Method Article

Eine einfache Methode zur Isolierung der Sojabohne Protoplasten und Anwendung auf vorübergehende Genexpressionsanalysen

DOI:

10.3791/57258

⸱

January 25th, 2018

 , 
1Department of Biology, California State University, Northridge

In This Article

Summary

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Wir entwickelten ein einfaches und effizientes Protokoll für die Herstellung großer Mengen von Soja Protoplasten, komplexe regulatorische und Signalisierung Mechanismen in lebenden Zellen zu studieren.

Abstract

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Sojabohne (Glycine max (L.) GESEG.) ist eine wichtige Kulturarten und eine Hülsenfrucht-Modell für das Studium der genetischen und biochemischen Wege geworden. Daher ist es wichtig, eine effiziente transiente gen Expressionssystems in Soja zu etablieren. Hier berichten wir ein einfaches Protokoll für die Vorbereitung der Sojabohne Protoplasten und seinen Antrag auf vorübergehende Funktionsanalysen. Wir fanden, dass große Mengen an hochwertigen Protoplasten jungen unifoliate Blätter aus Soja-Keimlingen führte. Durch die Optimierung der PEG-Kalzium-vermittelten Transformationsmethode, erreichten wir hohe Transformationseffizienz mit Soja unifoliate Protoplasten. Dieses System bietet ein effiziente und vielseitige Modell für die Prüfung von komplexen regulatorischen und Signalisierung Mechanismen im live Soja Zellen und können helfen besser zu verstehen, diverse zelluläre, Entwicklungsstörungen und physiologische Prozessen von Leguminosen.

Introduction

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Protoplasten sind Pflanzenzellen, die Zellwände entfernt haben. Sie pflegen die meisten Funktionen und Aktivitäten von Pflanzenzellen, Protoplasten sind ein gutes Modellsystem zur Beobachtung und Auswertung der vielfältigen zelluläre Ereignisse, und wertvolle Tools für die somatische Hybridisierung1 zu studieren und Werk Regeneration2. Protoplasten wurden für Werk Verwandlung3,4,5, ebenfalls weit verbreitet genutzt, da Zellwände sonst den Durchgang von DNA in die Zelle blockieren würde. Protoplasten besitzen einige der physiolog....

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Protocol

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1. Wachstum der Pflanzen

  1. Säen von 5-10 Soja (Williams 82) in einem 13 cm-Topf im Gewächshaus unter Bedingungen der langen Tage (16 h Licht bei 1.500 µmol m-2 s-1) bei 25 ° C auf die benutzerdefinierte Erdmischung für Soja (1:1:1 Verhältnis von Erde, Perlite und Torpedo Sand).

2. Vorbereitung von Plasmid DNA

  1. Mit einem sterilen Pipettenspitze oder Zahnstocher, wählen Sie eine einzelne Kolonie oder gefrorenen Glycerin Lager von E. Coli tragen das Plasmid enthält das gen des Interesses und in 20 mL Luria-Bertani (LB) flüssigen Medium mit geeigneten Antibiotika in ein 50 mL Fläschchen zu i....

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Results

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Verschiedene Organe des 10 - Tage alten Sojabohnen für Vorbereitung der Protoplasten (Abbildung 1) getestet wurden und Erträge beobachtet, unter dem Mikroskop (Abbildung 2). Zellwände aus Keimachse und Epicotyl waren kaum verdaut, und einige Zellen geblieben (Abbildung 2 b, 2 C) miteinander verbunden. Im Keimblatt (Abb. 2D) und Wurzel (

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Discussion

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Dieses Protokoll für die Isolierung von Soja Protoplasten und die Anwendung auf transiente Expression Studien wurde gründlich getestet und funktioniert sehr gut in unserem Labor. Die Verfahren sind einfach und leicht und erfordern ordentliche Ausrüstung und minimalen Kosten. Unser Protokoll liefert große Mengen an gleichbleibende hohe Qualität Protoplasten im Vergleich zu bereits gemeldeten Methoden34,35,36,

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Disclosures

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Acknowledgements

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Diese Arbeit wurde von der Pflanze Genome Research Program von der National Science Foundation (NSF-PGRP-IOS-1339388) unterstützt.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
MESSigma AldrichM8250-100G
Cellulase CELFWorthington Biological CorporationLS002611
Pectolyase Y-23BioWorld9033-35-6
CELLULASE "ONOZUKA" R-10Yakult10g
MACEROZYME R-10Yakult10g
MannitolICN Biomedicals152540
CaCl2FisherC79-500g
BSANEB R3535S
DTTSigma AldrichD5545-5G
NaClSigma AldrichS7653-1kg
KClFisherP217-500g
MgCl2Sigma AldrichM8266-100g
PEG4000Fluka81240
Nylon MeshCarolina652222N
GewebekulturplattenUSA ScientificCC7682-7506
RasierklingenFisher12-640
Hämazytometerhausserscientific1483
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27104
EZNA Plasmid Miniprep KitOmegaD6942-01
GeneJET Plasmid Miniprep KitThermo ScientificK0502
Zentrifuge 5810eppendorf5811000827
Zentrifuge 5424eppendorf22620401
Jencons Powerpette Plus PipettierhilfeJencons14526-202
Zeiss 710 KonfokalmikroskopZeissN/A
Antihaftbeschichtete, RNasefreie Mikrofuge-Röhrchen, 1,5 mLAmbionAM12450
15 mL ZentrifugenröhrchenDenvilleC1018-P
50 mL ZentrifugenröhrchenDenvilleC1060-P
Serum für NeugeboreneThermoScientific 16010159
ErdeIngram's Nursery
PerlitVigoro100521091
Torpedo SandJKS Ventures
LB Brühe, Lennox (Pulver)FisherBP1427-500

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Melchers, G., Labib, G. Somatic hybridisation of plants by fusion of protoplasts. Mol. Gen. Genet. 135 (4), 277-294 (1974).
  2. Gresshoff, P. M. In vitro culture of white clover: callus, suspension, protoplast culture, and plant regeneration. Bot. Gaz. 141 (2), 157-164 (1980).
  3. Lörz, H., Baker, B., Schell, J. Gene transfer to cereal cells mediated by protoplast transformation. Mol. Gen. ....

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