrumentWachstumskurven USA
Synergy H1InstrumentBioTek
M9 BouillonReagenzAmrescoJ863-500G
Casamino SäurenReagenzFisher ScientificBP1424-500
GlukosereagenzSigmaG7021-10KG
NikotinsäureReagenzAlfa AesarA12683
Thiamin-ReagenzAcros Organics148991000
CaCl2 Dihydrat-ReagenzFisherC79-500
MgSO4 Heptahydrat-ReagenzFisherM63-500
Beispiele für chemisch-genetische Datensätzesind Nichols et al., Cell, 2011, Brown et al., Cell, 2014 und andere im Text zitiert.
Trimethoprim (Beispiel für ein Eingangsmedikament; jedes kann verwendet werden)ReagenzFisher ScientificICN19552701
Sulfamethoxazol (Beispiel für ein Testmedikament; jedes kann verwendet werden)ReagenzFisherScientific ICN15671125

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Michael, C. A., Dominey-Howes, D., Labbate, M. The Antimicrobial Resistance Crisis: Causes, Consequences, and Management. Front Public Health. 2, 145(2014).
  2. Butts, A., Krysan, D. J. Antifungal Drug Discovery: Something Old and Something New. PLOS Pathogens. 8 (9), e1002870(2012).
  3. Roemer, T., Krysan, D. J. Antifungal Drug Development: Challenges, Unmet Clinical Needs, and New Approaches. Cold Spring Harb Perspect Med. 4 (5), a019703(2014).
  4. Oprea, T. I., Mestres, J. Drug Repurposing: Far Beyond New Targets for Old Drugs. AAPS J. 14 (4), 759-763 (2012).
  5. Scannell, J. W., Blanckley, A., Boldon, H., Warrington, B. Diagnosing the decline in pharmaceutical R&D efficiency. Nat Rev Drug Discov. 11 (3), 191-200 (2012).
  6. Rangel-Vega, A., Bernstein, L. R., Mandujano-Tinoco, E. A., García-Contreras, S. J., García-Contreras, R. Drug repurposing as an alternative for the treatment of recalcitrant bacterial infections. Front Microbiol. 6, 282(2015).
  7. Torella, J. P., Chait, R., Kishony, R. Optimal Drug Synergy in Antimicrobial Treatments. PLoS Comput Biol. 6 (6), e1000796(2010).
  8. Cowen, L. E., et al. Harnessing Hsp90 function as a powerful, broadly effective therapeutic strategy for fungal infectious disease. P Natl Acad Sci. 106 (8), 2818-2823 (2009).
  9. Zuo, G. -Y., et al. Synergistic Antibacterial and Antibiotic Effects of Bisbenzylisoquinoline Alkaloids on Clinical Isolates of Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA). Molecules. 16 (12), 9819(2011).
  10. Jia, J., et al. Mechanisms of drug combinations: interaction and network perspectives. Nat Rev Drug Discov. 8 (2), 111-128 (2009).
  11. Wambaugh, M. A., Shakya, V. P. S., Lewis, A. J., Mulvey, M. A., Brown, J. C. S. High-throughput identification and rational design of synergistic small-molecule pairs for combating and bypassing antibiotic resistance. PLOS Biol. 15 (6), e2001644(2017).
  12. Brown, J. C. S., et al. Unraveling the biology of a fungal meningitis pathogen using chemical genetics. Cell. 159 (5), 1168-1187 (2014).
  13. Cokol, M., et al. Systematic exploration of synergistic drug pairs. Mol Syst Biol. 7, 544-544 (2011).
  14. Borisy, A. A., et al. Systematic discovery of multicomponent therapeutics. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (13), 7977-7982 (2003).
  15. Tang, J., Wennerberg, K., Aittokallio, T. What is synergy? The Saariselkä agreement revisited. Front Pharmacol. 6, 181(2015).
  16. Hsieh, M. H., Yu, C. M., Yu, V. L., Chow, J. W. Synergy assessed by checkerboard. A critical analysis. Diagn Microbiol Infect Dis. 16 (4), 343-349 (1993).
  17. Nichols, R. J., et al. Phenotypic Landscape of a Bacterial Cell. Cell. 144 (1), 143-156 (2011).
  18. Chandrasekaran, S., et al. Chemogenomics and orthology-based design of antibiotic combination therapies. Mol Syst Biol. 12 (5), (2016).
  19. Pradhan, A., et al. Chemogenomic profiling of Plasmodium falciparum as a tool to aid antimalarial drug discovery. Sci Rep. 5, 15930(2015).
  20. Pethe, K., et al. A chemical genetic screen in Mycobacterium tuberculosis identifies carbon-source-dependent growth inhibitors devoid of in vivo efficacy. Nat Commun. 1 (5), 1-8 (2010).
  21. Diezmann, S., Michaut, M., Shapiro, R. S., Bader, G. D., Cowen, L. E. Mapping the Hsp90 Genetic Interaction Network in Candida albicans Reveals Environmental Contingency and Rewired Circuitry. PLoS Genetics. 8 (3), e1002562(2012).
  22. Robbins, N., et al. An Antifungal Combination Matrix Identifies a Rich Pool of Adjuvant Molecules that Enhance Drug Activity Against Diverse Fungal Pathogens. Cell reports. 13 (7), 1481-1492 (2015).
  23. Wildenhain, J., et al. Prediction of Synergism from Chemical-Genetic Interactions by Machine Learning. Cell Syst. 1 (6), 383-395 (2015).
  24. Spitzer, M., et al. Cross-species discovery of syncretic drug combinations that potentiate the antifungal fluconazole. Mol Syst Biol. 7, 499-499 (2011).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

Hochdurchsatz ScreeningCheckerboard AssayFICI Wertantimikrobielle Resistenzchemisch genetische Datens tzeWildtyp ZellenSynergie Vorhersage MutantenMessung der optischen Dichte

Verwandte Artikel