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Methodenartikel

Behandlung mit Vancomycin Calcium-Sulfat und autogener Knochen in eine verbesserte Kaninchen-Modell der Knochenentzündung geladen

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DOI:

10.3791/57294

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14. März 2019

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1Department of Medicine, Zhejiang Academy of Traditional Chinese Medicine, 2Department of Orthopaedic Surgery, Tongde Hospital of Zhejiang Province, 3Institute of Orthopaedics and Traumatology, First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University, 4Department of Clinical Laboratory, Tongde Hospital of Zhejiang Province

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Diese Studie bietet eine verbesserte Kaninchen Modell durch die Blockierung der gleichen Menge an Bakterien im Knochenmark mit Staphylococcus Aureus infiziert. Vancomycin geladen-Calcium-Sulfat und autogener Knochen sind für Antibiotika und Knochen Repair-Behandlung verwendet. Das Protokoll könnte hilfreich für das Studium Knochenentzündung und Regeneration.

Zusammenfassung

Knochenentzündung entsteht durch bakterielle Invasion, die extrem schwierig ist, in der klinischen, orthopädischen und traumatischen Chirurgie zu behandeln. Die Knochenentzündung führen anhaltende Entzündung, Osteomyelitis und eventuelle Knochen Pseudarthrose. Einrichtung eine praktikable, reproduzierbare Tiermodell ist wichtig, die Infektionsforschung und antibiotische Behandlung Knochen. Als ein in-vivo-Modell ist das Kaninchen-Modell in der Infektionsforschung Knochen verbreitet. Frühere Studien über Kaninchen Knochen jedoch Infektionsmodelle zeigte, dass der Infektionsstatus widersprüchlich, da die Menge der Bakterien Variable war. Diese Studie bietet eine verbesserte chirurgische Methode zur Induktion Knochenentzündung auf ein Kaninchen, durch die Blockierung der Bakterien im Knochenmark. Mehrstufige Bewertungen können dann um zu überprüfen, die Modellierungsmethode durchgeführt werden.

In der Regel dominieren Debridement nekrotischen Gewebes und Implantation von Vancomycin-geladenen Calcium-Sulfat (VCS) in Behandlung mit Antibiotika. Obwohl Calcium-Sulfat in VCS Osteocyte kriechen und Knochenneubildung zugute kommt, treten massive Knochendefekte nach Debridement. Autogener Knochen (AB) ist eine attraktive Strategie Knochendefekte für die Behandlung von massiven Knochendefekte nach Debridement nekrotischen Knochens zu überwinden.

In dieser Studie wird das Steißbein als ein autogener Knochen implantiert in den Knochendefekt verwendet. Knochen-Reparatur wurde gemessen mit Mikro--Computertomographie (Mikro-CT) und histologische Analyse nach Tieropfer. Infolgedessen wurde in der VCS-Gruppe Knochen Pseudarthrose konsequent erhalten. Im Gegensatz dazu waren die Knochen defekt Bereiche in der VCS-AB-Gruppe deutlich verringert. Die vorliegenden Modellierungsmethode beschrieben eine reproduzierbare, machbare und stabile Methode, um eine Infektion Knochenmodell vorzubereiten. Die VCS-AB Behandlung führte zu niedrigeren Knochen Pseudarthrose Raten nach Behandlung mit Antibiotika. Das verbesserte Knochenmodell Infektion und die Kombinationsbehandlung von VCS und autogener Knochen könnten hilfreich bei der Untersuchung der zugrunde liegenden Mechanismen in der Knochenregeneration Infektion und Knochen für orthopädische Traumatologie Anwendungen relevant sein.

Einleitung

Knochen-Infektion führt in der Regel von Bakterien oder anderen Mikroorganismen Invasion nach Trauma, Frakturen oder anderen Knochen Krankheiten1. Knochenentzündung kann ein hohes Maß an Entzündungen und Knochen Zerstörung des Gewebes führen. In der Klinik ist Staphylococcus Aureus (S. Aureus) die vorherrschende Erreger von Knochen Infektion2,3. Die Knochenentzündung ist schmerzhaft, schwächende, und dauert oft einen chronischen Verlauf, der extrem schwer zu4zu behandeln ist. Derzeit haben Debridement von nekrotischen Gewebes und Implantation von Vancomycin-geladenen Kalzium (VCS) Perlen als eine effiziente Strategie für die Steuerung der lokalen Infektion5,6bestätigt worden. Allerdings erlebten 10 % bis 15 % der Patienten einen längeren Knochen-Reparatur-Prozess, verzögerter oder Pseudarthrose nach Anti-Infektion Behandlung7. Der Großteil der ein Knochendefekt ist das schwierigste Thema für orthopädische Chirurgen. Ein autologes Knochentransplantat gilt als die optimale Knochenersatzes in Knochen Pseudarthrose Behandlung8,9.

Bis heute wurden die meisten Studien auf Knochen wurden Infektion und Implantation von autologem Knochen in verschiedenen Tiermodellen, wie z. B. Ratten, Kaninchen, Hunde, Schweine und Schafe10,11durchgeführt. Kaninchen-Modelle sind am häufigsten für Knochen Infektion Studien, als erste von Norden und Kennedy in 197012,13durchgeführt. In unseren früheren Studie wir Kaninchen Modelle nach Norden Methode verwendet, und wir fanden, dass die Menge von S. Aureus in Knochenmark injiziert nicht genau quantifiziert werden konnte, da das Blut austreten aus dem Knochenmark zu Bakterien Lösung Überlauf geführt.

Dieser Artikel stellt eine verbesserte chirurgische Methode zur Induktion Knochenentzündung auf Kaninchen. Am Ende des Verfahrens wurden ein Bluttest Biochemie, eine bakteriologische Untersuchung und einer histologischen Untersuchung durchgeführt, um das Knochenmodell Infektion zu überprüfen. Dann VCS war implantiert, um Infektion zu verhindern, und autogener Knochen implantiert wurde, zur Förderung der Knochenregeneration.

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Protokoll

Die Kaninchen, die in der vorliegenden Studie verwendet wurden gemäß dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren behandelt. Die experimentellen Verfahren folgten die Regeln für die Bioethik Komitee von Zhejiang Academy von traditionelle chinesische Medizin.

1. Vorbereitung der Bakteriensuspension

  1. Lösen Sie 0,5 mg von S. Aureus Gefriertrocknung Pulver (ATCC 6538) mit 0,3 mL Kulturmedium Luria-Bertani auf. Mischen Sie Fahrwerk komplett.
  2. Streifen der Bakterien-Suspension auf tryptic Soy Agarplatten und inkubieren Sie die Bakterienkolonien bei 37 ° C 16 h.
  3. Wählen Sie eine einzelne bakterielle koloniebildenden Einheit (KBE) und Kultur in tryptic Soy Bouillon Rohre für 24 Std. durchführen einer Subkultur für ca. 24 h bei 37 ° C, und erhalten Mitte logarithmische Wachstum Phase Bakterien nach 16 bis 18 Uhr, wenn die optische Dichte (OD) Wert 0,6 bei 600 nm 14.
  4. Übertragen Sie 1 mL Suspension Bakterien in ein Zentrifugenröhrchen. Für 5 min bei 825 x g und 4 ° C zentrifugiert und den Überstand verwerfen. Aufschwemmen Sie und waschen Sie die Bakterien mit 100 µL Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS); Wiederholen Sie diesen Schritt 3 Mal. Zu guter Letzt Aufschwemmen Sie Bakterien mit 3 mL PBS.
  5. Schätzen Sie die Bakterien-Konzentration mit McFarlands Turbidimetry15.
    1. Übertragen Sie 100 bis 500 µL Bakterien Suspension auf farbmetrischen Rohr, bis die Trübung ein 0,5 McFarland standard entspricht.
    2. Trübung durch visuellen Vergleich zu 0,5 McFarland, zu beurteilen, wenn der Inhalt der Bakterien ca. 10 erreicht8 KBE/mL.
      Hinweis: Stellen Sie sicher, dass das Volumen der Bakterien-Aussetzung für die folgenden Protokolle ausreicht. Für jedes Kaninchen ist das Volumen der Bakterien Federung weniger als 1 mL.
  6. 0,2 mL Bakteriensuspension auf einer Nährbodenplatte übertragen und gleichmäßig auftragen. Inkubieren Sie der Platte bei 37 ° C für 16 h. Graf die Bakterien-Kolonien um die KBE Bakterien Aussetzung zu überprüfen.

2. Vorbereitung des Knochens Infektionsmodelle

  1. Halten Sie männliche Neuseeland weiße Kaninchen, im Alter von 3 Monaten in einzelnen Käfigen unter Luft-kontrollierten Bedingungen (20 ± 1 ° C) und 12 h/12 h hell-dunkel Beleuchtung Zyklen. Routinemäßige Ernährung bieten und Leitungswasser täglich.
  2. Stellen Sie sicher, dass zum Zeitpunkt der Operation, dass die Kaninchen mehr als 3 kg wiegt.
  3. Betäuben Sie Kaninchen durch intraperitoneale Injektion mit Pentobarbital-Natrium (3 mg / 100 g Körpergewicht). Sicherstellen Sie, dass Kaninchen vollständig durch einen Ausfall reagieren auf eine Pfote Prise betäubt sind. Kaninchen auf dem Operationstisch während Operationsverfahren zu beheben.
    Hinweis: Stellen Sie sicher, dass die Modellierung Verfahren dauert weniger als 1 h.
  4. Rasieren Sie die proximalen Tibia-Region mit einen elektrischen Rasierer gegen die Haarwuchsrichtung. Desinfizieren Sie die Haut durch die Anwendung einer Povidon-Jod-Lösung.
  5. Markieren Sie das obere Ende des Schienbeins und der Bohrposition Loch für die Injektion mit S. Aureus (der Abstand zum oberen Ende des Schienbeins ist 1,5 cm) mit Stift und Lineal. Sicherstellen, dass die Bohrpositionen Loch sind horizontal in der Mitte der Tibia Plateau (Abb. 1A).
  6. Schneiden Sie Tibia Haut mit einem Skalpell Nr. 11 und machen Sie einen 1 cm Einschnitt in das Periost (Abbildung 1B, C). Stanzen Sie ein Loch mit Durchmesser 2 mm in der Tibia mit einem elektrischen Knochen Bohreinheit (Abbildung 1D).
  7. Drücken Sie die 2 mm Durchmesser Löcher in die Tibia Plateau mit einem Zylinder von Knochen Wachs von 2 mm Durchmesser und 2 mm Höhe (Abbildung 1E). Das spare Knochens Wachs entlang der horizontalen Ebene der Tibia Plateau (Abbildung 1F) entfernen. Überprüfen Sie, dass die 2 mm Loch voller Knochen Wachs (Abbildung 1G).
    Hinweis: Stellen Sie sicher, dass die Löcher voller Knochen Wachs sind, indem Sie das Loch mit oder ohne Blut Überlauf.
  8. Nähen Sie das Periost und Haut mit resorbierbaren chirurgischen Naht in einer vertikalen Matratze Naht zu verhindern, dass das Tier kauen die Nähte (Abbildung 1H).
  9. 1 x 108 KBE/mL der S. Aureus -Lösungen (30 µL pro 100 g Körpergewicht) mit einer 1 mL Asepsis Injektor (Abbildung 1ich) zu injizieren. Stellen Sie sicher die Nadeln dringen die Knochen Wachs und der S. Aureus -Lösung langsam in Knochenmark injizieren.
  10. Halten Sie das Tier im warmen und sauberen Bedingungen um Wärmeverlust nach Modellierung zu vermeiden. Überwachen Sie Atemfrequenz und Herzfrequenz. Beherbergen Sie nach dem Aufwachen die Kaninchen in einzelnen Käfigen mit freiem Zugang zu Futter und Wasser.

3. Bewertung der Knochen-Infektionsmodell

  1. Am Tage, 7, 14, 21 und 28 nach Infektion legen Sie Kaninchen in der Kaninchen-Fixierer mit dem Kopf und Ohr außerhalb der Fixierer.
  2. Ziehen Sie 2 mL Blut aus der Ohrmuschel Venen in einen Dipotassium Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA-K2) Antikoagulans Blut Behälter. Ein Blutgefäß entziehen Sie 1 mL Blut in ein Gefäß Blut. Zentrifugieren Sie das Serum für 10 Minuten mit einer Geschwindigkeit von 651 X g bei Raumtemperatur.
    1. Bestimmen Sie Anzahl weißer Blutkörperchen (WBC) im Vollblut mit einem Blut-biochemischen Analysator und C - reaktives Protein (CRP) durch ein Enzym-linked Immunosorbentprobe assay (ELISA) Methode16.
  3. Am Tage, 7, 14, 21 und 28 nach Infektion betäuben Sie ein Modell Kaninchen mit Pentobarbital-Natrium bei der Dosierung von 3 mg / 100 g Körpergewicht. Schneiden Sie Tibia-Haut mit einem Skalpell Nr. 11 und machen Sie einen 2 cm Schnitt in das Periost (Abb. 2A).
  4. Reinigen Sie Knochen Wachs. Debride nekrotische Knochen durch Lochen zwei angrenzenden 4,8 mm Durchmesser mit einer elektrischen Knochen Bohreinheit (Abbildung 2B). Debride nekrotisches Knochenmark und Granulationsgewebe mit einem Knochen Löffel (Abbildung 2C).
    Hinweis: Reinigen Sie Knochengewebe, während das Debridement, Knochengewebe, die restlichen im Knochenmark zu vermeiden.
  5. Kratzen Sie und reinigen Sie das Knochengewebe zwischen den beiden Bohrungen (Abb. 2D).
  6. 1 mL Knochenmark auf Schafe Blutagar Platten zu verbreiten. Platten über Nacht bei 37 ° c inkubieren Wählen Sie Platten von 30 bis 300 Kolonien, und berechnen Sie die Anzahl der Kolonien.
  7. Am Ende der 28. Tag nach der Infektion extrahieren Sie Tibia Exemplare an den Rändern der Knie und Sprunggelenk. Fix die Tibia Exemplare in 4 % Paraformaldehyd für 24 h Decalcify der Tibia-Proben in 10 % EDTA für 8 Wochen.
  8. Die Tibia Exemplare in einer abgestuften Reihe von Ethanol Verdünnungen zu entwässern, und dann in Paraffin Wachs einbetten. Schneiden Sie 4 aufeinander folgenden 5 µm Abschnitte aus den koronalen Ebenen. Führen Sie Abschnitte mit Hämatoxylin und Eosin (H & E) Färbung Kit zu Flecken.
  9. Verwenden Sie ein Mikroskop, um die befleckte Abschnitte anzuzeigen und Datensatz übertragen Lichtbilder mit standard-Software.

4. Vorbereitung der VCS Perlen

  1. 9,5 g von medizinischem Calcium-Sulfat 1 g Vancomycin Hydrochlorid Pulver hinzu, und fügen Sie dann 3 mL normale Kochsalzlösung für die gemischte macht. Mischen Sie sie gründlich mit einem Spatel für 30 bis 45 s.
  2. Platzieren Sie das gemischte Produkt in eine flexible Silica-Gel-Form (Zylinder mit Durchmesser von 4,8 mm und 4,8 mm Höhe), und bei Zimmertemperatur trocknen Sie, für 15 min. die VCS-Perlen durch Biegen der Formwerkzeugs entfernen.

(5) Antibiotika-Behandlung und Implantation autogener Knochen

  1. Betäuben Sie Modell Kaninchen mit Pentobarbital-Natrium bei der Dosierung von 3 mg / 100 g Körpergewicht aufdem 28 Tag nach Infektion . Die proximalen Tibia-Region mit einen elektrischen Rasierer zu rasieren. Desinfizieren Sie die Haut durch die Anwendung von Povidon-Jod-Lösung.
    Hinweis: Stellen Sie sicher, dass die Modellierung Verfahren weniger als 1 h.
  2. Rasieren Sie die Tail-Region mit einen elektrischen Rasierer zu und desinfizieren Sie das Heck durch die Anwendung von Povidon-Jod-Lösung.
  3. Reduzieren Sie die Rute mit einer chirurgischen Schere. Schneiden Sie Rute Haut mit einem Skalpell Nr. 11 und offenbaren Sie das Steißbein zu. Die Haut an der Rute Region mit resorbierbaren chirurgisches Nahtmaterial in einer vertikalen Matratze Naht zu verhindern, dass das Tier kauen die Fäden vernähen.
  4. Entfernen Sie alle Muskeln, Weichteile und Periost. Lösen Sie das Steißbein an jedem Gelenk zu und übertragen Sie das Knochenstück zu, um eine 100 mm Kunststoff Schale mit steriler Kochsalzlösung.
  5. Implantat-4er VCS Perlen (Zylinder Durchmesser 4,8 mm und 4,8 mm Höhe, 1,25 mg Vancomycin pro Stück Perle) in das Knochenmark Hohlraum gebogenen Pinzette (Abb. 2E).
  6. Füllen Sie den Knochendefekt mit 8 Stück autogener Knochen (Zylinder mit Durchmesser von 2 mm und 4 mm Höhe pro jedes Stück) mit gebogenen Pinzette (Abb. 2E).
  7. Nähen Sie das Periost und Haut mit resorbierbaren chirurgisches Nahtmaterial in gewissem Matratze Naht (Abbildung 2F).
    Hinweis: Halten Sie die Temperatur bei 25 ° C, während der Operation.
  8. Halten Sie das Tier in warmen und sauberen Bedingungen um Wärmeverlust nach der Operation zu vermeiden. Überwachen Sie Atemfrequenz und Herzfrequenz. Beherbergen Sie nach dem Aufwachen die Kaninchen in einzelnen Käfigen mit freiem Zugang zu Futter und Wasser.

6. Beurteilung der antibiotischen Tätigkeit

  1. Kaninchen in ein Kaninchen Fixiermittel, und legen Sie den Kopf und Ohr außerhalb der Fixierer auf 2, 4, 6 und 8 Wochen nach der Behandlung.
  2. Auricularis Adern mit EDTA-K2 Antikoagulans Blutgefäß entziehen Sie Blut. Ein Blutgefäß entziehen Sie 1 mL Blut in ein Gefäß Blut. Zentrifugieren Sie das Serum für 10 Minuten mit einer Geschwindigkeit von 651 X g bei Raumtemperatur.
  3. Bestimmen Sie die Anzahl weißer Blutkörperchen (WBC) im Vollblut mithilfe Blut biochemischen Analysator und C - reaktives Protein (CRP) durch einen ELISA-Methode-16.

7. Bewertung der Knochenregeneration

  1. Einschläfern Kaninchen durch die Injektion mit einer über Dosierungen von Pentobarbital-Natrium, am Ende des 8 oder 12 Wochen nach der Behandlung.
  2. Extrahieren Sie Tibia Exemplare, an den Rändern der Knie und Sprunggelenk. Debride Muskeln und Faszien Schichten.
  3. Analysieren Sie die Struktur der Tibia mittels Mikro-Computertomographie (Mikro-CT). Wählen Sie einen ovalen Bereich 4,8 mm Durchmesser und 9,6 mm lange wie der Region of Interest (ROI). 3D Modelbilder mit Bitmap-Daten zu rekonstruieren.
  4. Wählen Sie Resultate von das Verhältnis Volumen/Gewebe Knochenvolumen (BV/TV), trabekuläre Dicke (Tb.Th), Trabekel Anzahl (Tb.N) und trabekuläre Trennung (Tb.Sp)from the3D Modelle zur Knochenregeneration zu beurteilen.

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Ergebnisse

Bewertung der Knochen-Infektionsmodell
Nach Infektion mit S. Aureusähnelten die pathologischen Erscheinungen von Kaninchen das repräsentative Symptom der chronischen Osteomyelitis in der Klinik. In unserer Studie wurden 30 Kaninchen infiziert, unterworfen als eine Modellgruppe und 10 Kaninchen als Kontrolltiere unterzogen wurden. Alle Modell-Kaninchen infiziert haben Nebenhöhlen der Tibia lokalen Site, mit weißen und gelben Eiter über Flow aus den Nebenhöhlen<...

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Diskussion

In den bisherigen Studien wurden verschiedene Arten von Tiermodellen konstruiert, um sowohl akute und chronische Knochenentzündung zu studieren; die Suche nach dem idealen Modell weiterhin17,18. Darüber hinaus dürfte das ideale Knochenmodell Infektion zu simulieren die pathologischen Merkmale der Knochenentzündung im klinischen Umfeld, während die Modellierungen Perioden, bleiben, kostengünstig und einfach durchzuführen. So weit, Kaninchen Knochen Infektionsmodel...

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Offenlegungen

Die Autoren berichten keine Interessenkonflikte in dieser Arbeit.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (81803808, 81873062), Zhejiang Provincial Medical und Health Science und Technology Fund (2017KY271) und der Wissenschaft und Technologie-Projekt der Provinz Zhejiang (2017 37181) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
resorbierbares chirurgisches NahtmaterialJinghuan18S0604A
Asepsis-InjektorJinglong20170501
KnochenwachsETHICONJH5CQLM
CCD-KameraOlympusDP72
EDTA-K2 gerinnungshemmendes BlutgefäßXINGE20170802
Elektrische KnochenbohreinheitBao KangBKZ-1
ElektrorasiererCodos3800
flexible KieselgelformWRIGHT1527745
Hämatoxylin- und Eosin-FärbekitBeyotime20170523
Luria-Bertani KulturmediumBaisi Biothchnology20170306
Medizinisches CalciumsulfatWRIGHT1527745
Mikrocomputertomographie (Mikro-CT)BrukerSkyScan 1172 
MikroskopOlympusCX41
Neuseeländische weiße KaninchenZhejiang Experimental Animal Center SCXK 2014-0047
Nr. 11 Skalpell Yuanlikang20170604
normale KochsalzlösungMingsheng20170903
PBSTBD(Jingyi)20170703-0592
Pentobarbital-NatriumMerk2070124
Povidon-Jod-LösungLierkang20170114
S. aureus GefriertrocknungspulverChina Allgemeines Mikrobiologisches Culture Collection CenterATCC 6538
Schafblut-AgarHuanKai Mikrobielle3103210
tryptische Soja-Agar-PlattenHuanKai Mikrobielle3105697
tryptische Sojabrühe-RöhrchenHuanKai Mikrobielle3104260
VancomycinLillyC599180

Referenzen

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