Wir beschreiben ein Protokoll der stereotaktischen Operation mit einer hausgemachten Kopf fixiert Vorrichtung zur microinjecting Reagenzien in das Striatum von Neugeborenen mäusegehirnen. Diese Technik ermöglicht Genmanipulation in neuronalen Zellen bestimmter Regionen des Neugeborenen mäusegehirnen.
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Methodenartikel
Stereotaktischen Chirurgie für Genmanipulation in Striatale Zellen des Neugeborenen Mäusegehirnen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Viele Gene werden im embryonalen Gehirn exprimiert, und einige von ihnen werden kontinuierlich in das Gehirn nach der Geburt ausgedrückt. Für solche anhaltend exprimierten Gene können sie Funktion, um den Entwicklungsprozess und/oder physiologische Funktion im neonatalen Gehirn regulieren. Um neurobiologische Funktionen bestimmter Gene im Gehirn zu untersuchen, ist es unerlässlich, Gene im Gehirn zu inaktivieren. Hier beschreiben wir eine einfache stereotaktischen Methode um gen-Expression im Striatum von transgenen Mäusen bei Neugeborenen Zeitfenster zu inaktivieren. AAV-eGFP-Cre Viren wurden in das Striatum Ai14 Reporter-gen Mäuse an postnatalen Tag (P) 2 von stereotaktischen Gehirnchirurgie mikroinjiziert. Die TdTomato-Reporter-gen-Expression wurde im P14 Striatum, was darauf hindeutet, dass eine erfolgreiche Cre-LoxP vermittelte DNA Rekombination in AAV ausgestrahlt Striatale Zellen erkannt. Wir weiter validiert diese Technik durch microinjecting Viren AAV-eGFP-Cre in P2Foxp2fl/fl -Mäuse. Doppelte Kennzeichnung der GFP und Foxp2 zeigte, dass die GFP-positiven Zellen Foxp2-Immunoreactivity in P9 Striatum, was den Verlust des Foxp2-Proteins in AAV-eGFP-Cre ausgestrahlt Striatale Zellen fehlte. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse eine wirksame genetische Löschung durch stereotaxically mikroinjiziert AAV-eGFP-Cre-Viren in bestimmten neuronalen Populationen im neonatalen Gehirn von transgenen Mäusen Floxed. Abschließend bietet unsere stereotaktischen Technik eine einfache Plattform für Genmanipulation in Neugeborenen mäusegehirnen. Die Technik kann nicht nur Gene in bestimmten Regionen des neonatalen Gehirn Löschen verwendet werden, aber es kann auch verwendet werden, um pharmakologische Medikamente, neuronaler Tracer, gentechnisch veränderten optogenetik und Chemogenetics Proteine, neuronaler Aktivität Indikatoren zu injizieren und anderen Reagenzien in das Striatum von Neugeborenen mäusegehirnen.
Einleitung
Moderne Studien der Struktur und Funktion des Gehirns erfordern in der Regel genetische Manipulation bestimmter Gene in neuronalen Zellen. Um die Funktionen der verschiedenen Gene, Transgene Mäuse tragen mutierten Allele, einschließlich Sonde wurden routinemäßig Knockout und Knock-in Allele generiert. Stereotaktischen Gehirnchirurgie für Erwachsene Nager ist eine Standardmethode zu liefern lokal Medikamente, Viren, Tracer und andere Reagenzien auf bestimmte Regionen von Nagetier Gehirne1,2. Anwendung der stereotaktischen Gehirnchirurgie mit transgenen Mäusen erlaubt, die Genfunktion und neuronale Aktivität in bestimmten neuronalen Populationen des Mäusegehirns genetisch zu manipulieren. Die Zelle typspezifische Manipulation bietet einen leistungsfähigen Ansatz um neuronale Funktionen in komplexen neuronalen Schaltkreise des Gehirns3,4,5zu entschlüsseln.
Neurale Entwicklung des Nervensystems beginnt am frühen embryonalen Stadien und Entwicklungsprozesse weiter nach der Geburt bis zur juvenile Periode. Postnatale Reifung des Nervensystems beinhaltet die genaue synaptische Verdrahtung der neuronalen Schaltkreise, die für physiologische und kognitive Funktionen des Gehirns6erforderlich ist. Daher studieren Entwicklungsstörungen Ereignisse, die in Neugeborenen Zeitfenstern auftreten ist wichtig nicht nur für normale neurale Entwicklung zu verstehen, aber es kann auch Einblicke in die Pathogenese von Entwicklungsstörungen und neuropsychiatrische Störungen7 ,8. Obwohl die Methoden der stereotaktischen Gehirnchirurgie für Erwachsene Nager verfügbar2,9, sind einige Protokolle im Internet für stereotaktischen Gehirnoperation bei Neugeborenen Mäusen10,11. Stereotaktischen Mikroinjektionen von Reagenzien in die Gehirne von Neugeborenen Maus Welpen sind in der Tat schwierig, denn den Kopf des Neugeborenen Welpen zu empfindlich, um in den standard stereotaktischen Apparat fixiert werden. Dennoch ist die Anwendung der stereotaktischen Gehirnchirurgie mit transgenen Mäusen für Neugeborene Mäuse12machbar. Hier beschreiben wir eine einfache Methode mit einem hausgemachten Setup stereotaktischen Gehirnchirurgie in Neugeborenen Maus Welpen durchführen. Wir zeigen, dass diese Technik ermöglicht eine bedingt Floxed Gene microinjecting DNA AAV exprimierenden Cre-Rekombinase in das Striatum von Reporter-gen-Mäusen und bedingt Floxed Transgene Mäuse zu löschen. Dieses Verfahren gilt auch für Reagenzien in der neonatalen Striatum von Wildtyp Mäusen zu liefern.
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Protokoll
Die tierischen Protokolle, die hier beschrieben wurden von Animal Care und Nutzung Ausschüsse der National Yang-Ming University genehmigt.
1. Vorbereitung des Inhabers für die Neugeborenen Welpen in der stereotaktischen Vorrichtung
- Der Kopf Fach zu machen: Schneiden Sie unten eine 1,5 mL Zentrifugenröhrchen (15 mm lang) in die Form, die den Kopf des Neugeborenen Welpen passt durch Entfernen von 1/5 der Wand des Rohres.
- Nehmen Sie eine Pipette Tip Box mit der richtigen Größe, die mit dem Sockel des stereotaktischen Apparats passt, und entfernen Sie die obere Abdeckung. Befestigen Sie das Kopf Tablett in Schritt 1.1 und eine Gewebe Einbetten von Kassette auf der Basis des Tipp-Tablett mit heiß-schmelzen Kleber vorbereitet. Die Höhe der Gewebe einbetten Kassette beträgt 7 mm, die verwendet wird, um Hals und Körper der Welpe in der Kopf-feste Position zu unterstützen.
- Legen Sie das ganze Setup in einem standard stereotaktischen Apparat.
2. Vorbereitung von Injektionsnadeln Edelstahl 30G
- Pre-clean 30 G Spritze Nadeln durch Einweichen in Chloroform für 3 Tage.
- Verwenden Sie Zange vorsichtig und langsam die Nadel Herausziehen aus Polypropylen Drehkreuz in einer chemischen Kapuze.
- Waschen Sie die Nadeln mit absoluten Ethanol für 20 min, gefolgt von 70 % Ethanol Spülungen für 3 × 10 min auf einen Shaker bei 50 Umdrehungen pro Minute. Lassen Sie die Nadeln Luft trocknen, und speichern Sie die gereinigten Nadeln in einer sauberen Box bei Raumtemperatur (RT) bis zur Verwendung.
3. bereiten Sie einen Adapter für die Mikroinjektion Schläuche
- Verbinden Sie Mikroliter Spritze mit einer 30G Injektionsnadel mit einer PE10 Polyethylenschlauch (PE10 Rohr). Bereiten Sie einen PE20 Polyethylen Schläuche (PE20 Röhre) Adapter zur Überbrückung der Injektionsnadel und Mikroliter-Spritze. Die Verwendung des Adapters ist notwendig, da der Durchmesser der PE10 Rohr viel kleiner als die Nadel der Spritze 26 G Mikroliter ist.
- Bereiten Sie den Schlauch für die Mikroliter-Spritze: die vorgereinigten 30 G Injektionsnadel mit 5 cm PE20 Röhre zu verbinden, und die Kreuzung mit Sekundenkleber versiegeln. Dieser Schlauch-Adapter ist wiederverwendbar.
Hinweis: Wenn die Nadel der Spritze Mikroinjektion 30 G, die Vorbereitung (Schritt 3.1) und Nutzung (Schritt 3.3) dieser Adapter ist nicht erforderlich. - Verbinden Sie den Schlauch-Adapter (vorbereitet in Schritt 3.1) mit einer Spritze Mikroliter (10 µL).
- Schließen Sie ein Ende der PE10 Rohr (nicht länger als 60 cm) auf die 30G Nadel PE20 Schlauch Adapter. Montieren Sie einen neuen 30G Injektionsnadel auf das andere Ende des Schlauches PE10.
4. Laden Sie die Mikroinjektion Tube mit autoklaviert destilliertes Wasser, Farbstoff und Viren
- Entfernen Sie den Kolben der Spritze Mikroliter. Verwenden Sie eine 25G Spritze laden die Mikroliter-Spritze und seine angeschlossenen PE-Rohr mit autoklaviert destilliertes Wasser, Luft aus dem Schlauch entfernen.
- Legen Sie den Kolben zurück zu den Mikroliter-Spritze, und drücken Sie den Kolben bis 2 µL destilliertes Wasser bleibt im Fass. Lassen Sie sich nicht das Volumen des destillierten Wassers werden niedriger als 2 µL.
- Montieren Sie sorgfältig die Mikroliter-Spritze auf der Mikro-Rate Spritze Strömungspumpe.
- Kleine Mengen von 0,1 % schnell grüne Farbstoff (in 0,9 % Kochsalzlösung vorbereitet und mit 0,22 µm Filter gefiltert) und die Virus-Flüssigkeiten zu einem Stück Parafilm Pipette.
- Ziehen Sie eine kleine Menge an Luft, eine Luftblase an der Kreuzung zwischen 30 G Injektionsnadel und PE10 Schlauch gefolgt von 0,7 µL des gefilterten schnell grün in das Rohr laden testen Sie die Strömung von Flüssigkeiten in der Mikroinjektion Schlauch sichtbar zu machen.
- Ziehen Sie eine weitere kleine Menge Luft, eine zweite Luftblase gefolgt von Virus-Flüssigkeiten in der Mikroinjektion Schlauch laden zu machen.
- Befestigen Sie und sichern Sie die 30G Mikroinjektion Nadel am Arm des stereotaktischen Apparats.
(5) Anästhesie des Neugeborenen Mäusen durch Unterkühlung
- Legen Sie der Welpe in einer Latex-Handschuh-Hülle und Tauchen Sie es in crushed-Ice bis zum Hals für 5 min.
- Kneifen Sie die Pup Füße mit einer Pinzette, um sicherzustellen, dass keine Rücknahme Antwort seiner Füße.
- Der Welpe mit Latex-Handschuh Ärmel im Kopf Tray legen Sie und einige zerstoßenem Eis um der Latex Hülle, um es für die Hypothermie Anästhesie kalt zu halten.
- Tragen Sie Tierarzt Salbe auf Pup es Augen, Trockenheit während der Narkose möglichst zu verhindern.
6. die Mikroinjektion
- Bereiten Sie sterile Chirurgie durch Abwischen der stereotaktischen Instruments gründlich mit 70 % Ethanol. Das chirurgische Instrument durch Eintauchen in 70 % igem Ethanol zu sterilisieren.
- Schrubben Sie das Pup Kopf mit 70 % Ethanol. Suchen Sie die Wahrzeichen Lambda auf dem Schädel und markieren Sie der Lambda-Ausdruck mit einem Filzstift. Ziel ist die Spitze der Nadel an der Lambda-Ausdruck, und der anterior-posterioren (AP) und Medial-laterale (ML) Koordinaten als NULL festgelegt.
- Bewegen Sie die Injektion-Arm an den Zielstandort nach X und Y-Koordinaten der Ziel-Site. Für das Striatum postnatale Tag (P) 2 Jungtiere, die Koordinaten sind: AP, +2,4 mm anterior des Lambda-Ausdrucks; ML, 1,0 mm seitlich von der Mittellinie; dorsal-Ventral (DV), −1.7 mm aus dem Schädel. Markieren Sie die Position der schnell grünen Farbstoff in PE10 Rohr mit einem Stift.
- Bringen Sie die 30G Spritze langsam durchdringen die Haut und Schädel, und heben Sie dann die Spitze der Nadel bis zum Anschlag an der Oberfläche des Schädels. Die DV-Koordinate als NULL festgelegt.
- Bringe die 30G Spritze langsam bis sie die DV-Koordinate der Ziel-Site erreicht. Warten Sie 1 Minute um das Parenchym wieder seine normale Form zu ermöglichen. Führen Sie die Mikroinjektion Programm (100 nL/min).
- Stellen Sie sicher, dass die Marke schnell grün färben geht in das PE-Rohr um sicherzustellen, dass die Virus Flüssigkeit ins Gehirn injiziert wird.
- 1 min nach der Beendigung der Mikroinjektion warten, und langsam und schrittweise heben Sie dann die Nadel bis zu 1/2 Höhe von DV Tiefe innerhalb von 30 s. Nach 30 s, ziehen Sie die Nadel langsam aus der Welpe Kopf.
- Wiederholen Sie Schritt 6.2 bis 6.7 bis die Mikroinjektionen aller gezielte Seiten abgeschlossen sind.
7. postoperative Erholung des Welpen
- Der Welpe für 20 min in einem Inkubator 33 ° C erwärmen. Überprüfen Sie die Erholung des Welpen von Hypothermie Anästhesie alle 5 min, bis der Welpe ausreichend Bewusstsein zur Aufrechterhaltung der sternalen liegen wiedererlangt hat.
- Der Welpe zurück bis zum Staudamm zurück, nachdem der Welpe ist vollständig erholt.
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Ergebnisse
Für den ersten Satz des Experiments mikroinjiziert wir 200 nL AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 Viren (AAV-eGFP-Cre, 1/10-Verdünnung in Dulbeccos Phosphat gepufferte Kochsalzlösung), die die DNA der Cre-Rekombinase Ausdrücken mit GFP in P2 Striatum von Ai14 Mäusen verschmolzen. Die Ai14 Mäuse express TdTomato-Reporter-gen bei Cre-vermittelten Löschung LoxP flankiert (Floxed) STOP-Kassette (Abbildung 2F). Die Köpfe wurden auf P14 für Immunostaining GFP und ...
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Diskussion
In der vorliegenden Studie zeigen wir Ihnen eine einfache und zuverlässige stereotaktischen Methode zum Einspritzen von AAV Viren in das Striatum von Neugeborenen mäusegehirnen. Wir mikroinjiziert AAV-eGFP-Cre Viren in das Striatum Ai14 Reporter Mäuse bei P2 und dann analysiert die Reporter-gen-Expression bei P14. Wir fanden, dass AAV GFP-positiven Zellen in das Striatum auf Rostrocaudal Ebenen ausgestrahlt. Darüber hinaus Co ausgedrückt fast alle GFP-positiven Zellen TdTomato-Reporter-gen in Striatale Zellen, was auf ei...
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde unterstützt durch das Ministerium für Wissenschaft und Technologie gewährt MOST104-2311-B-010-010-MY3, MOST106-2321-B-010-012, den National Health Research Institutes gewähren NMRI-EX106-10429NI und die vorgestellten Bereiche Research Center Program Stipendium Das Bildungsministerium durch Brain Research Center, National Yang-Ming University in Taiwan, und MOST106-2811-B-010-031 (S.-Y.C), MOST105-2811-B-010-036 und MOST106-2811-B-010-030 (H.-Y.K) Postdoctoral Fellowship-Stipendien.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 30G PrecisionGlide Nadel | Becton Dickinson | REF 305106 | |
| Chloroform | JT Baker | 9180-03 | |
| Hamilton MICROLITER | Spritze Hamilton | 80300 | 30G Nadel fit für PE10 Schlauch; 26G Nadel benötigt einen PE20 Adapter |
| Polyethylenschlauch PE20 | Becton Dickinson | 427406 | |
| Polyethylenschlauch PE10 | Becton Dickinson | 427401 | |
| Mikro Durchfluss Spritze Pumpe | Länger Präzisionspumpe Co. | TJ-2A (Controller) und L0107-2A (Antriebseinheit) | |
| 25G Spritze | Becton Dickinson | REF 302105 | |
| Schnell grün | Sigma-Aldrich | F-7252 | 0,1% |
| Stereotaktische Standardinstrumente | RWD Life Science | 68037 | Ohne Verwendung 68030 Adapter für Maus/Neugeborenen-Ratte |
| Anti-FOXP2-Antikörper | Abcam | ab16046 | Kaninchen polyklonal auf FOXP2, 1:4.000 |
| Anti-RFP-Antikörper | Abcam | ab65856 | Maus monoklonal zu RFP, 1:1.000 |
| BX63 Mikroskop | Olympus | BX63 | |
| LSM 880 konfokales Mikroskop | Zeiss | LSM 880 | |
| Ziege Anti-Kaninchen konjugiert Alexa fluor594 | Jackson lmmunoReserch Laboratories Inc. | 111-585-003 | |
| AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 | Penn Vector Core | AV-9-PV1848 | Los # CS0987, 5.506x1013 (GC/ml) |
| AAV9.Hühner-Aktin-eGFP | AAV-Kern, Institut für Biomedizinische Wissenschaften, Academia Sinica, Taiwan | N/A | 1x1014 (GC/ml) |
| B6. Cg-GT(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomate)Hze/J | Das Jackson Labtorary | 007914 | Ai14 |
| B6(Cg)-Foxp2tm1.1Sfis/CfreJ | Das Jackson-Labor | 026259 | Foxp2fl/fl |
| Dulbecco" s phosphatgepufferte Kochsalzlösung | Corning cellgro | 21-030-CVR |
Referenzen
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