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Methodenartikel

Lipid-Index Bestimmung von flüssigen Fluoreszenz Erholung der pilzliche Erreger Ustilago Maydis

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⸱

DOI:

10.3791/57279

⸱

3. April 2018

 ,  ,  , 
1Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, Instituto Politécnico Nacional, 2Facultad de Medicina, Universidad Nacional Autónoma de México, 3Instituto de Bioquímica Médica Leopoldo de Meis, Universidade Federal do Rio de Janeiro

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein Protokoll, um der Lipid-Tröpfchen (LD Index) erreichen, um die Dynamik der Triacylglyzerole in Zellen im Hochdurchsatz-Experimente zu studieren. Die LD-Index-Assay ist eine einfache und zuverlässige Methode, die BODIPY 493/503 verwendet. Dieser Assay benötigt keine Dispendious Lipid-Extraktion oder Mikroskopie-Analyse.

Zusammenfassung

Der Artikel zeigt, wie die LD-Index-Assay, implementieren, die eine sensible Mikrotestplatte Assay zu bestimmen, die Anhäufung von Triacylglyzerole (TAGs) in Lipid-Tröpfchen (LDs) ist. LD-Index wird ohne Lipid-Extraktion gewonnen. Es ermöglicht die Messung des LDs-Inhalts im Hochdurchsatz-Experimente unter verschiedenen Bedingungen wie Wachstum im Reich oder Stickstoff aufgebraucht Medien. Wenn auch die Methode zum ersten Mal den Fettstoffwechsel von Tröpfchen in Saccharomyces Cerevisiae, studieren beschrieben wurde war es erfolgreich auf Basidiomycete Ustilago Maydisangewendet. Interessant ist, und weil LDs Zellorganellen in eukaryotischen Zellen phylogenetisch konserviert sind, kann die Methode auf eine Vielzahl von Zellen, von Hefe für Säugerzellen angewendet werden. Der LD-Index basiert auf der flüssigen Fluoreszenz Erholung Assay (LFR) von BODIPY 493/503 abschrecken Bedingungen durch die Zugabe von Zellen mit Formaldehyd. fixiert Kalium-Jod dient als ein Fluoreszenz-Durstlöscher. Das Verhältnis zwischen der Fluoreszenz und die optische Dichte Hänge ist LD Index benannt. Neigungen werden berechnet von den geraden Linien erreicht, wenn BODIPY Fluoreszenz und Extinktion bei 600 nm (OD600) werden gegen Probe zusätzlich dargestellt. Optimale Datenqualität spiegelt sich durch Korrelationskoeffizienten gleich oder über 0,9 (R ≥ 0,9). Mehrere Proben können gleichzeitig gelesen werden, wie es in einer Mikrotestplatte umgesetzt werden kann. Da BODIPY 493/503 eine lipophile Leuchtstoff färben die Partitionen in der Lipid-Tröpfchen ist, kann es in vielen Arten von Zellen verwendet werden, die Kirche Jesu Christi zu sammeln.

Einleitung

Lipid-Tröpfchen (LDs) sind allgegenwärtige intrazellulären Fett Körper, bestehend aus einem Kern von neutralen Lipiden, vor allem TAGs und Sterol Ester (SE). Der Kern ist umgeben von einer Monoschicht von Phospholipiden, die mit Proteinen wie Perilipin und Enzyme beteiligt an der Synthese von neutralen Lipiden, wie Diacylglycerol Acyl-Transferase, Acetyl-CoA Carboxylase und Acyl-CoA-Synthase-1interagiert. Durch sein dynamisches Verhalten enthält die Phospholipid-Monolayer auch Triacylglycerol Lipasen, die TAGs und SE2Hydrolyseneigung. Je nach Zelltyp und Organismus gespeicherten neutralere Lipiden können verwendet werden, um Energie zu erzeugen, oder synthetisieren Phospholipide und Signalmoleküle. In Hefen und anderen Pilzen ändert den Inhalt des LDs in Reaktion auf eine sich ändernde Stickstoff/Kohlenstoff-Verhältnis in Kulturmedien, darauf hinweist, dass verminderte Stickstoffverfügbarkeit möglicherweise der Schlüssel zu neutral Lipid Produktion3,4 zu erhöhen ,5. Die Produktion von hohen Mengen von TAGs in der Hefe hat eine mögliche Verwendung in der Biotechnologie als Quelle von Biokraftstoffen und in der Lebensmittelindustrie. Einige gespeicherte Lipide enthalten hohe Anteile an mehrfach ungesättigten Fettsäuren wie Omega-3 und Omega-6, mit Ernährungs- und diätetische Bedeutung 6,7,8,9,10 , 11. LDs von Säugerzellen, einschließlich der menschlichen Zellen enthalten auch TAGs und Cholesterin-Ester. Die Phospholipid-Monolayer interagiert mit den Säugetieren homologe Proteine, die in der Hefe LDs beschrieben und mit einem zusätzlichen Protein, Perilipin, der abwesend ist in S. Cerevisiae12. Eine vorgeschlagene Rolle für die Phospholipid-Monolage und seiner damit verbundenen Proteine, die LDs-Struktur zu stabilisieren und damit die Interaktion von LDs mit Organellen als endoplasmatische Retikulum, Mitochondrien, Peroxisomen und Vakuolen, vor allem für Lipid Austausch ist 13,14. Interessanterweise scheinen beim Menschen, LDs Krankheiten wie Typ-2-Diabetes, Arteriosklerose, Steatohepatitis und koronare Herzkrankheit, in dem gibt es eine Zunahme der Zahl 15,16,17 beteiligt sein . Einige Arten von Viren nutzen LDs als Plattformen zusammenzubauen Virionen 2,18,19.

Aufgrund der Auswirkungen der lokalen Entwicklungsstrategie in menschliche Pathologien und deren biotechnologische Einsatzmöglichkeit ist die genaue experimentelle Bestimmung der LDs-Bildung eine wichtige Aufgabe. Dieser Artikel beschreibt eine zuverlässige Assays basierend auf die Erholung der Fluoreszenz (LFR) von BODIPY 493/503 (4, 4-Difluoro-1, 3, 5, 7, 8-Pentamethyl-4-Bora-3a, 4a-Diaza-s-Indacene), um einen relativen Wert des Inhalts der neutrale Lipide in den Zellen zu bekommen. Mit diesem Test ist es möglich, die Dynamik der Anhäufung von neutralen Lipiden in Pilzen wie U. Maydis und S. Cerevisiae, und auch in Säugetierzellen, ohne die Notwendigkeit von Lipid-Extraktion 20. folgen Die Methode angewendet wurde, zum ersten Mal in S. Cerevisiae zu identifizieren, die Protein-Phosphatasen und Kinasen beteiligt die Regulierung des Fettstoffwechsels. Dies war möglich ohne Lipid-Extraktion oder Protein Reinigung21,22. LFR wurde auch verwendet, um die Dynamik der LDs-Formation im peritonealen Makrophagen23zu etablieren. Die Verwendung von BODIPY 493/503 hat einige Vorteile gegenüber anderen neutral Lipid-Farbstoffe als Nil rot. BODIPY 493/503 ist hochspezifisch für neutrale Lipide und hat einen schmalen Emissionsspektrum erleichtern die simultane Detektion der Signale von Farbstoffen wie rot fluoreszierende Protein oder Mito-Tracker, wenn die Proben durch konfokale Mikroskopie analysiert werden. Leider BODIPY 493/503 ist empfindlich gegenüber Immunofluoreszenz, aber dieser Prozess kann mithilfe einer antiquenching Reagenz während der Exposition gegenüber Licht24vermieden werden.

Zur Durchführung der LFR Assay in Hefezellen, sie sind unter den gewünschten Ernährungs-Bedingungen kultiviert und Aliquote sind zu unterschiedlichen Zeitpunkten zurückgezogen. Als nächstes werden Zellen mit Formaldehyd, fixiert, die die Integrität des LDs monatelang bewahrt wenn Zellen bei 4 ° c gelagert werden Ndere Fixierung sollte vermieden werden, vor allem diejenigen, die mit Methanol oder kaltem Aceton, da sie zum Abbau der LDs innerhalb der Zellen24führen. Um den LD-Index zu messen, sind Formaldehyd-feste Zellen im Wasser zu einer definierten Konzentration ausgesetzt. Dann werden sie zu einer Lösung mit der Fluorophor BODIPY 493/503 abgeschreckt durch KI hinzugefügt, und wenn der Fluorophor die Zelle betritt und die LDs ordnet, gibt es eine Erholung der seine Fluoreszenz. Begleitende der Fluoreszenz-Messung (485 nm/510 nm), die Konzentration der Zellen wird quantifiziert durch die Messung der optischen Dichte bei 600 nm. Jede Probe wird viermal gelesen, indem nachfolgende 5 µL Aliquots Formaldehyd fixiert Zellsuspension zu gleich gut. Rohlinge von Fluoreszenz und Absorption sind vor der Zugabe von Zellen erworben. Die Qualität der Fluoreszenz und die Extinktion-Daten werden durch die Bestimmung der Linearität der Messungen ausgewertet: Wenn R < 0.9, Daten werden verworfen. Der R-Wert ist wichtig, weil im Grunde die Intensität der Fluoreszenz eine lineare Reaktion auf steigenden Zelle Konzentrationen produzieren sollte. Wenn die Zellkonzentration zu hoch ist, ist die Linearität verloren. Der LFR-Test bietet eine schnelle, einfache und wirtschaftliche Methode, um wählen die gewünschte LD-Phänotyp im Hochdurchsatz-Experimente. Nach der Auswahl der gewünschten Bedingungen, kann der LD-Inhalt der einzelnen Zellen durch konfokale Mikroskopie, Verwendung der gleichen Formaldehyd-feste Zellen befleckt mit BODIPY, bietet ein Bild von der Kirche Jesu Christi in der Zelle untersucht werden. Ihre TAGs und SE Inhalte können jetzt weiter durch Dünnschichtchromatographie analysiert werden.

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Protokoll

1. Vorbereitung der Puffer und Lösungen

  1. Zur Vorbereitung von 1 L Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS, pH 7), 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4, 0,24 g KH2PO4 in 800 mL distillated Wasser auflösen. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,0 mit HCl, und fügen Sie Wasser für ein Endvolumen von 1 L. PBS als ein 10 x-Stammlösung und bei Raumtemperatur gelagert werden kann.
  2. Fügen Sie 1 mL 37 % Formaldehyd um 10 mL der Lösung Befestigung vorzubereiten hinzu, 9 mL PBS, eine Endkonzentration von 3,7 % zu erreichen. Diese Lösung kurz vor dem Einsatz vorzubereiten.
    Achtung: Benutzen Sie Handschuhe, um die Formaldehyd-Lösung zu behandeln.
  3. Zur Vorbereitung der abschrecken-Lösung (500 mM) lösen Sie 8,3 g Ki in 100 mL destilliertem Wasser. Diese Lösung vor Gebrauch zubereiten und bei Zimmertemperatur aufbewahren.
  4. BODIPY 10 mM Stammlösung vorbereiten, lösen Sie 10 mg von BODIPY 493/503 in 3,8 mL Dimethyl Sulfoxid (DMSO). Halten Sie 100 µL-Aliquots in der Dunkelheit bei-70 ° C.
  5. Fügen Sie zur Vorbereitung BODIPY 5 µM-abschrecken-Lösung 1 µL 10 mM BODIPY 493/503 bis 2 mL 500 mM abschrecken Lösung. Für die LFR-Assay ist eine Endkonzentration von 5 µM BODIPY erforderlich.
  6. Zur Vorbereitung der Mineralien-Lösung hinzufügen 0,06 g H3BO3, 0,14 g MnCl2-4 H2O, 0,4 g ZnCl2, 0,04 g Na2MoO4-2 H2O, 0,1 g FeCl3-6 H2O und 0,4 g CuSO 4-5 H2O, 1 L destilliertes Wasser.
  7. Zur Vorbereitung der Salzlösung zugeben Sie 16 g KH2PO4, 4 g Na2SO4, 8 g KCl 2 g MgSO4, 1 g CaCl2und 8 mL Mineral-Lösung zu 1 L Wasser destilliertem.
  8. Zur Vorbereitung der minimalen Medium ohne Stickstoffquelle für U. Maydis FB2 (a2b2), 1 L destilliertes Wasser, 10 g Glukose und 62,5 mL Kochsalzlösung hinzufügen, nach Holliday, Et Al. 31. sterilisieren sie den pH-Wert auf 7,0 einstellen und dann 100 mL der Medien in 250 mL Flaschen zu verzichten. Autoklaven für 20 min bei 15 Psi (1,05 kg/cm2) auf flüssigen Zyklus oder Filter zu sterilisieren.
  9. Um die Hefe Pepton Traubenzucker Medium (YPD) vorzubereiten, fügen Sie 5 g Hefe-Extrakt, 2,5 g Pepton, und 5 g Glukose zu 1 L destilliertes Wasser hinzu. 100 mL der Lösung in 250 mL Flaschen zu verzichten und sie zu sterilisieren. Autoklaven für 20 min bei 15 Psi (1,05 kg/cm2) auf flüssigen Zyklus oder Filter zu sterilisieren.

(2) Kultur Zustand und Zelle Fixierung

Hinweis: Bewahren Sie die Struktur der lokalen Entwicklungsstrategie durch die Fixierung der Zellen so bald wie möglich. Die Fixierung erfolgt in Mikrozentrifugenröhrchen. Fixe Zellen können bis zu einen Monat lang bei 4 ° C gehalten werden, wenn Austrocknung vermieden wird, so dass eine dünne Schicht des Wassers.

  1. Wachsen Sie U. Maydis Zellen unter Kulturbedingungen für das Studium relevant. Starten Sie die Kultur mit einer anfänglichen OD600 von 0,05 (1,15 × 106 Zellen / mL). Inkubation der Zellen bei 28 ° C, 180 u/min für 24 h. Ein OD600 von 1 entspricht 2,3 × 107 Zellen / mL.
  2. Bei den ausgewählten Zeiten zurückziehen ein Aliquot der Zellen. Zurückziehen Sie für U. Maydis 5 mL alle 2 h in den ersten 8 h. Nach 8 h des Wachstums Aliquote von 2 mL genügen.
  3. Messung die optische Dichte bei 600 nm jedes aliquoten.
  4. Zentrifugieren der Zellsuspension bei 14.000 x g für 1 min bei 4 ° C mit einer Tischplatte Zentrifuge. Verwerfen Sie den überstand.
  5. Das Pellet der Zellen in 1 mL PBS-Formaldehyd 3,7 % Puffer auszusetzen. Inkubieren Sie die Zellen für 15 min bei Raumtemperatur.
  6. Nach der Inkubation Zentrifugieren der Zellsuspension bei 14.000 x g für 1 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie den überstand.
  7. Waschen Sie die Zellen Pellet zweimal mit einem ähnlichen Volumen von destilliertem Wasser (1 mL). Zentrifugieren der Zellsuspension bei 14.000 x g für 1 min bei 4 ° C. Entsorgen Sie den Überstand nach jedem Waschschritt.
  8. Passen Sie die Zelle Pellet bis 5 OD600 (1,15 x 108 Zellen / mL) mit destilliertem Wasser (Gleichung 1).
    figure-protocol-1    Gleichung 1.
  9. Halten Sie die Probe bei 4 ° C, bis seine Verwendung.

3. flüssige Fluoreszenz-Recovery-Assay (LFR)

  1. Schalten Sie das Spektrophotometer und öffnen Sie die Skanlt-Software. Klicken Sie auf NEW SESSION, und wählen Sie START und dann Varioskan Lux. Wählen Sie Protokoll aus der Sitzung Struktur, geben Sie die Einstellungen für die Fluoreszenz-Wellenlängen (Erregung 485 nm/Emission 510 nm; optische Dichte 600 nm) und automatische Photomultiplier Gain. Bei der Anregung Bandbreite wählen Sie 12 nm. Wählen Sie in der Optik, oben (Anregung der Stichprobe ist von der Spitze des Brunnens).
  2. Geben Sie eine sanfte und ständige Unruhe (300 u/min). Wählen Sie Platte laufen herausund PAUSE bis die BENUTZERAKTION (Zeit für die Zugabe der Probe in die Vertiefungen). Wiederholen Sie das Protokoll fünf Mal. Klicken Sie auf Speichern , und geben Sie einen Namen für die Sitzung auf dem Feld "NAME" SESSION. Das Protokoll ist jetzt bereit für die Proben-Analysen.
  3. Fügen Sie 200 µL BODIPY 5 µM - Lösung in jede Vertiefung eine 96 gut schwarz-Clear Bodenplatte abgeschreckt.
  4. Die Platte im Inneren der Kammer Spektralphotometer und inkubieren Sie 5 min bei 30 ° C. Schützen Sie ab diesem Zeitpunkt die Platte aus Licht so weit wie möglich.
  5. Klicken Sie auf die Schaltfläche " START " und lesen Sie die Fluoreszenz (Erregung 485/Emission 510) und die OD600 entspricht die Rohlinge.
  6. Fügen Sie 5 µL Zellsuspension Formaldehyd fixiert in den Vertiefungen während der Pausenzeit. Vermengen Sie die Proben mit der Pipette vorsichtig. Setzen Sie die Platte im Inneren das Spektrophotometer und klicken Sie auf weiter. Dann werden die Proben nach dem Protokoll entwickelt, über verarbeitet.
  7. Wiederholen Sie drei aufeinander folgende Ergänzungen von 5 µL Zellsuspension. Stellen Sie sicher, dass die Zellen nicht überstürzen zu tun. (Abbildung 1).

4. Berechnung des Indexes LD

  1. Für jede Probe in die Mikrotestplatte Grundstück ein Diagramm der Fluoreszenz und Extinktion gegen die Lautstärke jeder aufeinanderfolgenden Zugabe (5 Punkte einschließlich der Leerzeichen). Verwenden Sie in dieser Studie Microsoft Excel Software für die Berechnungen. Plot-Daten, geben Volumen, Fluoreszenz und Extinktion Daten in der ersten, zweiten und dritten Spalte des Datenblatts, beziehungsweise. Wählen Sie dann die ganzen Daten mit dem Cursor, klicken Sie auf einfügen und wählen Sie (XY) streuen.
  2. Wählen Sie die Punkte für jede Linie im Diagramm, und fügen Sie die jeweiligen TRENDLINIE mit Feld Zeigen Gleichung ausgewählt. Notieren Sie die Werte von den Hängen des die zwei geraden Linien nach Gleichung 2:
    figure-protocol-2    Gleichung 2
    Wo y = Fluoreszenz oder optische Dichte, X = Volumen der Probe (0, 5, 10, 15, 20 µL), m = Steigung der Fluoreszenz oder optische Dichte Linie und b = y-Achsenabschnitt.
  3. Teilen Sie die Steigung der Fluoreszenz-Linie durch die Steigung der Linie optische Dichte den LD-Index, Gleichung 3 abgerufen.
    figure-protocol-3    Gleichung 3
    Der LD-Index entspricht dem Quotienten der Fluoreszenz und optische Dichte Pisten.

5. Qualität der Datenanalyse

  1. Der Korrelationskoeffizient jeder geraden zu berechnen: Klicken Sie auf den Funktions-Assistenten (fx) und wählen Sie CORREL. Wenn r < 0.9, die Daten zu verwerfen und wiederholen Sie die Messwerte. Wenn r ≥ 0,9, Lesungen zuverlässig sind.

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Ergebnisse

LFR, mit BODIPY 493/503 als fluoreszierende Sonde ist eine zuverlässige und einfache Methode, der dynamische Ansammlung von LDs in U. Maydis, unabhängig davon die Wachstumsbedingungen zu studieren. Wenn Zellen in YPD-Medium kultiviert wurden, gab es eine Zunahme der LD-Index in der exponentiellen Phase, gefolgt von einem Rückgang in der stationären Phase (Abbildung 2A). Im Gegensatz dazu gab es in den Zellen unter Stickstoff Hunger gewachsen, eine st...

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Diskussion

LFR ist eine neuartige Methode, die angewendet wurde, zum ersten Mal um den Fettstoffwechsel in S. Cerevisiae und später zu studieren, es erfolgreich war, umgesetzt U. Maydis20,21. Obwohl der LD-Index keinen absoluten Wert der Variablen in Zellen angesammelt geben, freuen Sie sich auf einen schnellen Überblick der Lipidgehalt der Zellen und die Interpretation der Daten ist einfach, wenn LD Index von zwei oder mehr experimentellen Bedingungen ver...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zur Offenlegung

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse des Instituto Politécnico Nacional-Secretaria de Investigación y Posgrado (IPN-SIP-20170864), Programa de Apoyo ein Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT IN222117)-Universidad Nacional Autónoma de México () UNAM) und Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT 254904-JPP und 256520-GGS). Fundação de Amparo eine Pesquisa Rio De Janeiro (FAPERJ-Cientistas Nosso Estado: E 26/103.353/2011). Wir dank QFB. Oscar Iván Luqueño Bocardo für die schematische Übersicht. Wir danken Dr. Miguel Tapia Rodríguez für die wertvolle Hilfe in der konfokalen Mikroskopie von LDs. Wir möchten danken Dr. Bruno Bozaquel Morais für seine Pionierarbeit bei der Entwicklung der Technik in S. Cerevisiae , die wir für U. Maydisangepasst.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
SpektralphotometerVarioskan Lux Multimode-Mikroplatte mit AblesungD5879Filter 493/503 oder Monochromator-Detektor
Plate costarCorning Inc.361596-Well-Zellkulturplatte mit schwarzer Wand/klarem Boden
Co-StarCorning Inc359896-Well-Zellkulturplatte Co-Star
BODIPY 493/503Invitrogen/ ThermofisherD39224,4-Difluor-1,3,5,7,8-pentamethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen
FormaldehydlösungSigma Aldrich252549ACS-Reagenz, 37 Gew.-% in H2O, enthält 10-15 % Methanol, um eine Polymerisation zu verhindern
KaliumiodidSigma Aldrich60399BioUltra, ≥ 99,5% (AT)
FB2 Ustilago maydisATCC201384Basidiomyceten-Hefe
NatriumchloridSigma Aldrich746398ACS-Reagenz, anorganisches Salz
Kaliumphosphat monobasischSigma AldrichP0662ACS-Reagenz
Select HefeextraktSigma AldrichY100Mischung aus Aminisäuren, Peptiden, wasserlöslichen Stoffen, Vitaminen und Kohlenhydraten für Nährmedien
N-Z Gehäuse plusSigma AldrichN4642Kasein enzymatisches Hydrolysat aus Rindermilch
GlukoseSigma AldrichG-8270D (+) Glukose
Skaker KolbenPirexCLS4450250-6EABorosisikatglas
SchüttlerSEV Mé xicoINO650V-7Orbitalschüttler
ZentrifugentischEppendorf5415CZentrifuge
MikroröhrchenSigma AldrichZ606340Eppendorf
PipettenspitzenAxygen scientificT-200-YUniversal-Pipettenspitzen mit abgeschrägtem Ende, 200 Mikroliter, unsterile
mLine-PipetteBiohit7251308 Kanäle, Volumenbereich 5-100 μl

Referenzen

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Lipid-Droplet-IndexFluoreszenz-Recovery-AssayBODIPY 493/503Mikroplatten-SpektrophotometrieStickstoffmangelTriacylglycerol-AkkumulationKonfokalmikroskopieMessung der optischen DichteFormaldehyd-Fixierung
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