Miniaturisierte Probenvorbereitung für Transmissions-Elektronenmikroskopie

Summary

Instrument und Verfahren zur Herstellung von Nanoliter große Probenvolumina für Transmissions-Elektronenmikroskopie wird vorgestellt. Papier-Blot-Schritte sind nicht erforderlich, wodurch die nachteiligen Folgen, die dies für Proteine, deutlich reduziert Probenverlust und ermöglicht die Analyse der einzelnen Zelle lysate für visuelle Proteomics haben kann.

Abstract

Aufgrund der jüngsten technologischen Fortschritt wird Kryo-Elektronenmikroskopie (Cryo-EM) zunehmend eine Standardmethode für die strukturelle Analyse von Protein-komplexe in atomarer Auflösung. Protein Isolationstechniken und probenvorbereitungsmethoden für EM bleiben jedoch einen Engpass. Eine relativ kleine Anzahl (100.000 auf ein paar Millionen) der einzelnen eiweißteilchen müssen für die hochauflösende Analyse von Proteinen durch die einzelnen Partikel EM Ansatz, Herstellung miniaturisierter Probe Umgang mit Techniken und Prinzipien mikrofluidischen abgebildet werden machbar sind.

Eine miniaturisierte, beflecken-papierfrei EM Raster Vorbereitung Methode zur Probe Vorkonditionierung, EM Raster Grundierung und Post-Processing, die verbraucht nur Nanoliter-Volumen der Probe wird vorgestellt. Die Methode verwendet eine Dosieranlage mit Sub-Nanoliter Präzision, Kontrolle der Flüssigkeitsaufnahme und EM Raster Priming, eine Plattform, die Raster-Temperatur, wodurch die Bestimmung der relativen Luftfeuchtigkeit über das EM-Raster und einen Pick-und-Sprung-Mechanismus zur Probe zu kontrollieren Verglasung. Für Cryo-EM ein EM-Gitter befindet sich auf der Bühne mit kontrollierter Temperatur und die Probe wird in einer Kapillare abgesaugt. Die Kapillare Spitze befindet sich in der Nähe der Oberfläche, das Gitter wird mit der Probe geladen und Exzess ist neu in der Microcapillary abgesaugt. Anschließend wird die Probe Film stabilisiert und leicht verdünnt durch kontrollierte Wasserverdampfung durch den Versatz der Plattform im Vergleich zu den Taupunkt Temperatur geregelt. Zu einem bestimmten Zeitpunkt wird der Pick-Sprung-Mechanismus ausgelöst, Grundierte EM Netz in flüssigem Ethan für Probe-Verglasung schnell zu übertragen. Alternativ stehen Probe-Konditionierung Nanoliter große Probenvolumina auf negative Fleck (NS) EM vorzubereiten.

Die Methoden stark Probe Verbrauch reduzieren und vermeiden Ansätze potenziell schädliche Proteine, wie z. B. das Filterpapier Beflecken in konventionellen Methoden verwendet. Darüber hinaus ermöglicht die winzige Menge der Probe erforderlich neue experimentelle Strategien, wie schnelle Probe Konditionierung, Kombination mit einzelligen Lyse für "visuelle Proteomics" oder "Verlustfrei" total Probenvorbereitung für die Quantitative Analyse der komplexen Proben.

Introduction

Hard- und Software für die strukturelle Analyse von Protein-komplexe durch Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM) hat in den letzten Jahren massiv vorangetrieben. Die vorgenommenen Verbesserungen ebnete den Weg für eine "Entschließung Revolution"^1,2 und Strukturforschung, grundlegend verändert. Die Revolution begann mit dem Aufkommen der Cryo-Elektron Mikroskopie (Cryo-EM)^3,4, so dass die Vorbereitung von biologischen Proben unter physiologischen Bedingungen Strahlenempfindlichkeit abnimmt und verhindert Probe verdampfen im Hochvakuum der Getriebe-Elektronenmikroskop-⁵. In den folgenden Jahren stieg die inkrementellen Fortschritts allmählich die erzielbare Auflösung. Unter diesen Neuerungen waren die Anwendung der Feldemission Gewehren^6,7, und in jüngerer Zeit, verbessert Daten-Analyse-Algorithmen, z. B. maximum-Likelihood-Methoden-^8,-⁹. Direkte Elektron Detektors Kameras^10,11,12,13, Filmmodus Bildgebung und der zugehörigen Software Entwicklungen^{14,15, 16 , 17}, zur Verfügung gestellt des endgültigen Durchbruch zu atomarer Auflösung für biologische Proben vorgeschriebenen Einzelkorn Analyse (für eine Rezension siehe Cheng, Grigorieff, Et al. ¹⁸). die Bedeutung der Cryo-EM wurde vor kurzem durch die Verleihung des Nobelpreises für Chemie zu drei von den Pionieren erkannt.

Zu eine biologische Probe durch TEM image, die Methode verwendet, um das EM-Raster mit Probe (nachfolgend als "Raster Vorbereitung" genannt) zu laden muss sicherstellen, dass die daraus resultierenden Probe-Schicht (i) dünn genug ist (< 100 nm), vermeiden umfangreiche Lärm durch unelastische oder multiplizieren verstreut Elektronen, (Ii) hält die Hochvakuum des Elektronenmikroskops, und (Iii) die Biomoleküle vor Strahlenschäden schützt. Zwei Methoden werden verwendet, um diese Voraussetzungen zu erfüllen: Negative Fleck(NS)^19,20 Verfahren (Abb. 1A) adsorbieren, die Probe zu einem dünnen Carbon-Film, Biomoleküle in amorphen Schwermetall einbetten und dann ermöglichen Sie die Montage an Luft trocknen. Dies ist einfach und schnell, und die geladenen EM-Raster (nachfolgend als "Probe Grids" genannt) sind einfach zu speichern und kann für längere Zeit aufbewahrt werden (in der Regel Jahre). In TEM die Vorbereitungen ausstellen, hohen Kontrast aufgrund der NS und Elektron-Dosen als Cryo-Präparate zu tolerieren, aber die Auflösung beschränkt sich auf ca. 20 Å Cryo-EM-Verfahren, die (Abbildung 1B) beschäftigen löchrigen Kohlenstoff unterstützt. Eine dünne Folie aus der Beispiellösung erstreckte sich über die Löcher und das EM-Raster stürzte sich in ein Cryogen, in der Regel flüssiges Ethan zu schnell abkühlen unter-150 ° C. Das Ergebnis ist eine amorphe, verglast, 50 bis 100 nm dicken Film der Lösung in die Löcher der Unterstützung. Dünne, amorphe Film widersteht das Hochvakuum im Elektronenmikroskop und im Idealfall, biologische Strukturen in ihrem nativen Zustand bewahrt. Die Verfahren kann biologische Proben in hoher Auflösung abgebildet werden. Jedoch sind Sample-Gitters bei Temperaturen unter-150 ° C jederzeit zur Entglasung vermeiden aufzubewahren. Es kann mit einer relativ hohen Elektron Dosis aufgrund der niedrigen Temperatur, aber der Kontrast abgebildet und Signal-Rausch-Verhältnis ist dennoch gering. Daher durchschnittlich Techniken werden eingesetzt, um den Kontrast zu erhöhen und, sofern die Probe aus verschiedenen Blickwinkeln abgebildet wird, eine hochauflösende dreidimensionale (3D) Karte rekonstruiert werden kann. Die am häufigsten verwendeten und sehr erfolgreiche Methode zur 3D-Rekonstruktion ab sofort ist der Einzelkorn-Ansatz. Eine aktuelle Übersicht finden Sie unter Cheng bei al.¹⁸.

Negativen Fleck TEM (NS-EM) ist wichtig für das Screening und Qualitätskontrolle, bei hohem Kontrast erforderlich ist oder wenn nur begrenzte Mengen an Probe zur Verfügung stehen (Adsorption an den Kohlenstoff-Film im Allgemeinen konzentriert sich die Probe). Einzelkorn Cryo-EM ist die Gold-Standard-Methode, wenn hochauflösende 3D Rekonstruktionen von der Proteinstruktur angestrebt werden.

Abbildung 1: Prinzipien der TEM Raster Vorbereitung und Vergleich zwischen klassischer (Bereich A, B) und einem mikrofluidischen Ansatz (Feld C, D). A) klassische NS-EM Raster Vorbereitung: über 3 µL der Probe sind von hand auf eine EM-Gitter abgedeckt mit einer kontinuierlichen Carbon Folie (nachfolgend als eine "NS-EM Grid" genannt) pipettiert (i). Nach der Inkubation für ca. 10 s, Filterpapier wird verwendet, um entfernt die überschüssige Flüssigkeit von der Seite (Ii), verlassen die adsorbierten Biomoleküle in einem dünnen Wasserfilm zu beflecken. Anschließend wird das Protein in einer Heavy-Metal-Salz-Lösung, z. B., 2 % Uranyl Acetat, für 20 inkubiert s (Iii), und wieder die Flüssigkeit wird durch Löschpapier seitlich mit Filterpapier (iv) entfernt. Schließlich bleibt das EM-Grid an der Luft trocknen. B) klassische Cryo-EM Raster Vorbereitung: über 3 µL der Probe durch einen Zeiger auf eine löchrige Carbon Folie pipettiert werden. Um eine dünne Probe Film zu bilden, wird die überschüssige Flüssigkeit von Papier-Blot-Gesicht-on aus ein- oder beidseitig (Ii) entfernt. Schließlich ist das Netz rasch in flüssigem Ethan für Verglasung (Iii) gestürzt. C) NS-EM Raster Vorbereitung mit dem CryoWriter-Setup: A 5 nL Volumen wird aus dem Probe-bestand mit einer Microcapillary (i) abgesaugt. Für Probe Konditionierung taucht die Microcapillary Spitze in die Klimaanlage-Lösung, z.B.2 % Ammoniumacetat. Ionen und kleine Moleküle werden durch Diffusion (Ii) ausgetauscht. Beachten Sie, dass die Abmessungen der Microcapillary sicherzustellen, dass der gesamte Prozess Diffusion angetrieben ist. Proteine haben viel geringere Verbreitung Konstanten als Salzionen und sind nicht wesentlich²⁴verloren. Schließlich ist die Probe verzichtet auf das Gitter und (Iii) trocknen. D) Prinzipien der Cryo-EM Raster Vorbereitung mit der CryoWriter-basierte Methode: eine EM-Raster mit einer löchrigen Carbon Folie abgedeckt ist auf der Oberfläche einer temperaturgesteuerten Plattform platziert und von Pinzette gehalten. Die Temperatur der Plattform wird mit einem Versatz von der Taupunkt-Temperatur der Grid-Umgebung gesteuert. Das Raster wird bezogen auf die Microcapillary mit der Probe verschoben und die Microcapillary wird abgesenkt, bis es wenige Mikrometer über dem Raster ist. Anschließend sind wenige nanoliter Probe daraus verzichtet, während die Bühne spiralförmig bewegt wird; überschüssige Flüssigkeit wird erneut abgesaugt (i). Nach EM Raster Grundierung die Microcapillary wird zurückgezogen und das Gitter bleibt auf dem kontrollierten Bahnsteig Temperatur (nachfolgend als Taupunkt (DP) Bühne genannt) für eine kurze Zeit erlauben eine kontrollierte Menge der Probe zu verdampfen. Für Sprung Einfrieren ist das Gitter schnell zurückgezogen von der Bühne mit der Pinzette (Ii), umgedreht um 90° in die vertikale Position und stürzte in ein Cryogen-Bad (Iii) (nachfolgend als "Pick-und-Sprung" Mechanismus genannt). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Leider haben die Gitter Vorbereitung Methoden für NS und Cryo-EM nicht wesentlich verbessert, da sie erfunden wurden. Aktuelle Nachteile sind der hohe Sample-Verbrauch (ca. 3 µL 1 mg/mL Protein) und die große Menge der Probe (> 99 %) verloren (Abb. 1A, B). Darüber hinaus ist die klassische Methode verwendet, um Netze für Cryo-EM vorbereiten eine harte Prozedur für Proteine: zuerst, es beinhaltet einen umfangreichen Gesicht-auf Papier-Blot-Schritt (Abbildung 1B, Ii), und zweitens ist das Protein der Luft-Wasser-Grenzfläche ausgesetzt für eine erhebliche Menge an Zeit²¹. Hier eine alternative Methode zum Beispiel Vorklimatisierung Raster Probenvorbereitung und Nachbearbeitung (Raster zu trocknen oder Verglasung) für NS-EM (Abbildung 1C) oder Cryo-EM (Abbildung 1D) dargestellt. Die hauseigene gebaute Setup, genannt "CryoWriter", verwendet miniaturisierte Beispiel Umgang mit Technologie und mikrofluidischen Prinzipien zu Aspirieren, Zustand und verzichten Probe, Vermeidung von Papier Löschpapier komplett und bieten alternative Methoden, um dünne Proben für Cryo-EM. Es deutlich reduziert den Verbrauch der Probe und verbessert Benutzersteuerelement über Probenvorbereitung als Ganzes. Darüber hinaus ermöglicht die Methode neuartige experimentelle Anwendungen; wie die Herstellung von isolierten biologischen Komponenten einzelner Zellen in ein Konzept namens "Einzelzelle visuelle Proteomics"^22,23,24,25.

Protocol

Ein "CryoWriter" (Abbildung 2, siehe vorherige Arbeit^24,26,27) oder gleichwertigen Instrumentierung für die folgenden Protokolle erforderlich ist. Eine Liste der Lieferanten für die wichtigsten Teile und Verbrauchsmaterialien ist in der Tabelle der Materialiengegeben.

(1) negative Fleck (NS) Raster Vorbereitung

1. Schalten Sie das Gerät und starten Sie die Software. Initialisieren Sie alle notwendigen Module (Spritze Pumpensteuerung, motorisierten Stadien, Überwachungskameras und Taupunkt Bühne).
2. Cool die Probenträger und der Taupunkt Bühne. Falls erforderlich, stellen sicher, dass die Taupunkttemperatur Stufe reguliert wird 1 bis 2 ° C über dem Taupunkt.
   Hinweis: Die Bühne wird von einem kommerziellen Peltier Gerät mit einem PID-Regler gekühlt.
3. Bereiten Sie NS, indem ein 100 oder 200 µL PCR-Rohr mit 100-150 µL des NS (z.B. handelsübliche 2 % Methylamin wolframat). Legen Sie das Rohr auf den gekühlten Probenträger des Instruments.
4. Positionieren Sie die Probe.
   1. Legen Sie die Probe (0,5 - 1 µM) in ein 100 oder 200 µL PCR-Röhrchen. Wenn weniger als 50 µL der Probe zur Verfügung steht, die Unterseite einer PCR-Röhre mit einer Rasierklinge abgeschnitten und auch als Muster verwenden. Dadurch wird sichergestellt, dass die Microcapillary die Probe leicht erreichen kann.
      Hinweis: Es ist am einfachsten zu Proben von 100 oder 200 µL PCR Tubes, Aspirieren, weil die Microcapillary später verwendet, um die Probe Aspirieren leicht geneigt ist und die Förderhöhe z-Richtung begrenzt ist.
   2. Stellen Sie den PCR-Rohr/Behälter auf den gekühlten Probenträger in das Instrument, um Verdunstung zu verhindern. Alternativ können Proben von well-Platten im Mikroskop Bühne Top Inkubator bei Raumtemperatur abgesaugt werden; Kühlung ist für well-Platten nicht implementiert.
5. Positionen zu definieren. Verwenden Sie den CryoWriter-Joystick, der steuert die motorisierten Kreuztisch und Software Steuertasten für lineare x-, y- und z-Stufen, die Microcapillary zu positionieren. Verwenden Sie die Kamera, um die Position der Kapillare zu überprüfen.
   1. Verschieben Sie die Microcapillary zum Beispiel Stausee. Tauchen Sie die Spitze in der Probenflüssigkeit und speichern Sie diese Position als "Probe".
   2. Verschieben Sie der Microcapillary in das NS-PCR-Röhrchen, Tauchen Sie die Spitze in die NS-Lösung und speichern Sie diese Position als "Fleck".
   3. Legen Sie die Microcapillary etwa 100 µm, oberhalb der Mitte des Schlitzes wo die EM-Raster positioniert werden und speichern Sie diese Position als "Grid_save".
6. Aspirieren Sie Probe und für NS-EM Zustand.
   1. Wenn nicht bereits installiert, montieren Sie eine 10-µL Spritze (0,46 mm Innendurchmesser) auf eine Spritze präzisionspumpe.
   2. Kleben Sie ein Ende des eine 30 cm lange Fused-Silica Microcapillary (Außendurchmesser 360 µm, Innendurchmesser 150 µm) an der Spritze an.
   3. Schließen Sie das andere Ende des Microcapillary zu einer kurzen (5 cm) lang konisch Microcapillary über Presssitz Stecker. Die kegelförmige Spitze des kurzen Microcapillary bildet die dispensionsspitze.
   4. Füllen Sie die Spritze mit entgastem bidestilliertem Wasser (DdH₂O; System Flüssigkeit) und vermeiden Sie die Bildung von Luftblasen zu.
   5. Ein paar Dutzend nanoliter System Flüssigkeit zu verzichten und jeden Tropfen aus der Microcapillary mit einem fusselfreien Tuch entfernen.
   6. Doppelklicken Sie auf die gespeicherte Probenort. Diese Positionen der Microcapillary in der Probe gut. Während die Kapillare in Bewegung ist, verzichten Sie 3 x 0,5 nL System Flüssigkeit kurz vor die Microcapillary-Spitze in der Probe zu verhindern, dass die Luftblase gefangen es (siehe Anmerkung 2 unten) eingetaucht ist.
   7. Aspirat 5 nL Probe.
   8. Doppelklicken Sie auf die gespeicherte Position der NS. Die Microcapillary ist vom Probenbehälter zurückgezogen und an den NS-Stausee automatisch verschoben. Während die Kapillare bewegt, manuell verzichten 3 x 0,5 nL Probenflüssigkeit kurz vor die Spitze in das Reservoir eingetaucht ist um sicherzustellen, dass es keine Luft gibt sprudelt (siehe Anmerkung 2 unten).
      Hinweis: wichtig: (1) beim Wechsel vom Streben nach Abgabe Modus oder umgekehrt, es ist ein kleiner Verlust in Kolbenhub fällig, in den Gängen der Spritzenpumpe Spiel. Laut Hersteller liegt die Gegenreaktion einer neuen Einheit zwischen 7 und 12 µm. Für unsere Spritze mit einem Fass-Durchmesser von 0,46 mm entspricht dies 1 – 2 nL. Daher kann 1-2 nL "entfallen" bevor Probe tatsächlich abgegeben wird. Ein winziger Tropfen beginnt in der Regel, um die Microcapillary-Spitze nach der dritten 0,5 verlassen nL Schritt zu verzichten. (2) eine Luftblase gefangen oberhalb/unterhalb der Probe würde machen Dosierung ungenauer und Probe Konditionierung durch Diffusion verhindern.
   9. Lassen Sie die Microcapillary für 3-12 min, abhängig von der Probenpuffer und Düsengeometrie eingetaucht.
      Hinweis: Je höher die Salz und/oder Phosphat Konzentration im Puffer, desto länger benötigt Tauchzeit. NS diffundiert (relativ schnell) in der Probe-Stecker beim Puffer Salze (relativ schnell) und Protein (viel langsamer) diffus heraus. Dies senkt die Konzentration von Salzen der Puffer in der Probe, die verhindern, dass sie kristallisieren, wenn der geladene Gitter trocknet. Darüber hinaus ist Phosphat tendenziell einen Niederschlag in Kombination mit NS zu bilden.
7. Bereiten Sie ein Raster und hinterlegen Sie eine Stelle der konditionierten Probe zu.
   1. Während die Probe konditioniert werden ist, nehmen Sie ein Stück Klebeband und ein PDMS-Block und reinigen Sie die Oberseite der PDMS anwenden und entfernen das Klebeband um sicherzustellen, dass es kein Staub. Setzen Sie die PDMS-Block in einer Petrischale.
      Hinweis: Neue PDMS Blöcke stammen aus dem Reinraum.
   2. Sorgfältig wählen Sie ein Gitter (z. B.Cu, 200 oder 400 Mesh mit Parlodion/C-Film beschichtet). Achten Sie darauf, nur den Rand des Gitters mit der Pinzette berühren. Legen Sie es auf die saubere PDMS-Block mit dem Kohlenstoff-Film nach oben.
   3. Ort der PDMS-Block mit dem Raster in eine Glimmentladung Lufteinheit und glühen die Entlastung es für 20 s mit 100 W Leistung bei 0,4 Mbar. Speichern Sie das Raster in einer verschlossenen Petrischale. Mal länger glühen Entlastung führen in der Regel eine größere Verbreitung des hinterlegten Probenvolumen in der Startaufstellung. Infolgedessen wird die Fleck Schicht dünner (schwächere Fleck).
   4. 1 min vor Ablauf der Tauchzeit, greifen die Glut entladen Raster mit der Pinzette CryoWriter. Stellen Sie sicher, dass die Elektromagneten eingeschaltet ist; Ansonsten schalten Sie ihn in der Software. Montieren Sie die Pinzette an den Elektromagneten und verwenden Sie die manuelle Mikromanipulator Schraube, um das Raster flach auf die Taupunkt Bühne, Carbon Filmseite nach oben auszurichten. Stellen Sie sicher, dass die Taupunkttemperatur Stufe reguliert wird 1 bis 2 ° C über dem Taupunkt zur Verringerung der Rate von Verdampfung nach Probe geladen wird.
   5. Wenn die Tauchzeit abgelaufen ist, doppelklicken Sie auf "Grid_save". Microcapillary-Tipp wird sicher über die rasteroberfläche platziert werden. Manuell schalten Sie die Microcapillary Spitze in Kontakt mit dem Gitter. Heben Sie die Düse von 10 µm und positionieren Sie es über das Zentrum.
      Vorsicht: Einige Proben mit Waschmittel tendenziell nach oben entlang der äußeren Oberfläche der Microcapillary, wenn aufgrund der niedrigeren Oberflächenspannung Flüssigkeit abgegeben wird. Es ist wichtig, ganz nah an der Oberfläche um solche Verluste zu verhindern.
   6. Verzichten Sie 5 nL Probe ans Netz. An einem trockenen Tag, wenn schnelle Verdunstung an der Microcapillary Spitze erfolgt, man kann auch langsam zu verzichten, bis die Probe an der Spitze ist, und dann schnell verzichten 5 nL.
   7. Die Microcapillary zurückziehen und die konditionierte Probe auf der Bühne der Taupunkt (DP-stufig) langsam trocknen lassen.
   8. Sobald die Probe Stelle getrocknet ist, entfernen Sie das Gitter und bewahren Sie sie bei Raumtemperatur in einer Gitterbox oder Petrischale.
   9. Verzichten Sie 500 nL System Flüssigkeit aus der Microcapillary und mit einem fusselfreien Tuch entfernen. Spülen Sie die Kapillare 5 Mal mit Ethanol, Reinigungsmittel oder 1 M NaOH. Dies reinigt die Microcapillary ermöglicht es, mit einer anderen Probe verwendet werden.

(2) Cryo-Raster-Vorbereitung

1. Um das Instrument und Probe vorzubereiten, führen Sie die Schritte 1.1 bis 1.5 oben beschrieben. Wenn NS nicht erforderlich ist, lassen Sie Schritte 1.3 und 1.5.2. Z.B., um die Konzentration des Puffers zu reduzieren um die Probenpuffer austauschen oder Zustand der Probe für Cryo-EM durch Dialyse, Salze oder einzuführen Additive(z. B.Trehalose, Waschmittel) den gewünschten Puffer statt NS in Schritten 1.3 und 1.5.2 verwenden.
2. Bereiten Sie flüssiges Ethan in einem standard Kryo-Behälter.
   1. Montieren Sie der Ethan-Cup, Cryo Box Halter und Spinne und füllen Sie den Cryogen-Behälter bis zum Rand mit flüssigem Stickstoff; erfordert in der Regel ca. 200 mL. Warten Sie einige Minuten, bis der Ethan-Cup abgekühlt und frei von flüssigem Stickstoff ist.
   2. Öffnen Sie die Gasflasche Ethan und lassen Sie langsam den Gasstrom in die Ethan-Tasse. Lassen Sie es mit flüssigem Ethan zu füllen, bis der Pegel ca. 2-3 mm unterhalb der Oberkante steht; Dies dauert wenige Minuten und erfordert etwa 5 mL flüssiges Ethan.
   3. Nehmen Sie eine Cryo-Box und legen Sie sie in einen freien Steckplatz im Cryogen-Container.
   4. Entfernen Sie die Spinne zu, setzen Sie den Polystyrol-Deckel oben und stellen Sie Kryogen Behälter auf die Halterung in die CryoWriter.
3. Glimmentladung ein EM-Raster.
   1. Nehmen Sie ein Stück Klebeband und ein Polydimethylsiloxan (PDMS) Block und reinigen Sie die Oberseite PDMS durch anwenden und entfernen das Klebeband (entfernt Staub) zu. Setzen Sie die PDMS-Block in einer Petrischale.
   2. Wählen Sie sorgfältig ein Raster aus der Gitterbox. Achten Sie darauf, nur den Rand des Gitters mit der Pinzette berühren. Legen Sie es auf eine saubere PDMS-Block mit dem löchrigen Carbon Film nach oben.
   3. Ort der PDMS blockieren mit dem Raster in einem Plasma Reiniger und Plasma reinigen die Oberfläche (z. B. Einsatz 75 % Ar/25% H_2, Leistung 50 W, Druck 25 mTorr). Platzieren Sie den PDMS-Block mit dem Schein entladen Raster in einer Petrischale.
4. Positionieren Sie das Raster in der Urkunde
   1. Fassen Sie die Glut entladen Raster mit der Pinzette CryoWriter. Stellen Sie sicher, dass die Elektromagneten eingeschaltet ist; Ansonsten schalten Sie ihn in der Software. Montieren Sie die Pinzette an den Elektromagneten und verwenden Sie die manuelle Mikromanipulator Schraube Raster oben flach auf der Bühne, Carbon Folienseite ausrichten.
   2. Doppelklicken Sie auf "Grid_save". Passen Sie die Microcapillary-Position, so dass die Spitze ca. 10 µm über die rasteroberfläche ist. Stellen Sie sicher, dass die Microcapillary über das Netz frei bewegen kann ohne es zu berühren, wenn nötig die Microcapillary wenige Mikrometer zurückziehen.
   3. Gehen Sie zurück zu der Mitte des Rasters und speichern Sie die neue Position als "Grid".
      Vorsicht: Richtige Benennung ist obligatorisch für die Makroskript zu arbeiten.
5. Probe und Sprung-Freeze Raster zu schreiben.
   1. Spülen Sie die Microcapillary mit ein paar Dutzend nanoliter System Flüssigkeit und entfernen Sie jeden Tropfen aus der Microcapillary mit einem fusselfreien Tuch.
   2. Starten Sie Makroskript. Das Makro führt die folgenden Schritte:
      1. Verzichten Sie 5 nL (zum Entfernen von Luftblasen an der Spitze) und gehen Sie zu Probenort.
      2. Aspirat 65 nL Probe. Die Infusion von 5 nL zurück in das Probenröhrchen. Diese Konten für System Spiel und ermöglichen synchronisierte schreiben, dh., zu gewährleisten, dass Verzicht auf Bewegung starten zur gleichen Zeit zu inszenieren.
      3. Verschieben Sie in "Startposition".
      4. "Schreiben Muster", wodurch die Microcapillary über das Netz gleichzeitig Verzicht auf 45 bewegen zu initiieren nL Probe.
      5. Danach verschieben Sie die Microcapillary zurück in die Mitte des Gitters, senken Sie es einem anderen 10 µm und abheben Sie überschüssige Flüssigkeit.
      6. Zurückziehen Sie die Microcapillary und schalten Sie den Elektromagneten. Das entlastet den Pinzetten und Eingeweihten Sprung einfrieren.
6. Greifen Sie die Pinzette und lösen Sie vorsichtig die magnetischen Adapter aus den Kolben. Schnell das Raster aus dem Ethan-Cup in den Cryogen-Behälter mit der Cryo-Box und das Raster in einen freien Steckplatz.

3. einzelne Zelle Lysate Vorbereitung

1. Elektroporation die mikrokapillaren vorbereiten.
   Hinweis: Die konische (Laser gezogen und überprüft) Fused-Silica-mikrokapillaren haben eine schützende Polyimid-Beschichtung auf der Außenseite, mit Ausnahme der Spitze, wo die Beschichtung bei der spitz zulaufenden verbrannt wird.
   1. Um den mikrokapillaren mit einer leitfähigen Schicht zu beschichten, Klebe sie in einem Winkel von 45° auf einer Metallschiene mit den Spitzen nach oben. Verwenden Sie eine Aluminiumfolie, um das untere Ende (2 cm) von den Tipps zu schützen, wie unbeschichtete Polyimid die beste Abdichtung mit Einpress-Stecker später beschäftigt bildet.
   2. Sputter hinterlegen eine klebrige Schicht von 20 nm Ti/W und dann ein 200 nm dicke Schicht von Pt.
2. Machen Sie die Microcapillary Spitze hydrophob.
   1. Bereiten Sie eine 1 M Lösung von 1-Dodecanethiol in EtOH.
   2. Die Microcapillary in der Luft für 1 min mit 100 W Leistung bei 0,4 Mbar Glimmentladung.
   3. Tauchen Sie die Spitze des Microcapillary in der 1 M Lösung von 1-Dodecanethiol für ein paar Stunden (am besten über Nacht).
      Hinweis: Es ist am besten Tipps eines Tages vor Gebrauch frisch zuzubereiten.
3. Installieren Sie eine neue Microcapillary.
   1. Die Microcapillary aus der 1-Dodecanethiol-Projektmappe entfernen, spülen Sie außen mit Ethanol und Ethanol mit einer Spritze innen bündig.
      Hinweis: Wenn keine funktionalisierten mikrokapillaren verfügbar sind, schnell glühen Entlastung die Spitze des einen Microcapillary und Tauchen sie in einen Tropfen des kommerziellen Auto Fenster-Behandlung, eine Mischung aus PDMS und Schwefelsäure. Die daraus resultierende hydrophobe Funktionalisierung ist nicht so gut wie mit 1-Dodecanethiol, aber in der Regel ausreichend.
   2. Cleave unbeschichteten Ende mit einer Kapillare Cutter.
      Hinweis: Ein sauberer Schnitt ist wichtig für eine gute Abdichtung mit dem Press-Fit-Connector.
   3. Verwenden Sie einen Zahnstocher, um tragen silberne Paste auf die scharfe Grenze zwischen Glas und Polyimid-Beschichtung gebildet, wenn die Polyimid-Beschichtung durch den Laser während des Ziehens Kapillare abgebrannt war.
      Hinweis: Diese Verstärkung ist notwendig, da die Pt-Beschichtung in dieser Region sehr schwach ist, und elektrische Leitfähigkeit kann leicht brechen.
   4. Reinigen Sie Polyimid-Ende des Microcapillary mit Aceton. Verlassen Sie einen kleinen Tropfen Aceton am Ende und stecken Sie ihn in die Öffnung des Press-Fit-Steckers. Üben Sie leichten Druck um eine gute Dichtung zu bilden.
4. Die Microcapillary Position zu kalibrieren.
   1. Schalten Sie das Gerät und starten Sie die Software, wie unter Punkt 1.1 beschrieben. Darüber hinaus Initialisieren der Mikroskop-Kamera und der Funktionsgenerator.
   2. Legen Sie einen Glas-Objektträger in den Diahalter am Mikroskop.
   3. Senken Sie die Microcapillary nahe den Objektträger und zentrieren Sie es über das Mikroskopobjektiv, bis es in der Mikroskop-Kamera-Ansicht angezeigt wird. Verwenden Sie die X - und y-Achse linear Stufen an um die Spitze der Microcapillary in der Mitte des Bildes zu positionieren. Dann senken Sie langsam die Spitze, bis sie den Objektträger leicht berührt.
      Vorsicht: Wählen Sie sehr kleine Schritte (5 µm) zu den Endanflug. Andernfalls kann die Spitze beschädigt werden.
   4. Drücken Sie auf "Kalibrieren Düse". Dies zieht die Microcapillary 40 mm und setzt diese position als Grundstellung.
5. Vorbereitung der gestempelten PDMS Stücke und ITO gleitet
   1. Mix-PDMS und Vernetzer im Verhältnis 10:1, Gießen Sie in eine große Petrischale bis zu einer Tiefe von etwa 2-3 mm. backen bei 60° C für ein paar Stunden in eine Hybridisierung Inkubator oder ein ähnliches Gerät.
   2. Mit einem Hammer und einem Stempel (12 mm Durchmesser), schneiden Sie Löcher in der PDMS-Schicht. Danach verwenden Sie ein Skalpell ausgeschnitten 2 cm lange Quadrate oder Rechtecke, darunter die Löcher gestanzte Teile zu erhalten, die auf einen Objektträger passen. In der Regel werden zwei gestempelte Stücke auf einem Objektträger montiert.
   3. Waschen Sie die PDMS-Stücke und die ITO-Folien zunächst mit Spülmittel und anschließend mit 70 % Ethanol. Platz, nass, in einer Petrischale und lassen Sie das Ethanol vollständig zu verdampfen, im Ofen bei 60° C.
   4. Glimmentladung die ITO-Folien für 1 min mit 100 W Leistung bei 0,4 Mbar und wenden Sie dann 1 mL der Beschichtungslösung (z.B.Poly-L-Lysin (PLL)). 5 min inkubieren, entfernen Sie die Lösung mit einer Pipette und anwenden 1 mL DdH₂O. leicht schütteln für 1 min, und entfernen Sie dann die DdH₂O mit einer Pipette. Lassen Sie die Folien bei 60 ° c trocknen
6. Bereiten Sie die Zellkultur. Folgen Sie Anhänger-Zell Kultivierung Standardprotokoll (z. B.Arnold, Et al. ^{24 , 25}). Samen Zellen auf ITO bei normalen Aufteilung/passagierung läuft.
   1. Nehmen Sie eine frisch PLL-beschichtete ITO Folie und fügen ein PDMS-Stück. Einige Druck um eine wasserdichte Dichtung zu bilden. Dies führt zu kleinen Brunnen mit der Folie als Basis.
   2. Fügen Sie ca. 300 µL Zellen in frisches Medium in die Vertiefungen PDMS ausgesetzt. Die Aussaatdichte sollte rund 75.000 Zellen pro Bohrloch.
   3. 1-2 Tagen unter Standardbedingungen inkubieren Sie die ITO-Folien.
7. Zelle Lysis Experiment vorbereiten:
   1. Wärmen Sie wenige Milliliter des Puffers Elektroporation (z.B.Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS vor)).
   2. Set-up für NS-EM Raster Vorbereitung vorbereiten
      Hinweis: Details zur Vorbereitung der Einrichtung werden in Schritte 1.1-1.5 (für NS) oder Schritt 2.1-2.4 (für Cryo) angezeigt. Hier beschreiben wir die wichtigsten Schritte für die NS-Vorbereitung.
      1. Bereiten Sie NS, indem ein 100 oder 200 µL PCR-Rohr mit 100-150 µL des NS (z.B. handelsübliche 2 % Methylamin wolframat). Legen Sie das Rohr auf den gekühlten Probenträger des Instruments.
      2. Verschieben Sie der Microcapillary in das NS-PCR-Röhrchen, Tauchen Sie die Spitze in die NS-Lösung und speichern Sie diese Position als "Fleck".
   3. Laden Sie die standard-Lyse-Parameter, z.B., die Lyse-Spannung.
   4. Nehmen Sie die ITO-Folie aus dem Inkubator und montieren Sie es auf dem Mikroskop-Einsatz. Verwenden Sie zwei Schrauben, die Folie auf dem Aluminium-Einsatz zu beheben und damit elektrischen Kontakt zwischen der ITO Beschichtung der Folie und der elektrisch geerdete Aluminiumrahmen.
   5. Entfernen Sie das Zellkulturmedium und waschen Sie zweimal mit 300 µL Puffer Elektroporation. Halten Sie die Zellen im Electroporation Puffer.
   6. Legen Sie die Aluminium-Einsatz hält der ITO-Folie in der live-Cell-Inkubator-Stufe auf das Setup.
   7. Suchen Sie die Zellkultur in der Mikroskop-Ansicht und wählen Sie einen Bereich mit keine Zellen. Nähern Sie die Spitze auf die ITO-Oberfläche zu und sanft berühren Sie, dann zurückziehen Sie der Spitze 100 µm und speichern Sie die Position als "Zellen".
   8. Schnell lassen die Zellkultur und Spülen der Microcapillary Spitze mit ein paar Dutzend nanoliter System Flüssigkeit dann steckte es wieder in der Zellkultur. Verzichten Sie wenige nanoliter während Eintauchen in PDMS-Brunnen, um sicherzustellen, dass keine Luft, die Bläschen an der Spitze gefangen sind.
   9. Vorsichtig nähern sich die ITO-Oberfläche (zunächst muss man an der Position "Zellen", dh., 100 µm über der Oberfläche). Zurückziehen Sie bei Berührung Tipp 10 µm.
   10. Wählen Sie eine nahe gelegenen Zelle für Lyse. Setzen Sie die Spitze der Microcapillary, über die gezielte Zelle.
8. Starten Sie das Makroskript für einzellige Lyse.
   1. Name der Position der Microcapillary sollte auf verschoben werden, nachdem eine Zelle erfolgreich lysiert wurden. Dadurch werden die NS-Stausee (NS-EM), eine Entsalzung Puffer (Cryo-EM) oder das EM-Raster (Cryo-EM). Vermeiden Sie Rechtschreibfehler und drücken Sie "ok".
   2. Das Makro geht ohne Eingreifen des Benutzers:
      1. (i) das Mikroskop Bühne und Zelle Kultur 100 µm werden verschoben auf der linken Seite ist eine Momentaufnahme der gezielte Zelle genommen und 50 nL DdH₂O System Flüssigkeit aus der Microcapillary entfallen. Das verdrängt und den hohen Salz Puffer verdünnt und osmotischen Druck auf die Zelle gilt.
      2. (II) die Bühne wird wieder an die Spitze wieder oberhalb der gezielte Zelle position verschoben. Die vordefinierte Spannung platzen wird angewendet, und nach 500 ms beginnt das Pumpsystem zu Aspirieren Sie 3 nL Probe bei einer Durchflussmenge von 2 µL/min.
      3. (III) die Bühne ist wieder nach links verschoben so dass die Zelle inspiziert werden. Erscheint ein Fenster, um Benutzereingaben bitten.
   3. Sagen Sie, ob der Lyse Schritt erfolgreich oder nicht war.
      1. Wenn die Antwort ist Nein, übernehmen, spülen Sie die Microcapillary und eine neue Zelle.
      2. Wenn die Antwort ja ist, eine Momentaufnahme der entfernten (lysierten) Zelle, und danach wird die Microcapillary an den angegebenen in 3.8.1 Ort verschoben. Wenn dies NS oder ein Puffer-Reservoir ist, verwenden die Standardbenutzeroberfläche 3 x 0,5 verzichten nL Flüssigkeit während der Microcapillary bewegt sich um sicherzustellen, dass keine Luftblasen vorhanden sind. Die Spitze ist durch das Makro in das Reservoir Flüssigkeit eingetaucht.
         Hinweis: Sie können weiterhin Zustand der Probenmaterials und Netze vorzubereiten, wie in den Abschnitten 1.6.9. - 1.7.9 für NS-EM oder Abschnitt 2.2-2.6 für Cryo-EM erläutert. Im folgenden werden die notwendigen Schritte zur Vorbereitung der NS-Grid erläutert.
   4. Lassen Sie die Microcapillary für 8-12 min, abhängig von der Düsengeometrie eingetaucht
      Hinweis: Der hohe Phosphat-Konzentration in den Puffer erfordert eine längere Tauchzeit für Klimaanlage.
   5. Verzichten Sie 5 nL der konditionierten Zelle lysate auf das Gitter.
   6. Die Microcapillary zurückziehen und das konditionierte Muster Trocknen langsam auf die Taupunkt-Bühne (DP-Bühne) geregelt 1 bis 2° C über der Taupunkttemperatur.
   7. Entfernen Sie das Gitter und bewahren Sie sie bei Raumtemperatur in einer Gitterbox oder Petrischale.

Results

Das "CryoWriter" Setup (dargestellt in Abbildung 2) entwickelte sich um die miniaturisierten EM Raster Vorbereitung vorgeschlagenen Verfahren in Abbildung 1C, Dzu testen. Abbildung 2 A zeigt einen Überblick über die verschiedenen Komponenten auf eine inverse Fluoreszenzmikroskop montiert. Eine Zelle Kultivierung Modul ist auf der linken Seite des Mikroskops installiert; ein Modul für EM Raster Vorbereitung befindet sich auf der rechten Seite. Die Zelle-Kultivierung-Modul (Abbildung 2B) ermöglicht das Wachstum der anhaftende eukaryotischen Zellen und live Cell Imaging der Zellkultur mit dem Lichtmikroskop. Einzelne Zellen werden durch die kombinierte Wirkung der osmotischen Schock, Elektroporation und Aspiration der Inhalt der Zelle in eine Microcapillary (Abbildung 2B, Abb. 6A)^24,25lysiert. Die angesaugte lysate Probe lässt dann Gitter für NS oder Cryo-EM vorzubereiten. Alternativ kann ein Lager Proteinlösung in einem PCR-Röhrchen die Aufnahmequelle. Microcapillary (Abbildung 2B) beschäftigt ist mit einem Präzisions-Pumpensystem Probenvolumina abgesaugt und Sub-nL Präzision verzichtet werden verbunden. Wie in den Protokollen wird alle Probenverarbeitung innerhalb dieses Microcapillary oder Startplatz EM selbst ohne signifikante Stichprobe Transport durchgeführt. Beispielsweise wird die gleichen Microcapillary verwendet, um einzelne Eukaryotische Zellen lysiert, Aspirieren der lysate, konditionieren und Aliquote auf EM Gitter schließlich zu verzichten. Das Raster-Vorbereitung-Modul besteht aus einer beweglichen DP-Bühne, die die Temperatur des Rasters EM platziert darauf genau kontrollierten (Abbildung 2C) ermöglicht. Für NS-TEM kann vorbereitete Sample-Gitters dann einfach aus der kalten Phase entfernt und in Luft bei Raumtemperatur trocknen. Allerdings müssen die so genannten Kaffee-Ring-Effekte, die dann zur Folge haben können für quantitative TEM vermieden werden wo Protein "Partikel" gezählt werden. Dazu Gitter auf der DP-Bühne mit einer allmählich zunehmenden Temperaturgradient verlangsamen flüssige Verdampfung langsam getrocknet werden. Für Cryo-EM ist die Temperatur des Rasters in der Nähe des Taupunktes gehalten; ein positiver Offset von ca. 8 ° C gewählt wird, so dass die kontrollierte Verdunstung der Probenflüssigkeit für Dünnschicht-Stabilisierung und Ausdünnung, die durch einen Sensor überwacht werden kann²⁶. Nach dem ausgewählten Ausdünnung mal ein Pick-Sprung-Mechanismus aktiviert ist und die Probe verglast (Abbildung 2C). Beachten Sie, dass diese stürzen Mechanismus nicht für NS-EM Netze benötigt wird, die bei Raumtemperatur gelagert werden.

Abbildung 2: Übersicht über die CryoWriter-Setup. A) Überblick über das CryoWriter Setup auf eine inverse Licht-Mikroskop (1) montiert. B) Einschub des Bereichs angegeben auf der linken Seite im Bedienfeld "A. Kultivierung Zellkompartiment (2), mit einem Microcapillary (3) für Probe Manipulation und Zelle Lysis über eine miniaturisierte PDMS basierende Kultur Zellplatte (4) positioniert. C) Einschub des Bereichs angegeben auf der rechten Seite im Panel A. 'Pick-und-Sprung"Mechanismus. Eine löchrige Carbon Film EM Rost (5) ist zwischen den Spitzen Pinzette (6) montiert und in direktem Kontakt mit der Temperatur-kontrollierten Phase (7), genannt die Taupunkt Bühne (DP-Stufe) im Haupttext horizontal positioniert. Die Bühne-Temperatur wird über einen PID-Regler und einen wassergekühlten Peltier-Element, halten es an oder in der Nähe der Taupunkt-Temperatur, abhängig von den Umgebungsbedingungen streng kontrolliert. Die DP-Bühne (7) wird auf eine motorisierte Xy-Achse zu bewegen das Netz im Vergleich zu den Microcapillary montiert. Die Microcapillary selbst werden ist montiert auf einer Z-Bühne abgesenkt, bis es sehr nah an der Oberfläche des Gitters EM ist und verwendet, um Nanoliter mittlere Volumina abdecken (eine kontinuierliche dünne Kohleschicht für NS-EM oder eine löchrige Carbon Folie für Cr auf die Probe zu verzichten Yo-EM). Beachten Sie, dass die Flüssigkeitsaufnahme und die Abgabe erfolgt mit Hilfe einer Präzisions-Pump-System (8). Die dosierte Flüssigkeit kann durch verschieben das Raster im Verhältnis zu den Microcapillary spiralförmig verteilt werden. Für Cryo-EM-Vorbereitung überträgt der Pick-Sprung einfrierende Mechanismus (9) schnell Probe geladen Raster in flüssigem Ethan (10) für schnelle Abkühlung und Probe-Verglasung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3 zeigt repräsentative Ergebnisse für NS-EM Grids vorbereitet, mit dem CryoWriter-Setup. Die Spitze der Microcapillary war beladen mit 5 nL Probe aus einer Stammlösung und getaucht in ein Reservoir von NS-Lösung (2 % Methylamin wolframat) minutenlang diffusiven Austausch von NS und Salzionen ermöglichen (für eine theoretische Diskussion siehe Arnold, et Al. ²⁴). danach die konditionierte Probe verzichtet auf die dünne Carbon Folie eines NS-EM-Rasters und getrocknet wurde. Abbildung 3 A zeigt die Verwendung eines Rasters Slot in der gleichen Weise, die komplette Tropfen, je nach Bedarf für quantitative TEM zu visualisieren. Um den Kaffee-Ring-Effekt zu vermeiden, wurde frisch Glut entladen Netz zunächst die Taupunkttemperatur (kein Wasser verdampfen) gehalten und dann langsam erwärmt auf der DP-Bühne. Beachten Sie, dass für die meisten Anwendungen (z.B. Qualitätskontrolle der Probe oder Strukturanalyse) dabei langsam trocknende nicht benötigt wird. Qualitativ hochwertige NS-Vorbereitungen sind ohne sie erhalten, wie in Abbildung 3B, Cgezeigt. Klimaanlage sind Phosphatfreie Niedrig-Salz-Puffer ca. 3 min, z. B.mit niedrig-Salz-Tris-Puffer (20 mM Tris-HCl pH 7.4 mit 50 mM NaCl), wie in Abbildung 3B mit Tabakmosaikvirus (TMV) als Beispiel. Abbildung 3 C stellt ein Worst-Case-Szenario, wie der TMV in PBS-Puffer (2,7 mM KCl, 1,5 mM KH₂PO₄, 136,9 mM NaCl, 8,9 mM Na₂HPO₄·7H2O, pH 7,4) war. Phosphat-Ionen bilden vorübergehende Kristalle mit Schwermetall Ionen des NS (siehe Abbildung 5C), Verlängerung den Klimaanlage Zeitaufwand (7 min). Anderen schwermetallsalzen können auch mit dem Raster-Vorbereitung-Modul, z. B., 2 % Methylamin Vanadat oder Ammonium Molybdat verwendet werden (siehe auch Arnold, Et Al. ²⁴). Uranyl-Acetat ist jedoch nicht geeignet; die Vernetzung dieser Fleck führt zu Aggregaten wenn die Protein-Probe in Lösung, bedingt ist, bevor Adsorption zu einem Carbon film (siehe Abbildung 5E)²³.

Abbildung 3: typische Ergebnisse für NS-Grids vorbereitet, mit dem CryoWriter-Setup, wie in Abbildung 1Cangegeben. A) Übersichtsbild eines 3 nL Tropfens auf einem Slot-Raster nach Konditionierung mit 2 % Methylamin wolframat verzichtet. B) TMV in 20 mM TRIS-Puffer. Der Inset zeigt eine 3 X-Vergrößerung der angegebenen Region. Adaptiert von Arnold, Et Al.²⁴ (weitere Berechtigungen im Zusammenhang mit dem Material exzerpiert richten Sie bitte an die ACS). C) Tabakmosaikvirus (TMV) in PBS-Puffer. Der Inset zeigt eine 3 X-Vergrößerung der angegebenen Region. Adaptiert von Arnold, Et Al.²⁴ (weitere Berechtigungen im Zusammenhang mit dem Material exzerpiert richten Sie bitte an die ACS). Skalieren Sie Bars: A, 100 µm; B, 50 nm; C, 80 nm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Typische Ergebnisse für Cryo-EM Grids vorbereitet, mit dem CryoWriter-Setup sind in Abbildung 4dargestellt. Panel-4A zeigt einen Raster-Atlas des Gebiets durch verglaste Probe abgedeckt. Panel 4 b zeigt die Homogenität des Glaskörpers Eises in einem ausgewählten Grid-Steckplatz. In beiden Fällen wurde die Probe in 25 mM HEPES-KOH pH 7.5, 50 mM NaCl Puffer mit 0,05 % Fos 14 Waschmittel. Viele Proben und Puffer wurden getestet und eine vergleichbar hoher Qualität Glaskörper Eis wurde, aber die Voraussetzungen sind Puffer abhängig (siehe auch Diskussion der Abbildung 5). Panel 4C zeigt Apoferritin Partikel und einem Bakteriophagen in Tris-HCl-Puffer (20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl; pH 7,4) abgebildet bei hohen Unschärfe Kontrast zu erhöhen. Panel 4D zeigt eine 200 kDa Membranprotein durch Amphipoles stabilisiert.

Abbildung 4: typische Ergebnisse für Cryo-EM Grids vorbereitet, mit dem CryoWriter-Setup, wie in Abbildung 1Dangegeben. Die Proben und die Puffer variieren in den gezeigten Beispielen. Alle Proben wurden auf löchrigen Carbon Filme geladen. A) Collage von Übersichtsbilder ("Raster-Atlas") einer Probe mit einer 150 kDa Membranprotein, die Peripherie des Glaskörpers Eises ist durch weiße Pfeile angedeutet. B) erweiterten Grid-Steckplatz aus einem Raster mit den gleichen Puffer, zeigen den löchrigen Carbon Film mit glasigen Eis zubereitet. Einige Löcher sind nicht mit Probenpuffer gefüllt, wie durch weiße Pfeile angedeutet. C) Carbon Loch mit verglastem Probe mit Apoferritin Proteinkomplexe und Bakteriophagen. Einschub: doppelte Erweiterung zeigt das Ende eines Bakteriophagen. Das weiße Sternchen zeigt die Kohlenstoff-Film. Beachten Sie, dass die Aufnahme mit hoher Unschärfe Kontrast zu erhöhen. D) A 200 kDa Membranprotein Amphipols wieder hergestellt. Einschub: eine 2 X Vergrößerung der der angegebenen Region mit stärkerem Kontrast dargestellt. Skalieren Sie Bars: A, 100 µm; B, 10 µm; C und D, 80 nm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Das CryoWriter-Setup ermöglicht systematisches screening für optimale EM Vorbereitung-Netzbedingungen; ein Beispiel sehen Sie in Abbildung 5A (Apoferritin 25 mM HEPES-KOH pH 7.5, 50 mM NaCl, 0,05 % Fos-14). In diesem Experiment wurde der Glaskörper Eis "ausdünnen" Temperatur variiert, aber die Ausdünnung Zeit (d.h. die Zeitspanne zwischen Beispielanwendung und Sprung Einfrieren) konstant (1 s). Bei niedrigen Temperaturen Offset (z.B. 8 K) war die Probe-Schicht zu dick. Bei höheren Temperaturen Offset, der Glaskörper Eis in den Löchern war dünner (10 K, 12 K), bis zu einem bestimmten Zeitpunkt (über 18 K) wurde das Netz vollständig trocknen (nicht dargestellt). In die Ergebnissen präsentiert hier einen Versatz von 12 K Blei eine große homogene Fläche des Glaskörpers Eis wie durch die schwarzen Pfeile angedeutet. Solche Experimente Optimierung können mit dem Puffer der Ziel-Probe mit "test" Proteine (z. B. Apoferritin) durchgeführt werden. Die besten Bedingungen gefunden werden dann auf die Zielstichprobe angewendet. Darüber hinaus Grids mit Parametern weit von das Optimum können oft erkannt werden, bei der Vorbereitung und müssen nicht in das Elektronenmikroskop, erhebliche Zeitersparnis vorgeführt. Abbildung 5 zeigt eine Galerie mit typischen Cryo-EM (Gruppe B) und NS-EM (Panels C bis E) Artefakte auch spezifisch für das CryoWriter-Setup. Die Cryo-EM-Raster mit TMV in PBS mit 0,1 % Decyl-β-D-Maltopyranoside (2,7 mM KCl, 1,5 mM KH₂PO₄, 136,9 mM NaCl, 8,9 mM Na₂HPO₄·7H2O, pH 7,4, 0.1%DM) im Panel 5 b gezeigt wurde übermäßig verdünnt. Der Hintergrund des Bildes ist körnig, weil die Salzkonzentration zu hoch geworden. Im allgemeinen scheint das visuelle Erscheinungsbild einer Probe keine lineare Funktion der Salzkonzentration zu werden; Körner werden plötzlich Prominente, wenn eine Schwellenwert-Konzentration bei der Ausdünnung erreicht ist. Beachten Sie, dass unerwünschte Stoffe durch eine Klimaanlage Schritt vor dem Gitter Vorbereitung, entnommen werden können, wie für NS-EM im Protokoll Abschnitt 1.6 beschrieben. NS kann dazu führen, dass andere Artefakte. In dem Beispiel in Feld 5C PBS-Puffer (2,7 mM KCl, 1,5 mM KH₂PO₄, 136,9 mM NaCl, 8,9 mM Na₂HPO₄·7H2O, pH 7,4) ohne Probe wurde in 2 % Methylamin wolframat für 3 min. Ausscheidungen bedingt und Kristalle sind offensichtlich und umfangreiche Kräfte auf die Carbon-Oberfläche, die zu Rissen führen. Die einzige Form der Ausscheidungen in einer bestimmten PBS und NS Konzentration reichen und können vermieden werden, indem die Probe für längere (Vergleiche Abbildung 3C) Konditionierung. Panel 5D zeigt die Peripherie eines verzichtet NS Probe Tropfens "Kaffee-Ring" ausstellen. Das quantitative, total Probenanalyse stören würde und verlangsamt den Trocknungsprozess, d. h.durch EM Raster auf die Taupunkt-Temperatur während der Beispielanwendung zu halten, und dann schrittweise Erhöhung der Temperatur um es zu trocknen (vermieden werden (siehe Abbildung 3). Panel-5E (Apoferritin in 20 mM HEPES, pH 7,0, klimatisierte 3 min) zeigt die Vernetzung von 2 % Uranyl Acetat Fleck, um Zustand Proteinproben benutzt werden kann, bevor sie auf Carbon Film unterstützt adsorbiert werden.

Abbildung 5: Systemveränderungen und Artefakte beobachtet, wenn das CryoWriter Setup verwendet wurde, um Netze für NS und Cryo-EM vorzubereiten. A) systematische Glaskörper Eis dickenschwankung; Optimierung der Raster-Vorbereitung für Cryo-EM. Die Offset Temperatur der DP-Bühne war abwechslungsreich (8 K, 12 K) halten die Ausdünnung Zeitkonstante (1 s). Die Pfeile zeigen auf die Peripherie der Probe Schicht. B) Salz Effekte; zu hoch konzentriert, war d.h.der Ausdünnung Schritt zu lang. Der Inset zeigt eine 2 X Vergrößerung der angegebenen Region. C) Salz Ausscheidungen von PBS-Puffer im Beisein von schwermetallsalzen gebildet. Proben mit PBS-Puffer müssen länger als Proben in anderen Puffer konditioniert werden. PBS-Puffer ohne Probe war hier, in 2 % Methylamin wolframat für 3 min, eine typische Zeit für andere Probe Puffer bedingt. Beachten Sie den Riss in der Carbon Film sehr wahrscheinlich durch die starken Kräfte von Ausscheidungen auf die dünne Unterstützung während des trocknenden Prozesses handeln. D) "Kaffee-Ring"-Effekt. E) Apoferritin in 2 % Uranyl Acetat bedingt, für 3 min. Uranyl Ionen erhebliche Vernetzung Aktivität und das Apoferritin weisen Cluster Form großen Aggregaten. Skalieren Sie Bars: A, 80 µm; B, 80 nm C 12 µm; D, 80 µm; E, 200 nm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Die kleine Menge und das Volumen erforderlich für EM-Raster-Vorbereitung mit dem CryoWriter-Setup ermöglicht neue Arten von Experimenten. Zum Beispiel können den gesamten Inhalt einer einzelnen Zelle gesammelt und vorbereitet für NS und Cryo-EM. Das Verfahren ist in Abbildung 6Aangegeben. Eine anhaftende, Eukaryotische Zelle (HEK 293) wird durch gleichzeitige Electroporation und Probe Absaugen (Panel 6A)²⁵lysiert. Einem Gesamtvolumen von 3 nL wird abgesaugt, die enthält die Zelle lysate, und bleibt in der Microcapillary für die Weiterverarbeitung. Für die NS-EM im Panel 6 b gezeigt war die Zelle Kultivierung Medium mit PBS-Puffer (2,7 mM KCl, 1,5 mM KH₂PO₄, 136,9 mM NaCl, 8,9 mM Na₂HPO₄·7H2O, pH 7,4) vor der Lyse der Zelle ausgetauscht. Der Inhalt der Zelle wurden in 3 aspiriert nL des Puffers und in ein Reservoir an NS bedingt, wie in Abbildung 1C für 10 min. danach angegeben, ein 5 nL-Volumen auf die kontinuierliche Carbon Folie eines NS-EM Grid verzichtet wurde. Einzelne Proteine, z.B.filamentöses Aktin und Membran-Patches mit angehängten Proteine können im Bild erkannt werden. Für die Cryo-EM, dargestellt in Abbildung6 C, ein Volumen von 3 nL wurde verzichtet auf einem löchrigen Kohlenstoff EM Raster ohne erneute Aspiration, Flüssigkeit zu entfernen. Die relativ dicke Folie Probe gebildet wurde ausgiebig vor der Verglasung ausgedünnt. Zu diesem Zweck wurde die DP-stufige Temperatur schrittweise erhöht, die Taupunkt Temperatur ab. Die Ausdünnung Prozess wurde durch ein Echtzeit-Sensor-System überwacht, bis eine vorgegebene Schwelle erreicht wurde auslösen Pick und Sprung-Mechanismus und Probe Verglasung (für Details siehe Arnold, Et al. ²⁶). Membrankonstruktionen und Proteine sind in der Abbildung erkennbar.

Abbildung 6: einzelne Zelle visuelle Proteomik mit CryoWriter Aufbau. A) Lyse einer einzelnen anhaftende Eukaryotische Zelle. Die Zelle wird auf einer funktionalisierten, ITO beschichtet (rot) Glas-Folie (2) in einer miniaturisierten Petri-Schale (3)²⁵(1, grün) angebaut. Die ITO-Schicht ist elektrisch geerdet. Microcapillary (4), die mit Platin beschichtet ist, wird die Zelle heran. Ein anfängliche osmotischen Schock (nicht angegeben) erhält, Lyse, zu erleichtern, die durch eine Reihe von elektrischen Impulsen und durch die Scherkräfte ausgeübt, während das Streben der Zelle lysate durchgeführt wird. Der Prozess kann durch Lichtmikroskopie überwacht werden; das Objektiv des Mikroskops ist angegeben (5). Einzelheiten finden Sie in unserer bisherigen Arbeit^24,25. B) NS-EM Bild der lysate aus einer einzelnen Zelle HEK-293. Filamentöse Aktin und Membran-Patches mit angehängten Proteine sind sichtbar. Adaptiert von Arnold, Et Al.²⁴ Panel (weitere Berechtigungen im Zusammenhang mit dem Material exzerpiert richten Sie bitte an die ACS). C) Cryo-EM Bild der lysate aus einer einzelnen Zelle HEK-293. Der Inset zeigt eine 2 X Vergrößerung der angegebenen Region, wo typische membranstrukturen mit assoziierten Proteinen sichtbar sind. Feld C adaptiert von Arnold, Et Al. ²⁶ Maßstabsleisten: B, 50 nm; C, 80 nm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Discussion

Das Instrument "CryoWriter" und die Protokolle erforderlich zur Vorbereitung Probe Netze für NS und Cryo-EM aus nL Größe insgesamt Probenvolumen und vollständig zu vermeiden den klassischen Papier-Blot-Schritt werden vorgestellt. Mikrofluidische Prinzipien und einem mikromechanischen System werden in der CryoWriter zu diesem Zweck kombiniert.

Unsere Erfahrung zeigt, dass wenn die miniaturisierten in diesem Manuskript vorgestellten Methoden verwendet werden, Parameterraum für EM-Grid Vorbereitung größer als bei klassischen Methoden und unter enger Kontrolle des Benutzers. Wichtig ist, macht die erhöhte Reproduzierbarkeit erreicht es möglich, vor dem Bildschirm mit Probe-Puffersystem, ergänzt mit einem leicht verfügbaren Test Protein, um die optimalen Parameter zu bestimmen, bevor das eigentliche Experiment durchgeführt wird. Dies hält Verzehr die Stichprobe von Interesse auf ein absolutes minimum und ist sehr zu empfehlen. Wichtige Schritte für beide NS und Cryo-EM Raster Vorbereitung sind: (i) grundieren des Pumpsystems; für Sub-Nanoliter Volumen Dosieren, muss System-Flüssigkeit (Wasser) entgast und bubble-kostenlos. (Ii) genaue Steuerung der Glimmentladung oder Plasma Reinigung Schritt; die Oberflächeneigenschaften des Rasters EM sind entscheidend für reproduzierbare Ergebnisse. (Iii) Probe Klimaanlage; der Zeitaufwand für die Konditionierung, z. B.mit NS, hängt von der Puffertyp, Salzgehalt und Konzentration (Abbildung 3) sowie auf die Düsengeometrie der Microcapillary²⁴. (iv) Verdampfungsraten für NS-EM-Vorbereitungen auf eine quantitative EM; die Wirkung von Kaffee-Ring kann verbieten, die Quantitative Analyse der NS-EM-Vorbereitungen und muss unterdrückt werden, indem langsam Verdunstungsraten gesteuert durch die DP-Bühne.

Verschiedene Aspekte der vorgestellten Raster Vorbereitung Methoden sind frei kombinierbar, so dass die Entwicklung der vielseitigen Protokolle für bestimmte Proben. Typische Beispiele wären die Entfernung eines Stoffes, die hochauflösende EM, z.B., Glycerin, durch eine Klimaanlage Schritt vor dem Gitter Vorbereitung für Cryo-EM verhindert; die Einführung der Mediator Moleküle, wie Liganden durch Konditionierung vor die Gittern bereit sind; oder die Untersuchung der einzelnen Zelle lysate von NS oder Cryo-EM (Abbildung 6).

Die Verwendung von Mikrofluidik und minimales Beispiel Beträge in den vorgestellten Methoden wird Papier Löschpapier Schritte vollständig entfernt. Dies ist ein großer Vorteil weil Papier Löschpapier eine harte Behandlung für Proteine ist, potenziell Kontamination der Probe mit unerwünschten Ionen und von Natur aus führt zu massiven Probenverlust. Auf der anderen Seite werden Effekte möglicherweise verursacht durch die Luft-Wasser-Grenzfläche die dünne Probe Film gebildet, wenn Cryo-EM-Proben in klassischer Weise zubereitet werden nicht vermieden, wenn die CryoWriter verwendet wird. Gitter für Cryo-EM können mit einer weniger als 0,2 s Wartezeit zwischen Beispielanwendung und Verglasung (Daten nicht gezeigt) vorbereitet werden. Jedoch wie Proteine durch Diffusion ein paar Zehntel Nanometer in wenigen Nanosekunden Reisen, gibt es immer noch genug Zeit für sie mit der Luft-Wasser-Grenzfläche von 100 nm dicken Probe Film mehrmals zu kollidieren. Jedoch die Menge an Proteinen, die das Festhalten an der Luft-Wasser-Grenzfläche durch diese kurze Zeitlücken deutlich gesenkt werden könnte und möglicherweise verhindern, dass Protein-Denaturierung oder partikelausrichtung eingeschränkt. Ein weiterer vielversprechender Ansatz, der sensible Proteine aus der Luft-Wasser-Grenzfläche schützen könnte soll die Probe Film von niedermolekularen oberflächenaktive Stoffe abdecken. Diese Verbindungen konnten schnell durch eine Klimaanlage-Stufe in der CryoWriter vor dem Gitter Vorbereitung eingeführt werden. Die hohe Oberflächen-Volumen-Verhältnis von mikrofluidischen Systemen ist eine weitere Einschränkung der CryoWriter als Probe kann möglicherweise verloren gehen durch unspezifische Adsorption an die Microcapillary Oberfläche und Quantitative Analyse von Partikelzählung zu stören. Das Problem richtet sich auf zwei Arten: Erstens die Probe nicht reisen große Entfernungen innerhalb der Microcapillary. In der Tat bleibt das Probenvolumen Nanoliter an der Kapillare Spitze in der Verarbeitung. Zweitens die Oberfläche zum Volumen-Verhältnis ist weiter reduziert, indem mikrokapillaren mit relativ großen inneren Durchmesser, z.B., 180 µm. Dritter, die Oberflächen der mikrokapillaren können leicht passiviert werden, falls erforderlich, z. B., indem Sie sie behandeln mit handelsüblichen Polylysin Ethanol Glykole (PLL-PEG).

Die hochauflösende Analyse von Proteinen durch die EM Einzelkorn-Ansatz erfordert nur 100.000 bis einige Millionen Bilder der einzelnen eiweißteilchen. Dies bedeutet, dass mikrofluidischen Techniken genug Protein-komplexe für die strukturelle Untersuchung bereitstellen können. Eine miniaturisierte Immuno-Niederschlag-Methode für die schnelle Lokalisierung der Proteinkomplexe (ca. 1 Stunde) von minimalen Zelle Mengen (ca. 40.000 Zellen) wurde früher²⁸entwickelt. Diese Methode wird jetzt direkt mit der miniaturisierten Probe Vorbereitungsphase von der CryoWriter verknüpft werden. Das Endziel ist eine integrierte mikrofluidische Pipeline für ultraschnelle Protein isoliert und Cryo-EM Raster Vorbereitung zu entwickeln, die weniger als zwei Stunden in allen erfordert. Darüber hinaus beweist Abbildung 6, die winzige Menge und das Volumen des Materials für die Probenvorbereitung und die fast verlustfreie Klimaanlage und Raster Vorbereitung Verfahren mit Hilfe der CryoWriter benötigt machen Sie es möglich, das Protein zu studieren komplexe einzelner Zellen. Zusammen, bilden die miniaturisierte Immuno-Niederschlag-Methode und die CryoWriter die Grundlage für eine neue Proteomik-Methode namens "Einzelzelle visuelle Proteomics", wie wir vor kurzem für Hitzeschock Experimente²⁴gezeigt. Daten-Analyse-Algorithmen ausgerichtet auf die Analyse der "visuellen Proteomics" Bilder werden derzeit getestet.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Liquid Handling
Mikrokapillarspitze	Neues Objektiv	FS360-100-30-N-20	SilicaTips 30 & micro; m Spitzen-ID, 100 µ m ID , pk. 20
		FS360-150-30-N-20	SilicaTips 30 & micro; m Spitzen-ID, 150 µ m ID , pk. 20
Leithülse	Neues Objektiv	CONGAS-1	Leitfähiges Elastomer für HV-Kontakt, 12" lang
Quarzglasschlauch	BGB-Analytik	TSP-150375	TSP Standard FS Schlauch, 150 & micro; m ID, 363 & Mikro; m AD, 5 Meter
PressFit Steckverbinder	BGB-Analytik	2525LD	Deact. PressFit-Verbinder 0,25 bis 0,25 mm ID, Stück 25
Spritze 10 & Mikro; l	BGB-Analytik	HA-80001	Hamilton 1701 LT - Luer-Spitze (Nadel nicht im Lieferumfang enthalten)
Spritzenpumpenregler	Cetoni	A3921000093	neMESYS Regler
Spritzenpumpen-Dosiereinheit	Cetoni	A3921000095	neMESYS Dosiereinheit
Temperaturregelung
Taupunktsensor	Meltec	UFT75-AT	Feuchte-/Temperatursensor, Taupunktberechnung, USB und embedded DLL
Temperatur Sensor	Sensorshop24.ch	LS7-PT1000-1.0-3L	Oberflächenmontierbarer Temperatursensor Pt1000
Peltier-Regler	Cooltronic	TC2812	PID-Temperaturregler zur Ansteuerung von Peltier-getriebenen Systemen mit konstantem Spannungsausgang
Peltier-Element	Distrelec.ch	PE-127-14-15-S	40x40 mm
Wasserkühlungsblock		-	Wasserkühlblock für 40x40 mm Peltier-Element, Kupferbasis
Wasserpumpe	Digitec.ch	294877	XSPC X20 750 Dual 5,25 Bay Reservoirpumpe Schwarz V4
Wasserwärmetauscherblock		-	Wasserwärmetauscherblock mit 2 Lüftern zum Abkühlen des zirkulierenden Wassers
Kleine Wasserkühler	PCHC.ch	223050	Alphacool MCX RAM Kupfer Edition 2 Stück
Kleine Peltier-Elemente	Distrelec.ch	PE-031-10-15-S	Laird 15x15 mm 3,4 A 8,1 W 3,8 V 74 ° C, 2 Stk
Mechanik
Lineartisch Z-Achse	Dyneos AG	M-404.2PD	Hochlast-Präzisions-Translationstisch, 50 mm Verfahrweg, Gleichstrommotor
Tischregler	Dyneos AG	C-863	Mercury Servo Controller
Mikroskop xy-Achsen-Tisch	Vorherige	wissenschaftliche H117EIL5	Motorisierter Tisch für Zeiss Axiovert 200 Inverses Mikroskop
Kleine Permanentmagnete	Supermagnete	S-05-08-N	Stabmagnet & Oslash; 5 mm, Höhe 8,47 mm, Neodym, N45, vernickelt, pk. 10
Kleiner Elektromagnet	Schramme	EG1025A02/110	Elektromagnet 24V 220 N 150 N 2,5 W
Controller Elektromagnet	Conrad.ch	MST-1630.001 7	Elektromagnet Steuerung Leiterplatte
Magnetnabe	Distrelec.ch	HD8286-R-F-24V100%	Kuhnke Solenid Hub 30 mm 16 N 2 N 16 W
Mini Pinzette	Elektronenmikroskopie Wissenschaften	0302-M5S-PS	Dumont Typ 5 mini, superdünne Spitzen
Diverse optomechanische Teile	Thorlabs	-	-
diverse mechanische Teile	Werkstatt Biozentrum, Universität Basel-Sonderanfertigungen	Adapterplatten, Halterungen, etc. siehe angehängte CAD-Dateien
Optics
Laserdiode	Thorlabs	CPS780S	780 nm Laserdiodenmodul 2,5 mW
Photodetektor	Thorlabs	PDA100A-EC	Si Switchable Gain Detector, 320-1100 nm, 2,4 MHz BW, 100 mm2
EM Grids
DURASIN FILM TEM		emsdiasum.comDTF-03523	30 nm DuraSiN™ Siliziumnitrid-Membranen für TEM, Packung mit 5
Quantifoil Cu 200 mesh R 2/1	Quantifoil Micro Tools GmbH
Quantifoil Cu 200 mesh R 1,2/1,3	Quantifoil Micro Tools GmbH
Buffers / Neg. stain
PBS	Sigma	D8537  SIGMA	Dulbecco' s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung
NanoVan 2%	nanoprobes.com		Negativfärbung auf Vanadiumbasis
NanoW 2%	nanoprobes.com		Negativfärbung Wolframbasis
Software
openBEB			Das openBEB 2 Framework ist auf Anfrage erhältlich, Version 3 kann
heruntergeladen werden CryoWriter Steuerung Software (openBEB-Plugin)		Auf Anfrage erhältlich, für Treibersoftware von Drittanbietern können zusätzliche Gebühren anfallen.