Stereotaktischen Chirurgie für Genmanipulation in Striatale Zellen des Neugeborenen Mäusegehirnen

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein Protokoll der stereotaktischen Operation mit einer hausgemachten Kopf fixiert Vorrichtung zur microinjecting Reagenzien in das Striatum von Neugeborenen mäusegehirnen. Diese Technik ermöglicht Genmanipulation in neuronalen Zellen bestimmter Regionen des Neugeborenen mäusegehirnen.

Zusammenfassung

Viele Gene werden im embryonalen Gehirn exprimiert, und einige von ihnen werden kontinuierlich in das Gehirn nach der Geburt ausgedrückt. Für solche anhaltend exprimierten Gene können sie Funktion, um den Entwicklungsprozess und/oder physiologische Funktion im neonatalen Gehirn regulieren. Um neurobiologische Funktionen bestimmter Gene im Gehirn zu untersuchen, ist es unerlässlich, Gene im Gehirn zu inaktivieren. Hier beschreiben wir eine einfache stereotaktischen Methode um gen-Expression im Striatum von transgenen Mäusen bei Neugeborenen Zeitfenster zu inaktivieren. AAV-eGFP-Cre Viren wurden in das Striatum Ai14 Reporter-gen Mäuse an postnatalen Tag (P) 2 von stereotaktischen Gehirnchirurgie mikroinjiziert. Die TdTomato-Reporter-gen-Expression wurde im P14 Striatum, was darauf hindeutet, dass eine erfolgreiche Cre-LoxP vermittelte DNA Rekombination in AAV ausgestrahlt Striatale Zellen erkannt. Wir weiter validiert diese Technik durch microinjecting Viren AAV-eGFP-Cre in P2Foxp2^fl/fl -Mäuse. Doppelte Kennzeichnung der GFP und Foxp2 zeigte, dass die GFP-positiven Zellen Foxp2-Immunoreactivity in P9 Striatum, was den Verlust des Foxp2-Proteins in AAV-eGFP-Cre ausgestrahlt Striatale Zellen fehlte. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse eine wirksame genetische Löschung durch stereotaxically mikroinjiziert AAV-eGFP-Cre-Viren in bestimmten neuronalen Populationen im neonatalen Gehirn von transgenen Mäusen Floxed. Abschließend bietet unsere stereotaktischen Technik eine einfache Plattform für Genmanipulation in Neugeborenen mäusegehirnen. Die Technik kann nicht nur Gene in bestimmten Regionen des neonatalen Gehirn Löschen verwendet werden, aber es kann auch verwendet werden, um pharmakologische Medikamente, neuronaler Tracer, gentechnisch veränderten optogenetik und Chemogenetics Proteine, neuronaler Aktivität Indikatoren zu injizieren und anderen Reagenzien in das Striatum von Neugeborenen mäusegehirnen.

Einleitung

Moderne Studien der Struktur und Funktion des Gehirns erfordern in der Regel genetische Manipulation bestimmter Gene in neuronalen Zellen. Um die Funktionen der verschiedenen Gene, Transgene Mäuse tragen mutierten Allele, einschließlich Sonde wurden routinemäßig Knockout und Knock-in Allele generiert. Stereotaktischen Gehirnchirurgie für Erwachsene Nager ist eine Standardmethode zu liefern lokal Medikamente, Viren, Tracer und andere Reagenzien auf bestimmte Regionen von Nagetier Gehirne^1,2. Anwendung der stereotaktischen Gehirnchirurgie mit transgenen Mäusen erlaubt, die Genfunktion und neuronale Aktivität in ....

Protokoll

Die tierischen Protokolle, die hier beschrieben wurden von Animal Care und Nutzung Ausschüsse der National Yang-Ming University genehmigt.

1. Vorbereitung des Inhabers für die Neugeborenen Welpen in der stereotaktischen Vorrichtung

1. Der Kopf Fach zu machen: Schneiden Sie unten eine 1,5 mL Zentrifugenröhrchen (15 mm lang) in die Form, die den Kopf des Neugeborenen Welpen passt durch Entfernen von 1/5 der Wand des Rohres.
2. Nehmen Sie eine Pipette Tip Box mit der richtigen Größe, die mit dem Sockel des stereotaktischen Apparats passt, und entfernen Sie die obere Abdeckung. Befestigen Sie das Kopf Tablett in Schritt 1.1 und ei....

Ergebnisse

Für den ersten Satz des Experiments mikroinjiziert wir 200 nL AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 Viren (AAV-eGFP-Cre, 1/10-Verdünnung in Dulbeccos Phosphat gepufferte Kochsalzlösung), die die DNA der Cre-Rekombinase Ausdrücken mit GFP in P2 Striatum von Ai14 Mäusen verschmolzen. Die Ai14 Mäuse express TdTomato-Reporter-gen bei Cre-vermittelten Löschung LoxP flankiert (Floxed) STOP-Kassette (Abbildung 2F). Die Köpfe wurden auf P14 für Immunostaining GFP und .......

Diskussion

In der vorliegenden Studie zeigen wir Ihnen eine einfache und zuverlässige stereotaktischen Methode zum Einspritzen von AAV Viren in das Striatum von Neugeborenen mäusegehirnen. Wir mikroinjiziert AAV-eGFP-Cre Viren in das Striatum Ai14 Reporter Mäuse bei P2 und dann analysiert die Reporter-gen-Expression bei P14. Wir fanden, dass AAV GFP-positiven Zellen in das Striatum auf Rostrocaudal Ebenen ausgestrahlt. Darüber hinaus Co ausgedrückt fast alle GFP-positiven Zellen TdTomato-Reporter-gen in Striatale Zellen, was auf ei.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
30G PrecisionGlide Nadel	Becton Dickinson	REF 305106
Chloroform	JT Baker	9180-03
Hamilton MICROLITER	Spritze Hamilton	80300	30G Nadel fit für PE10 Schlauch; 26G Nadel benötigt einen PE20 Adapter
Polyethylenschlauch PE20	Becton Dickinson	427406
Polyethylenschlauch PE10	Becton Dickinson	427401
Mikro Durchfluss Spritze Pumpe	Länger Präzisionspumpe Co.	TJ-2A (Controller) und L0107-2A (Antriebseinheit)
25G Spritze	Becton Dickinson	REF 302105
Schnell grün	Sigma-Aldrich	F-7252	0,1%
Stereotaktische Standardinstrumente	RWD Life Science	68037	Ohne Verwendung 68030 Adapter für Maus/Neugeborenen-Ratte
Anti-FOXP2-Antikörper	Abcam	ab16046	Kaninchen polyklonal auf FOXP2, 1:4.000
Anti-RFP-Antikörper	Abcam	ab65856	Maus monoklonal zu RFP, 1:1.000
BX63 Mikroskop	Olympus	BX63
LSM 880 konfokales Mikroskop	Zeiss	LSM 880
Ziege Anti-Kaninchen konjugiert Alexa fluor594	Jackson lmmunoReserch Laboratories Inc.	111-585-003
AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40	Penn Vector Core	AV-9-PV1848	Los # CS0987, 5.506x1013 (GC/ml)
AAV9.Hühner-Aktin-eGFP	AAV-Kern, Institut für Biomedizinische Wissenschaften, Academia Sinica, Taiwan	N/A	1x1014 (GC/ml)
B6. Cg-GT(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomate)Hze/J	Das Jackson Labtorary	007914	Ai14
B6(Cg)-Foxp2tm1.1Sfis/CfreJ	Das Jackson-Labor	026259	Foxp2fl/fl
Dulbecco" s phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Corning  cellgro	21-030-CVR