Quantitative und Qualitative Methode für Sphingomyelin von LC-MS mit zwei stabilen isotopischer beschriftet Sphingomyelin Arten

Summary

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zu quantifizieren und zu einzelnen Sphingomyelin Arten mit mehreren Reaktionskontrolle zu qualifizieren und MS/MS/MS-Modus, beziehungsweise.

Abstract

Wir präsentieren Ihnen eine Methode zur Analyse von Sphingomyelin (SM) qualitativ und quantitativ durch flüssige Chromatographie-Electrospray Ionisierung-Tandem-Massenspektrometrie (LC-ESI-MS/MS). SM ist eine gemeinsame Sphingolipid bestehend aus einem phosphorylcholin und ein Ceramid als hydrophile und hydrophobe Komponente, beziehungsweise. Eine Reihe von SM-Arten sind in Säugerzellen aufgrund einer Vielzahl in der Sphingoid lange Kette base (LCB) und eine N-Acyl Glyko-in die Ceramid. In diesem Bericht zeigen wir eine Methode zur Schätzung der Zahl der Kohlenstoff und Doppelbindungen in einem LCB und eine N-Acyl Glyko-basierend auf ihren entsprechenden Produkt-Ionen in MS/MS/MS (MS³) Experimente. Darüber hinaus präsentieren wir eine Quantitative Analyse-Methode für SM mit zwei stabilen isotopisch beschriftete SM Arten, die erleichtert die Bestimmung der Reichweite in SM Quantifizierung verwendet. Das vorliegende Verfahren werden bei der Charakterisierung der SM Artenvielfalt in biologischen Proben und industrielle Produkte wie Kosmetika.

Introduction

Sphingomyelin (SM) ist eine gemeinsame Sphingolipid in Säugetierzellen. SM ist synthetisiert intrazellulär¹ und Gegenwart als Vorstufe für andere Sphingolipide wie ein Sphingosine-1-Phosphat und ein Ceramid, die entscheidende Rolle im Immunsystem haben-Handel Handy und Barriere Homöostase, bzw.^{2Haut, 3}. Daher ist die genaue Analyse des Stoffwechsels SM wichtig für die Aufklärung der physiologischen und pathologischen Rollen der Sphingolipide.

SM besteht aus einem Ceramid und ein phosphorylcholin, die mit 1-hydroxy-Gruppe von der Ceramid weiter ein Sphingosin....

Protocol

Finden Sie alle relevanten Sicherheitsdatenblätter (SDB) vor dem Gebrauch. Tragen Sie Handschuhe um Probe Verunreinigungen von der Haut abgeleitet SM zu minimieren. Dieses Protokolls galt, HeLa-Zellen gewachsen in Adlers minimale wesentliche Medium ergänzt mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS), 2 mM L-Glutamin, 1.000 U/L Penicillin und Streptomycin 100 mg/L.

1. Vorbereitung der Lipid-Proben

Hinweis: Es ist wichtig, dass alle Glaswaren, einschließlich Reagenzgläser mit Teflon ausgekleidet Schraubverschlüsse Waschmittel-frei sein.

1. Gewinnung von insgesamt Lipid-Anteil aus Zelle Homogenat mit Bligh &....

Results

Chemisch synthetisiert D18:1 / 24:0 cm (Abbildung 1A) und D18:1 / 24:0 SM in Lipid-Proben von HeLa-Zellen (Abbildung 1B) extrahiert wurden durch LC-ESI-MS³ [M + HCOO]^– und [M-CH₃] analysiert^- als ersten und zweiten Vorläufer Ionen, beziehungsweise. Beachten Sie, dass die Spektrum Intensität der demethylated-Sphingosylphosphorylcholine (SPC) (m/Z

Discussion

In dem vorliegenden qualitativen Verfahren, die wir erhalten, MS³ Produkt Ionen eine SPC und ein N-Acyl Glyko-. Es ist wichtig, richtig ordnen Sie eine SPC und ein N-Acyl Glyko-. Zu diesem Zweck sollte angemerkt werden, dass andere phosphorylcholin-haltige Moleküle auch als MS³ Produkt Ionen nachgewiesen werden können. Diacyl-Phosphatidylcholin (PC) und Plasmalogen-PC sind reichlich vorhanden in Säugetierzellen und ihre Hydrophobie ist ähnlich dem von SM. Daher können Diacyl-PC und.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS	ThermoFisher	10010023
100 mm Gewebekulturschale	IWAKI	3020-100
Zellschaber	IWAKI	9000-220
Silikonisiertes 2,0-ml-Röhrchen	Fisher Scientific	02-681-321
Reagenzglas	IWAKI	TST SCR 16-100
Teflon ausgekleideter Schraubverschluss	IWAKI	9998CAP415-15
Einweg-Glasröhrchen	IWAKI	9832-1310
CAPCELL PAK C18 ACR 3 & micro; m 1,5 mm ID x 100 mm	Shiseido	92223	Die Schutzpatrone wird in den Kartuschenhalter eingesetzt und mit der C18-Säule
verbunden CAPCELL C18 MGII S-3 2,0 mm x 10 mm GUARD KARTUSCHE	Shiseido	12197
Kartuschenhalter	Shiseido	12415
Acetonitril	Wako	018-19853
2-Propanol (Isopropylalkohol)	Wako	161-09163
Methanol	Wako	134-14523
Ameisensäure	Wako	066-00466
28% Ammoniak Wasser	Wako	016-03146
Ultraschallgerät (Badtyp)	SHARP	UT-206H
Vortex-Mischer für Glasreagenzglas	TAITEC	Mix-EVR
1,4 mL Glasfläschchen	Tomsic	500-1982	Die Proben werden in einem 1,4-ml-Glasfläschchen gelagert, das mit einem Schraubverschluss und einem 8-mm-Septum bei -20 °C verschlossen ist. C
8 mm Septum	Tomsic	200-3322	Bei der Analyse der Proben werden die Schraubverschlüsse durch Schraubverschlüsse mit geschlitztem Septum ersetzt
Schraubverschluss für 1,4 mm Glasfläschchen	Tomsic	500-2762
Schraubverschluss mit geschlitztem Septum	Shimadzu GLC	GLCTV-803
PVDF 0,22 µ m filter	Millipore	SLGVR04NL
Triple Quadrupol und Quadrupol Linear Ion Trap Massenspektrometrie	SCIEX	QTRAP4500
Die Software zur Datenerfassung und Analyse von Produktionenspektren	SCIEX	Analyst
Die Software zur Datenintegration in die quantitative Analyse	SCIEX	MultiQuant
HPLC System	Shimadzu	Nexera
Glasflasche	Sansyo	85-0002
d18:1/24:0 Sphingomyelin	Avanti Polar Lipids	860592P
Sphingosylphosphorylcholin	Merck	567735
Fötales Rinderserum	ThermoFisher
L-Glutamin	ThermoFisher
Penicillin und Streptomycin	Sigma	P4333
Eagle" s minimal essentielles Medium	Sigma	M4655