Method Article

Isolation und In-vitro- Kultur von murinen und menschlichen alveoläre Makrophagen

DOI:

10.3791/57287

⸱

April 20th, 2018

 ,  ,  , 
1Norton Thoracic Institute, St. Joseph's Hospital and Medical Center, 2Flow Cytometry Core, St. Joseph's Hospital and Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Mitteilung beschreibt Methoden zur Isolierung und Kultur der alveolären Makrophagen aus Menschen und murinen Modellen zu Versuchszwecken.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alveoläre Makrophagen sind unheilbar differenzierte, Lunge-Bewohner Makrophagen pränatalen Ursprungs. Alveoläre Makrophagen sind einzigartig in ihrem langen Leben und ihre wichtige Rolle bei der Lungenentwicklung und Funktion sowie ihre Lunge lokalisiert Reaktionen auf Infektionen und Entzündungen. Bisher existiert kein einheitliches Verfahren für die Identifizierung, Isolierung und Handhabung der alveolären Makrophagen von Menschen und Mäusen. Diese Methode ist für Studien über diese wichtigeren angeborenen immunen Zellen in verschiedene experimentelle Einstellungen erforderlich. Die hier beschriebene Methode, die leicht von jedem Labor übernommen werden können, ist ein vereinfachter Ansatz Ernte alveoläre Makrophagen aus alvéolaire Lavage Fluid oder von Lungengewebe und pflegen sie in Vitro. Da alveoläre Makrophagen in erster Linie als adhärente Zellen in den Alveolen auftreten, liegt der Schwerpunkt dieser Methode auf verdrängen sie vor der Ernte und Identifikation. Die Lunge ist ein stark vaskularisierte Organ, und verschiedene Zelltypen myeloischen und lymphatischen Ursprungs bewohnen, interagieren und durch die Lunge Mikroumgebung beeinflusst werden. Mit dem Satz von oberflächenmarker beschrieben hier, können Forscher leicht und eindeutig andere Leukozyten alveoläre Makrophagen unterscheiden und für downstream-Anwendungen reinigen. Die Kultur-Methode entwickelt hierin unterstützt sowohl menschlich als auch Maus alveoläre Makrophagen für in-vitro- Wachstum und ist kompatibel mit zellulären und molekularen Studien.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Lunge Mikroumgebung ist ein einzigartig Komplexes Ökosystem mit einer aufwendigen Luftleitung und Gefäßsystem. Die eingeatmete Luft geht durch die Luftröhre und durch zahlreiche Zweige der Bronchien und Bronchiolen vor Erreichen der Alveolen, wo die Blut-Luft-Gasaustausch auftritt. Durch direkte Interaktion mit der Atmosphäre erfordert die respiratorische Oberfläche Schutz vor potenziell schädlichen Auswirkungen von luftgetragenen Partikeln und Schadstoffen. Eine Reihe von physikalischen, chemischen und immunologischen Barrieren schützen die Lungen. Bereitstellung von Phagozyten an der respiratorischen Oberfläche dient vor allem eine wichtige Erstlinien Abwehrsyst....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Verwendung Committee (IACUC) und die institutionelle Review Board (IRB) am St.-Josephs Hospital und Medical Center genehmigt.

1. Isolierung des AMs aus murinen alvéolaire Lavage (BAL) Flüssigkeit

  1. Betäuben Sie eine acht Wochen alten C57BL/6-Maus mit Ketamin (87,5 mg/kg Körpergewicht) und Xylazin (12,5 mg/kg Körpergewicht) über eine intraperitoneale Injektion cocktail. Gehen Sie bei Maus chirurgische Anästhesie mit Verlust von Reflexen und Entspannung der Muskulatur erreicht.
  2. Platzieren Sie den Mauszeiger auf eine Dissektion-Oberfläche, mit der....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Der Fluss durchflusszytometrischen Ansatz, Maus AMs zu identifizieren ist in Abbildung 1dargestellt. Dazu gehört die Analyse der einen minimalen Satz von oberflächenmarker notwendig in AMs von anderen Lunge-Resident oder Lunge infiltrieren Fresszellen zu unterscheiden. Differenzialanalyse muss eindeutig identifizieren AMs aus interstitielle Makrophagen, Dendritische Zellen, Neutrophilen, Monozyten und Monocyte abgeleitet pulmonaler Makrophagen, die in der Lun.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AMs sind langlebige Lunge ansässige Makrophagen, die die Lunge beginnt bei der Geburt und dauerhaft über die gesamte Lebensdauer26bevölkern. Ihre Rollen in pulmonalen Physiologie7 und Pathologie12 und ihr Potenzial zur pulmonalen Autoimmunität24 Vorhersagen wurden erkannt. Da AMs eine langfristige Präsenz in der Lunge11,27 haben und Aktivierung und Fortschreiten der Im.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken für die Unterstützung bei der Bearbeitung des Manuskripts Clare Prendergast. Sicherheitsanweisungen wird unterstützt durch eine Forschung gewähren (#2095) von der Stiftung Flinn und TM wird unterstützt durch Zuschüsse aus dem National Institutes of Health (R01HL056643 und R01HL092514). Sicherheitsanweisungen der Methoden entwickelt, die Studie konzipiert und schrieb das Manuskript; OM mit Tierversuchen und klinischen Probe Beschaffung unterstützt; SB mit durchflusszytometrischen Analyse und Zellsortierung unterstützt; TM die Studien überwacht und überprüft das Manuskript.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Nicht-enzymatische zelldissoziierende LösungMillipore-SigmaC5789
Puralube Vet SalbeDechra620300
22G Katheter Terumo Medical ProductsSR-OX2225CA
4-0 Nicht resorbierbares geflochtenes Seidennaht Kent ScientificSUT-15-2
Dulbecco' s phosphatgepufferte Kochsalzlösung Corning21-031-CM
Maus Fc-Block BD Biosciences553142
Lysepuffer (PureLink RNA Kit)Thermo Fisher Scientific 12183018A
b-Mercaptoethanol Millipore-SigmaM6250 
FACSAria II Zellsortierer BD Biosciences644832
Ketamin  (Ketathesia)Henry Schein56344
Xylazin   (AnaSed)Akorn139-236
RPMI 1640Corning10-040-CM
DMEMCorning10-017-CM
Liberase TL Millipore-Sigma5401020001
DNase IMillipore-SigmaAMPD1-1KT
100μ M-Zell-Sieb Corning352360
Künstlicher Fc-BlockBD Biosciences564220
EDTACorning46-034-CI
Countess II Automatisierter ZellzählerThermo Fisher Scientsp;
Trypan Blue SolutionThermo Fisher Scientific
HEPESCorning25-060-CI
Fötales RinderserumAtlanta BiologicalsS11150H
L-929 ZelllinieAmerican Type Culture CollectionATCC,  CCL-1
Penicillin/Streptomycin Corning30-002-CI
NatriumpyruvatCorning25-000-CI
T25 GewebekulturflascheThermo Fisher Scientific 
60 mm KulturschaleMillipore-SigmaCLS3261
15 mL konisches Röhrchen Corning352097
50 mL konisches Röhrchen Corning352098
LSRFortessa ZellanalysatorBD Biosciences657669
FlowJoFlowJov10.4Analysesoftware
Anti-CD45 (Maus)Biolegend147709Klon I3/2.3, FITC-konjugiert
Anti-CD11b (Maus)Biolegend101228Klon M1/70, PerCP/Cy5.5 konjugiert
Anti-CD11c (Maus)BD Biosciences565452Klon N418, BV 421 konjugiertes
Anti-I-Ab (Maus)Biolegend116420Klon AF6-120.1, PE/Cy7 konjugiertes
Anti-Siglec-F (Maus)BD Biosciences562757 Klon E50-2440, PE-CF594 konjugiertes
Anti-Siglec-H (Maus)Biolegend129605Klon 551, PE-konjugiertes
Anti-F4/80 (Maus)Biolegend123118Klon BM8, APC/Cy7 konjugiertes
Anti-Ly-6C (Maus)Biolegend128035Klon HK1.4, BV605 konjugiertes
Anti-CD64 (Maus)Biolegend139311Klon X54-5/7.1, BV711 konjugiertes
Anti-CD24 (Maus)BD Biosciences563115Klon M1/69, BV510 konjugiertes
Anti-CD103 (Maus)BD Biosciences745305Klon OX-62, BV650 konjugiert
Anti-CD317 (Maus)Biolegend127015Klon 927, APC konjugiert
Anti-CXCR1 (Maus)Biolegend149029Klon SA011F11, BV785 konjugiert
Anti-CD45 (Mensch)Biolegend304017Klon HI30, AF488 konjugiert
Anti-CD11b (Mensch)Biolegend101216Klon M1/70, PE/Cy7 konjugiert
Anti-HLA-DR (Mensch)Biolegend307618Klon L243, APC/Cy7 konjugiert
Anti-CD169 (Mensch)Biolegend346008Klon 7-239, APC konjugiert
Anti-CD206 (Mensch)Biolegend321106Klon 15-2, PE konjugiert
Anti-CD163 (Mensch)Biolegend333612Klon GHI/61, BV421 konjugiert
AMQAX100015250061156367

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Westphalen, K., et al. Sessile alveolar macrophages communicate with alveolar epithelium to modulate immunity. Nature. 506 (7489), 503-506 (2014).
  2. Guilliams, M., et al. Alveolar macrophages devel....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Alveolar MacrophagesBronchoalveolar LavageFlow CytometryCell IsolationTissue DigestionCell CultureSurface MarkersCD45 PositiveCD11c PositiveSiglec F Positive

Related Articles