Visualisierung von zellulären elektrische Aktivität im frühen Zebrafish Embryos und Tumoren

Summary

Hier zeigen wir den Prozess der Erstellung einer zellulären elektrische Spannung Reporter Zebrafisch Linie um embryonale Entwicklung, Bewegung, zu visualisieren und Fisch Tumorzellen in Vivo.

Abstract

Bioelektrizität, endogene elektrische Signalisierung von Ionenkanälen vermittelt und Pumpen befindet sich auf der Zellmembran, spielt eine wichtige Rolle bei der Signalisierung Prozesse des erregbare muskulären und neuronalen Zellen und viele andere biologische Prozesse, wie z. B. embryonale Developmental Musterung. Allerdings gibt es eine Notwendigkeit für die in Vivo Überwachung elektrische Aktivität in vertebrate Embryogenese. Die Fortschritte der genetisch codierten fluoreszierende Spannung Indikatoren (GEVIs) machten es möglich, eine Lösung für diese Herausforderung zu bieten. Wir beschreiben hier, wie erstelle ich eine transgene Spannung Indikator Zebrafisch mit den etablierten Spannungsanzeige ASAP1 (beschleunigte Sensor von Aktionspotentialen 1), als Beispiel. Das Tol2-Kit und einem allgegenwärtigen Zebrafisch-Promotor, Ubi, wurden in dieser Studie ausgewählt. Wir erklären auch die Prozesse der Gateway ortsspezifische Klonen, Tol2 Transposon-basierte Zebrafisch Transgenese und den imaging-Prozess für Frühphasen-Fisch Embryonen und Fisch Tumoren mit regelmäßigen Epifluorescent Mikroskope. Mit diesem Fisch-Linie, fanden wir, dass während der Embryogenese Zebrafisch und Fische Larven Bewegung gibt es zelluläre elektrische Spannungsänderungen. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass in ein paar Zebrafisch malignen peripheren Nerven Scheide Tumoren, Tumor, die Zellen in der Regel polarisiert waren im Vergleich zu das umliegende normale Gewebe.

Introduction

Bioelektrizität bezieht sich auf endogene elektrische Signalisierung durch Ionenkanäle und Pumpen befindet sich auf der Zellmembran¹vermittelt. Ionischen Austausch über die Zellmembran und die gekoppelten elektrischen potenziellen und aktuellen Änderungen sind unerlässlich für die Signalisierung Prozesse des erregbare muskulären und neuronalen Zellen. Bioelektrizität und Ion Steigungen haben darüber hinaus eine Vielzahl von anderen wichtigen biologischen Funktionen wie Energiespeicher, Biosynthese und Metabolit Transport. Bioelektrische Signale wurde auch als Regulator des embryonalen Musterbildung wie körperachsen, Zellzyklus und Zelle Differenzierung¹entdeckt. Daher ist es wichtig für das Verständnis der vielen menschlichen Erbkrankheiten, die sich aus der MIS Verordnung dieser Art der Signalisierung. Obwohl Patch-Clamp ist weit verbreitet für die Aufnahme einzelner Zellen, ist es immer noch bei weitem nicht Ideal für die gleichzeitige Überwachung mehrerer Zellen während der Embryonalentwicklung in Vivo. Darüber hinaus sind sensible kleine Moleküle Spannung auch nicht ideal für in-Vivo Anwendungen aufgrund ihrer Besonderheiten, Empfindlichkeiten und Toxizitäten.

Die Schaffung einer Vielzahl von genetisch codiert fluoreszierende Spannung Indikatoren (GEVIs) bietet einen neuen Mechanismus, um dieses Problem zu umgehen, und ermöglicht die einfache Anwendung, Embryonalentwicklung, zu studieren, obwohl sie ursprünglich, für die Überwachung der neuronalen bestimmt waren ^2,3Zellen. Eines der derzeit verfügbaren GEVIs ist die beschleunigte Sensor Aktionspotentiale 1 (ASAP1)⁴. Es besteht aus einer extrazellulären Schleife einer Spannung-sensing Domäne Spannung empfindlich Phosphatase und ein Zirkular permutierte grün fluoreszierendes Protein. Daher erlaubt ASAP1 Visualisierung der elektrische mögliche Zellveränderungen (Polarisation: hellgrün; Depolarisation: dunkelgrün). ASAP1 hat 2 ms ein- und Kinetik und Eingangssignale mögliche Änderung⁴verfolgen können. So ermöglicht dieses genetische Tool für ein neues Maß an Effizienz in bioelektrische Echtzeitüberwachung in lebenden Zellen. Weitere Verständnis der Rollen der Bioelektrizität in der embryonalen Entwicklung und vielen menschlichen Krankheiten wie Krebs, wird werfen ein neues Licht auf die zugrunde liegenden Mechanismen, die für Behandlung und Prävention von entscheidender Bedeutung ist.

Zebrafisch nachweislich eine leistungsstarke Tiermodell, Entwicklungsbiologie und menschliche Krankheiten einschließlich Krebs^5,6zu studieren. Sie 70 % ortholog Gene mit Menschen teilen, und sie haben ähnliche vertebrate Biologie⁷. Zebrafisch bieten relativ pflegeleicht, eine große Kupplung Größe von Eiern, gefügig Genetik, leicht Transgenese und transparente externe embryonale Entwicklung, wodurch sie ein überlegenes System für in-Vivo imaging^5,6. Eine bedeutende Quelle von mutant Fisch Linien bereits vorhanden und ein vollständig sequenzierte Genom wird Zebrafisch relativ unbegrenzt vielfältige wissenschaftliche Entdeckungen bieten.

Um die in Vivo in Echtzeit elektrische Aktivität von Zellen zu untersuchen, nutzen wir die Zebrafisch Modellsystem und ASAP1. In diesem Papier wir beschreiben, wie das Zebrafish Genom Tol2 Transposon Transgenese mit fluoreszierenden Spannung Biosensor ASAP1 einzubauen, und elektrische Zellaktivität zu visualisieren, während der Embryonalentwicklung, Fische Larven Bewegung, und im live tumor .

Protocol

Der Zebrabärbling in eine AAALAC genehmigt Tierstation untergebracht sind, und alle Versuche erfolgten nach den Protokollen von Purdue Animal Care und Nutzung Committee (PACUC) genehmigt.

1. Tol2 Transposon Plasmid Konstrukt Vorbereitung

Hinweis: Tol2, ein Transposon, das Medaka Fisch entdeckt wurde hat in der Zebrafisch Forschung Gemeinschaft^8,9verbreitet wurde. Es wurde erfolgreich an das Gateway ortsspezifische Rekombination basierende Klonen System angenommen und als Tol2 Kit¹⁰bekannt. Das Tol2-Kit ermöglicht eine sehr komfortable Möglichkeit individuelle Ausdruck Konstrukte, während auch die Effizienz der Transgenese zu schaffen. So war es eine leichte Entscheidung, nutzen die Vorteile dieses Systems, und eine allgegenwärtige ASAP1 Ausdruck Zebrafisch Linie mit einem validierten Ubiquitin Promotor ASAP1¹¹fahren.

1. Erstellen einer mittleren Eintrag ASAP1 Konstrukt: pDONR221-ASAP1
   1. Das genetisch codierte Spannung Sensor ASAP1 Konstrukt, pcDNA3.1/Puro-CAG-ASAP1 (Plasmid #52519), von Addgene zu erwerben. Um die ASAP1 kodierenden Region zu verstärken, richten Sie eine PCR unter Verwendung der benutzerdefinierten Zündkapseln (attB1-ASAP1F und attB2-ASAP1R) flankiert mit AttB Sequenzen am 5'-Ende der Primer (Abbildung 1). Phusion-DNA-Polymerase wählte für seine hohe Effizienz und PCR-Zustände wurden basierend auf den zuvor veröffentlichten Protokoll¹²optimiert.
   2. Laden Sie die 50 µL-PCR-Produkte in eine 1 % TAE gel mit einer regelmäßigen Pipette mit 200 µL Spitzen und führen Sie Elektrophorese bei 160 V in einem horizontalen Gel Tank für ca. 30 min.
   3. Überprüfen Sie das Gel unter einem UV-Transilluminator (353 nm), Verbrauchsteuern, das gewünschte Band mit einem Messer/Skalpell unter einem UV-Transilluminator als bisher erschienen^13,14, und setzen die DNA mit Gel-Probe in eine saubere 1,5 mL Microcentrifuge Rohr.
   4. Durchführen Sie Gel-Reinigung für die ASAP1 PCR-Produkte. Erholen Sie die DNA in den ausgeschnittenen Gel mit einem kommerziellen DNA-Gel Reinigung Kit nach Anweisungen des Herstellers zu, und eluieren Sie die DNA in 20 µL Wasser. 1 µL als Beispiel zu nehmen, und die DNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer messen. Fließen Sie die Anweisungen der Software, die mit Wasser als ein leeres Steuerelement¹⁵.
   5. Nehmen Sie 100 ng des PCR-Produktes gereinigt und mischen Sie es mit 150 ng pDONR221 Plasmid in 10 µL TE-Puffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA pH 8.0)¹⁶. Fügen Sie 2 µL BP Clonase II in die Reaktion und inkubieren Sie die Reaktion bei Raumtemperatur über Nacht.
   6. Am zweiten Tag fügen Sie 1 µL Proteinase K in die Reaktion und inkubieren Sie die Reaktion bei 37 ° C für 30 min.
   7. Führen Sie die Transformation. Übertragen Sie die Reaktion und mischen Sie es mit 50 µL der Top10 kompetente E. Coli Zellen und inkubieren Sie die Zellen für 30 min auf Eis. Dann Transfer das Reaktionsgefäß in ein Wasserbad 42 ° C für 1 min. sofort entfernen Sie den Schlauch und inkubieren Sie für 2 min auf Eis. Als nächstes legen Sie den Schlauch in einen Shaker 37 ° C und 1 h inkubieren.
   8. Das Rohr herausnehmen und die Zellen auf eine Kanamycin LB-Platte-Platte. Als nächstes inkubieren Sie die Platte über Nacht (16-18 h) bei 37 ° c
   9. Wählen Sie einzelne und gut getrennte Kolonien und in 14 mL Zelle Kultur Röhren mit 3 mL LB-Medium zu impfen. Kultur sie über Nacht bei 37 ° C in einem Shaker mit einer Drehzahl von 250 u/min (Umdrehung pro Minute).
   10. Führen Sie Miniprep mit einem kommerziellen Miniprep Kit nach seiner Anweisung manuelle¹⁷.
   11. Sequenz 3-4-Plasmide mit Sanger-Sequenzierung positiven pDONR221-ASAP1 identifizieren Klone mit M13F und M13R-Sequenzierung-Primern.
2. Erstellen der Tol2 Konstrukt für die Mikroinjektion: pDestTol2 -Ubi-ASAP1
   1. Wählen Sie die Sequenzierung pDONR221 ASAP1 Klon und Maßnahme überprüft seine DNA-Konzentration mit einem Spektrophotometer folgenden der Software Anweisung mit Wasser, wie eine leere Steuern¹⁵.
   2. Nehmen Sie 100 µg pDONR221-ASAP1 und mischen Sie es mit 100 µg Tol2 Kit 5-End Plasmids (pENTR5'_ubi, Addgene #27320), 100 µg p3E-PolyA (Tol2 Kit #302) und 150 µg des pDestTol2pA2 (Tol2 Kit #394). Insgesamt Lautstärke zu 8 µL TE-Puffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) in einer 1,5 mL Microcentrifuge Rohr und mischen Sie gut durch einen 2-5 s kurze Wirbel. Dann fügen Sie 2 µL des LR Clonase II plus und inkubieren Sie die Reaktion bei Raumtemperatur über Nacht.
   3. Am zweiten Tag 1 µL Proteinase K in die Reaktion mit einer 10 µL Pipette einfügen und die Reaktion bei 37 ° C für 30 min inkubieren.
   4. Führen Sie Transformation und identifizieren Sie positive Klone zu, wie oben (Schritte 1.1.7-11) beschrieben.
   5. Maßnahme die DNA-Konzentration der Sequenzierung überprüft pDestTol2 Ubi ASAP1 Klon (Abbildung 1 b) mit einem Spektrophotometer¹⁵. In der Regel ist die Konzentration um 200ng/µL.

2. bereiten Sie Tol2 Transposase mRNA und Injektionslösung

1. Streak E. Coli Glycerin Bestand an pCS2FA-Transposase Plasmid (Tol2 Kit #396) auf eine LB-Platte (mit 100 µg/mL Ampicillin) mit einer sterilisierten Impfschlinge. Über Nacht inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C in einem Inkubator. Am nächsten Tag, wählen Sie eine einzelne Kolonie und impfen Sie es in 3 mL LB (100 µg/mL Ampicillin) mit einer sterilisierten 10 µL PIPETTENSPITZE zu. Kultur es über Nacht bei 37 ° C in einem Shaker mit einer Drehzahl von 250 u/min.
2. Führen Sie Miniprep auf die E. Coli -Kultur mit einem kommerziellen Miniprep Kit die Beachtung der Bedienungsanleitung. Eluieren Sie Plasmid-DNA in 30-50 µL TE-Puffer von 1 Minute Zentrifuge bei 14.000 u/min und Messen Sie seine DNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer.
3. Linearisieren 1-2 µg Plasmids mit nicht ich Endonuklease und Reinigen der DNA mit einer Reinigungs-Kit nicht ich die Bedienungsanleitung nach DNA Verdauung. Eluieren Sie die DNA in 5 µL Wasser durch Zentrifugieren bei 14.000 u/min für 1 Minute. Die erwartete Konzentration beträgt über 200-300 ng/µL.
4. Führen Sie in Vitro Transkription mit nicht linearisiert ich pCS2FA-Transposase als DNA-Vorlage mit einem kommerziellen SP6 Transcription Kit.
5. Wenn die Reaktion beendet ist, reinigen Sie Tol2 Transposase mRNA mit Hilfe einer Gebäudereinigung RNA kit nach den Anweisungen des Herstellers. Zu guter Letzt eluieren Sie mRNA in 20 µL RNAase-freies Wasser und Messen Sie die RNA-Konzentration in einem Spektralphotometer. Die erwartete Konzentration geht es um 1-3 µg / µL. Proben können in einem-80 ° C Gefrierschrank gelagert werden, wenn nötig.
6. Bereiten Sie die Mikroinjektion Lösung durch Mischen von 20 ng/µL pDestTol2 -Ubi-ASAP1 und Tol2 Transposase mRNA (100 ng/µL) in einem Microcentrifuge Schlauch durch pipettieren. Zur Verhinderung von Nukleinsäure-Beeinträchtigung durch wiederholtes Auftauen und Auftauens, aliquoten 6 µL pro Röhre und in einem-80 ° C Gefrierschrank für eine spätere Verwendung zu speichern.

3. die Mikroinjektion

1. Richten Sie 4-6 Zucht Becken mit mindestens 2 Rüden und 2 Hündinnen am Nachmittag vor der Injektion. Diese Fische müssen nicht am Nachmittag gefüttert werden. Dieser Schritt wird reduzieren die Menge der Fischabfälle und sparen Sie Zeit, um sie am nächsten Morgen, während gleichzeitig eine Zucht Reaktion veranlassen zu reinigen.
2. Am nächsten Morgen, entfernen Sie die vorbereiteten Injektionslösung (pDestTol2 -Ubi-ASAP1 Konstrukt und Tol2 mRNA) aus der Tiefkühltruhe-80 ° C und auf Eis legen.
3. Ziehen Sie den Teiler in der Fischzucht Panzer und lassen Sie den Fisch zu Paaren. Im Allgemeinen legen Fische Eiern innerhalb von 20-30 Minuten nach dem Herausziehen des Teilers. Wenn nicht, warten Sie 1-2 Stunden länger. Einige Fische können überhaupt keine Eiablage. In diesem Fall wiederholen Sie dieses Experiment für Embryo Fischsammlung.
4. Während der Wartezeit stellen Sie sicher, dass Nadeln mit der Spitze in einem Winkel eine abgeschrägte Kante zu schaffen, mit der Pinzette oder durch brechen auf eine heikle Aufgabe Scheibenwischer gebrochen vorbereitet.
   1. Ziehen Sie Nadeln aus Kapillaren Glas auf einer Mikropipette Abzieher mit den folgenden Parametern: Erhitzen 545; 60 zu ziehen; Geschwindigkeit 80; Zeit 250; Druck 500. Die Nadel mit der Pinzette unter einer Dissektion Umfang (mit Okular Lineal für Durchmesser Schätzung) zu brechen, hält die Zange in einem Winkel von ca. 45 °. Gewünschte Nadel Durchmesser können variabel je nach den Microinjector-Einstellungen sein, aber kleinere Durchmesser wird bevorzugt für die Verringerung des Embryos Sterblichkeit.
5. Sobald der Fisch Eiablage haben, sammeln sie in einem Durchmesser von 10 cm Petrischale und bringen sie auf den Bereich der Dissektion. Entfernen Sie alle abnorme Embryonen und Fischen Sie Abfall zu.
6. Pipettieren Schimmel die befruchteten Embryonen in die vorbereitete 3 % Agarose-Injektion. Entfernen Sie überschüssiges Wasser um die Embryonen im Ort zu halten.
7. Sobald alle Zeilen mit Embryonen gefüllt sind, ordnen Sie sie so, dass die einzelnen Zellen, die alle die gleiche Richtung der Nadel Gesicht die etwa einen Winkel von 45° horizontal. Dies wird Injektion später viel leichter machen.
8. Mit Handschuhen, verwenden Sie eine 20 µL laden pipettieren kippen und 5 µL des vorbereiteten Konstrukts aus der Tube auf dem Eis zu entfernen.
9. Legen Sie die Spitze in das hintere Ende des gebrochenen kapillarröhrchens bis hin zu, Tapper beginnt, das Reagenz möglichst nahe an die Spitze zu erhalten. Wenn es noch Luftblasen immer, schütteln Sie die Nadel, und achten Sie auf die Spitze nicht zu brechen.
10. Stechen Sie die Nadel direkt in die Mikroinjektion Nadelhalter und ziehen Sie sorgfältig an, bis die Nadel an seinem Platz bleibt. Stellen Sie den Winkel auf ca. 45°.
11. Sobald die Nadel vorbereitet und angeschlossen ist, schalten Sie das Mikroskop und Gas-Druck-Tank. Kommerzielle CO₂ Tanks sind im Allgemeinen gut für diesen Zweck. Die Einspritzmenge wird durch die Holding und Auswurf Druck eingestellt: ca. 0,5 Psi gewartet und 30 Psi für Auswurf. Achten Sie darauf, zu prüfen, ob die Lösung kommt heraus, wenn das Pedal zu drücken.
12. Passen Sie mithilfe einer Bühne Mikrometer mit einem Tropfen Mineralöl, das Volumen und die Lösung für ~ 150 µm im Durchmesser (ca. 2 nL). Stellen Sie sicher, dass der Gegendruck wird eine kleine Menge der Nadel heraus Tropfen lassen. Wenn nicht genug Gegendruck vorhanden ist, bewirkt Kapillarwirkung Flüssigkeit, geben die Nadel und die mRNA zerstören.
13. Sobald die Nadel kalibriert wird, beginnen Sie Injektion das Konstrukt in die einzelne Zelle der befruchteten Embryonen.
    Hinweis: Dies dauert viel Übung, Geduld und Finesse durch die Zellmembran, die schwer zu durchdringen. Es ist wichtig, die Lösung in der Zelle, nicht das Eigelb zur Erzeugung transgener Zebrafisch zu injizieren. Dies unterscheidet sich von Morpholino-Injektion. Es spielt keine Rolle, welche Seite die Nadel betritt die Zelle so lange, wie das Konstrukt in der Zelle geht. Die Transgenese haben eine sehr niedrige Rate des Erfolges, wenn das Eigelb statt der Zelle injiziert. Einzel-Zell-Stadium Injektion ist auch wichtig, oder somatischen Chimäre Fisch erstellt werden. Dies verringert die Chance des Transgens werde in den Keimzellen.
14. Benutzen Sie den Rand der Gel-Kerbe, einen Rückhalt bieten, der hält den Embryo vorhanden und ermöglicht die Nadel, Druck auszuüben, ohne sich zu bewegen den Embryo. Sobald die Spitze der Nadel in die einzelne Zelle ist, drücken Sie das Pedal, um die gewünschte Menge an Lösung zu veröffentlichen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle der Embryonen.
15. Wenn abgeschlossen, übertragen Sie die injizierten Embryonen in eine beschriftete Schale durch Spülen sie aus Agarose Kerbe mit System Fischwasser und ein Einweg-3,4 mL transferpipette. Speichern Sie die Embryonen in einem 28,5 ° C Inkubator zu entwickeln lassen. Überprüfen Sie zurück im Laufe des Tages entfernen Tote Fischembryonen und ersetzen Sie Wasser mit 0,1 % Methylenblau in Fischwasser zu.
16. Ca. 6-8 Stunden nach der Injektion nehmen 10 einzelnen injiziert Embryonen zu Fischen und bereiten genomischen DNA daraus mit Hilfe der Hotshot Methode¹⁸.
17. Verwenden Sie am nächsten Morgen Dissektion Mikroskop mit einer Fluoreszenz-Lichtquelle um zu sortieren, die Embryonen mit GFP in den Geweben nicht Eigelb. Diese Fischembryonen sollte das eingespritzte Konstrukt enthalten.
18. Führen Sie Tol2 Verbrauchsteuern Assay Transposon-Aktivität wie bisher¹⁹beschrieben überprüfen. Wenn ausgeschnittenen Plasmid erkannt werden kann, halten die injizierten Embryonen zu Fischen und heben Sie sie. Wenn keine ausgeschnittenen Plasmid erkannt werden kann, wiederholen Sie den Tol2 mRNA-Synthese und Mikroinjektion bis die positiven Resultate des Tol2 Verbrauchsteuern Assays.

4. Stellen Sie transgene ASAP1 Fisch, Tg (Ubi: ASAP1)

1. Heben Sie die injizierten Fische (F-₀ -Generation) bis zum Erwachsenenalter, bereits in der Zebrafisch-Buch-²⁰beschrieben. Dies dauert in der Regel ca. 4 Monate.
2. Nehmen Sie eine einzelne Erwachsene F₀ Fisch und überqueren sie mit einem einzigen gegenüber Geschlecht Wildtyp Fisch. Sammle Fischembryonen nach Zucht im Laufe des Tages. Halten Sie die gesammelten Fischembryonen im 28,5 ° C Inkubator in Fisch mit 0,1 % Methylenblau Wasser.
3. Am dritten Tag überprüfen Sie Fischembryonen unter einem Mikroskop fluoreszierende Dissektion mit einem GLP-Filter. Grüne Fischembryonen zu klären, wenn es welche gibt, und heben Sie sie bis zum Erwachsenenalter als F₁ Generation transgene Fische, Tg (Ubi: ASAP1).
   Hinweis: Mendelian Verhältnis wird nicht erwartet, da die meisten der elterlichen F₀ Fische Keimbahn genetischer Chimären sind.
4. Überqueren Sie einzelne F₁ geschlechtsreifer Fische mit Wildtyp-Fisch und sammle Fischembryonen. Sortieren Sie grüne Fischembryonen und heben Sie sie zum Erwachsensein als F₂ Generation Fisch.
   Hinweis: Grün und nicht-grüne Fischembryonen sollte in der Nähe von 1:1, wenn gibt es einen einzigen Transgen.
5. Um elektrische mögliche Veränderungen im Tumor wie malignen peripheren Nerven Scheide Tumoren (MPNST) anzuzeigen, überqueren Sie die F-₂ -Generation Tg (Ubi: ASAP1) Fisch mit rpl35^hi258/wt Fisch. Es ist bekannt, dass die sichtbare Tumoren beginnen in 6-8 Monate alte Erwachsene^21,22zu finden.

(5) Bildgebung

1. Bild von Zebrafisch-Embryonen, nehmen mehrere F₂ Generation Gründer Fisch und mit Wildtyp-Fisch in einzelnen Paaren zu überqueren. Sammle Fischembryonen in unterschiedlichen gewünschte Entwicklungsstadien nach dem Zebrafisch Inszenierung Reiseführer²³.
2. Für die frühen Stadien von Fischembryonen schälen und Chorions der Embryonen mit einer Zange vorsichtig eine Dissektion Rahmen in einem Durchmesser von 10 cm Petrischale mit Fischwasser System zu entfernen.
3. Ein paar Fischembryonen in eine konkave Glas-Folie mit 3 % Methylcellulose mit einer Pipette 3,4 mL Einweg-Transfer zu übertragen. Passen Sie die Embryonen an die gewünschten Positionen, die Zellaktivität der GFP mit einer Nadel unter einem fluoreszierenden Dissektion Bereich anzuzeigen.
4. Verwenden Sie für den beweglichen Phasen Fischembryonen (älter als 12 Somiten Bühne) 0,05 % Tricaine Mesylate, um den Fischembryonen zu betäuben, bevor Sie sie auf Folien übertragen. Kurz, waren Fischembryonen in 0,05 % Tricaine Mesylate in Fischwasser entstanden, bis sie schwimmen und Verlust Körperbalance gestoppt. Auch, Tropfen Sie einen 0,05 % Tricaine-Mesylat mit der Methylcellulose auf der Folie.
5. Verwenden Sie für weniger als 12 Somiten Bühne Fischembryonen ein Epi-Fluoreszenzmikroskop in Verbindung mit einem kompatiblen Kamera und Software für die Bildgebung. Verwenden Sie für älter als 12 Somiten Bühne Fischembryonen ein Fluoreszenzmikroskop Dissektion.
6. Zu Bild Tumor Zellspannung, zuerst die Fische mit MPNST Tumoren zu identifizieren. Dann den Fisch mit 0,05 % Tricaine Mesylate zu betäuben. Für ganze Mount legen Bildgebung, Sie den Fisch in einem Durchmesser von 10 cm Petrischale. Um den Tumor Zelle elektrische Aktivität anzuzeigen, können Fische Tumoren, nach dem ganzen Berg Imaging seziert.

Results

In einer erfolgreichen Injektion, mehr als 50 % injiziert Fischembryonen zeigt ein gewisses Maß an grünen Fluoreszenz in den somatischen Zellen, und die meisten von ihnen werden positiv von Tol2 Transposon Verbrauchsteuern Assay (Abbildung 2). Nach 2-4 Generationen von Out-Kreuz mit Wildtyp-Fisch (bis der fluoreszierenden Fisch 50 %, die erwarteten Mendelian Verhältnis erreichen), wurden die transgene Fische für das imaging Experiment zur Zellmembran Potentia...

Discussion

Obwohl die Mobilfunk- und Gewebe elektrische Aktivitäten während der embryonalen Entwicklung und Krankheit beim Menschen vor langer Zeit entdeckt wurden, bleiben die in Vivo dynamische elektrische Veränderungen und deren biologische Rollen noch weitgehend unbekannt. Eine der großen Herausforderungen ist zu visualisieren und zu quantifizieren, die elektrischen Veränderungen. Patch-Clamp-Technologie ist ein Durchbruch für die Verfolgung von Einzelzellen, aber seine Anwendung auf vertebrate Embryonen ist begrenzt, ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
14 ml Zellkulturröhrchen	VWR	60818-725	E.Coli-Kultur
Agarose-Elektrophoresetank	Thermo Scientific	Owl B2	DNA-Eletrophorese
Agarose RA	Amresco	N605-500G	Zur Herstellung der Injektionsgele
Attb1-ASAP1-F Primer	IDT DNA	GGGGACAAGTTTGTACAAAAAA GCAGGCTTCACCATGGAGACGA CTGTGAGGTATGAACA	Amplifikation der ASAP1-kodierenden Region für die Subklonierung
Attb2-ASAP1-R Primer	IDT DNA	GGGGACCACTTTGTACAAGAAA GCTGGGTCTTAGGTTACCACTTC AAGTTGTTTCTTCTGTGAAGCCA	ASAP1 kodierende Region-Amplifikation für die Subklonierung
Hellfeld-Dissektions-Scope	Nikon	SMZ 745	Dechorionierung, Mikroinjektion, Montage
Farbkamera	Zeiss	AxioCam MRc	Fischembryo Bildaufzeichnung
Konkaver Objektträger	VWR	48336-001	Zum Halten von Fischembryonen während des Bildgebungsprozesses
Einweg-Transferpipette 3,4 ml	Thermo Scientific	13-711-9AM	Fischembryonen und Wassertransfer
Endonuklease-Enzym, nicht NEB		R0189L	Zur Linearisierung von Plasmid-DNA
Epifuoreszierendes Verbindungsendoskop	Zeiss	Axio Imager.A2	Fisch Embryo-Bildgebung
Epifuoreszente Stereo-Dissektions-Scope	Zeiss	Stereo Discovery.V12	Embryo-Bildgebung von Fischen
Fluoreszenzlichtquelle	Lumendynamik	X-cite seris 120	Lichtquelle für Fluoreszenzmikroskope
Pinzette #5	WPI	500342	Dechorionation und Nadelbruch
Gateway BP Clonase II Enzymmischung	Thermo Scientific	11789020	Gateway BP Rekombinationsklonierung
Gateway LR Clonase II Plus Enzym	Thermo Scientific	12538120	Gateway LR Rekombinationsklonierung
Gel DNA Recovery Kit	Zymo Research	D4002	DNA-Gel-Aufreinigung
Ladespitze	Eppendorf	930001007	Zum Laden von Injektionslösung in Capilärnadeln
Methylcellulose (1600cPs)	Alfa Aesar	43146	Fischembryo-Montage
Methylenblau	Sigma-Aldrich	M9140	Unterdrückt Pilzausbrüche in Petrischalen
Mikrospritzgussform	Adaptive Science Tools	TU-1	Zur Vorbereitung der Agaorse-Formschale für die Aufbewahrung von Fischembryonen während der Injektion
Mikroinjektor	WPI	Pneumatische Picopump PV820	Mikroinjektionsinjektor
Mikromanipulator	WPI	Mikroinjektor MM3301R	Mikroinjektionsbetrieb
Mikropipettenabzieher	Sutter Instrument	P-1000	Zur Vorbereitung der Kapillarnadel
Mineralöl	Amresco	J217-500ml	Zur Kalibrierung des Injektionsvolumens
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transkriptionskit	Thermo Scientific	AM1340	mRNA in vitro Transkription
Monocolor Kamera	Zeiss	AxioCam MRm	Bildaufzeichnung von Fischembryonen
Plasmid Miniprep Kit	Zymo Research	D4020	Bereiten Sie eine kleine Menge Plasmid-DNA
Petrischalen aus Kunststoff	VWR	25384-088	Zum Halten von Fischen oder Fischembryonen während des Bildgebungsprozesses
RNA Clean & Concentrator-5	Zymo Research	R1015	mRNA-Reinigung nach der In-vitro-Transkription
Spektrophotometer	Thermo Scientific	NanoDrop 2000	Zur Messung von DNA- und RNA-Konzentrationen
Tischmikrometer	Am Scope	MR100	Mikroinjektionsvolumenkalibrierung
Thermocycler	Bio-Rad	T100	DNA-Amplifikation für die Genklonierung
Dünnwandig Glaskapillaren	WPI	TW100F-4	Rohglas zur Herstellung von Kappilarnadeln
Tol2-exL1 Primer	IDT DNA	GCAACACCAGAAATGCCCTC	Tol2 Excise
Assay Tol2-exR Primer	IDT DNA	ACCCTCACTAAAGGGAACAAAAG	Tol2 Excise Assay
TOP10 Chemisch kompetente E. coli	Thermo Scientific	C404006	Wird für die Transformation während der Genklonierung verwendet
Tricainmesylat	Sigma-Aldrich	A5040	Zur Betäubung von Fischen oder Fischembryonen
UV-Transilluminator 302nm	UVP	M-20V	DNA-Visualisierung
	Wasserbad Thermo Scientific	2853	Für den Transformationsprozess der Genklonierung