Visualisierung von zellulären elektrische Aktivität im frühen Zebrafish Embryos und Tumoren

Summary

Hier zeigen wir den Prozess der Erstellung einer zellulären elektrische Spannung Reporter Zebrafisch Linie um embryonale Entwicklung, Bewegung, zu visualisieren und Fisch Tumorzellen in Vivo.

Abstract

Bioelektrizität, endogene elektrische Signalisierung von Ionenkanälen vermittelt und Pumpen befindet sich auf der Zellmembran, spielt eine wichtige Rolle bei der Signalisierung Prozesse des erregbare muskulären und neuronalen Zellen und viele andere biologische Prozesse, wie z. B. embryonale Developmental Musterung. Allerdings gibt es eine Notwendigkeit für die in Vivo Überwachung elektrische Aktivität in vertebrate Embryogenese. Die Fortschritte der genetisch codierten fluoreszierende Spannung Indikatoren (GEVIs) machten es möglich, eine Lösung für diese Herausforderung zu bieten. Wir beschreiben hier, wie erstelle ich eine transgene Spannung Indikator Zebrafisch mit den etablierten Spannungsanzeige ASAP1 (beschleunigte Sensor von Aktionspotentialen 1), als Beispiel. Das Tol2-Kit und einem allgegenwärtigen Zebrafisch-Promotor, Ubi, wurden in dieser Studie ausgewählt. Wir erklären auch die Prozesse der Gateway ortsspezifische Klonen, Tol2 Transposon-basierte Zebrafisch Transgenese und den imaging-Prozess für Frühphasen-Fisch Embryonen und Fisch Tumoren mit regelmäßigen Epifluorescent Mikroskope. Mit diesem Fisch-Linie, fanden wir, dass während der Embryogenese Zebrafisch und Fische Larven Bewegung gibt es zelluläre elektrische Spannungsänderungen. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass in ein paar Zebrafisch malignen peripheren Nerven Scheide Tumoren, Tumor, die Zellen in der Regel polarisiert waren im Vergleich zu das umliegende normale Gewebe.

Introduction

Bioelektrizität bezieht sich auf endogene elektrische Signalisierung durch Ionenkanäle und Pumpen befindet sich auf der Zellmembran¹vermittelt. Ionischen Austausch über die Zellmembran und die gekoppelten elektrischen potenziellen und aktuellen Änderungen sind unerlässlich für die Signalisierung Prozesse des erregbare muskulären und neuronalen Zellen. Bioelektrizität und Ion Steigungen haben darüber hinaus eine Vielzahl von anderen wichtigen biologischen Funktionen wie Energiespeicher, Biosynthese und Metabolit Transport. Bioelektrische Signale wurde auch als Regulator des embryonalen Musterbildung wie körperachsen, Zellzyklus und Zelle Differe....

Protocol

Der Zebrabärbling in eine AAALAC genehmigt Tierstation untergebracht sind, und alle Versuche erfolgten nach den Protokollen von Purdue Animal Care und Nutzung Committee (PACUC) genehmigt.

1. Tol2 Transposon Plasmid Konstrukt Vorbereitung

Hinweis: Tol2, ein Transposon, das Medaka Fisch entdeckt wurde hat in der Zebrafisch Forschung Gemeinschaft^8,9verbreitet wurde. Es wurde erfolgreich an das Gateway ortsspezifische Rekombination basierende Klonen System angenommen und als Tol2 Kit¹⁰bekannt. Das Tol2-Kit ermöglicht eine sehr komfortabl....

Results

In einer erfolgreichen Injektion, mehr als 50 % injiziert Fischembryonen zeigt ein gewisses Maß an grünen Fluoreszenz in den somatischen Zellen, und die meisten von ihnen werden positiv von Tol2 Transposon Verbrauchsteuern Assay (Abbildung 2). Nach 2-4 Generationen von Out-Kreuz mit Wildtyp-Fisch (bis der fluoreszierenden Fisch 50 %, die erwarteten Mendelian Verhältnis erreichen), wurden die transgene Fische für das imaging Experiment zur Zellmembran Potentia.......

Discussion

Obwohl die Mobilfunk- und Gewebe elektrische Aktivitäten während der embryonalen Entwicklung und Krankheit beim Menschen vor langer Zeit entdeckt wurden, bleiben die in Vivo dynamische elektrische Veränderungen und deren biologische Rollen noch weitgehend unbekannt. Eine der großen Herausforderungen ist zu visualisieren und zu quantifizieren, die elektrischen Veränderungen. Patch-Clamp-Technologie ist ein Durchbruch für die Verfolgung von Einzelzellen, aber seine Anwendung auf vertebrate Embryonen ist begrenzt, .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
14 ml Zellkulturröhrchen	VWR	60818-725	E.Coli-Kultur
Agarose-Elektrophoresetank	Thermo Scientific	Owl B2	DNA-Eletrophorese
Agarose RA	Amresco	N605-500G	Zur Herstellung der Injektionsgele
Attb1-ASAP1-F Primer	IDT DNA	GGGGACAAGTTTGTACAAAAAA GCAGGCTTCACCATGGAGACGA CTGTGAGGTATGAACA	Amplifikation der ASAP1-kodierenden Region für die Subklonierung
Attb2-ASAP1-R Primer	IDT DNA	GGGGACCACTTTGTACAAGAAA GCTGGGTCTTAGGTTACCACTTC AAGTTGTTTCTTCTGTGAAGCCA	ASAP1 kodierende Region-Amplifikation für die Subklonierung
Hellfeld-Dissektions-Scope	Nikon	SMZ 745	Dechorionierung, Mikroinjektion, Montage
Farbkamera	Zeiss	AxioCam MRc	Fischembryo Bildaufzeichnung
Konkaver Objektträger	VWR	48336-001	Zum Halten von Fischembryonen während des Bildgebungsprozesses
Einweg-Transferpipette 3,4 ml	Thermo Scientific	13-711-9AM	Fischembryonen und Wassertransfer
Endonuklease-Enzym, nicht NEB		R0189L	Zur Linearisierung von Plasmid-DNA
Epifuoreszierendes Verbindungsendoskop	Zeiss	Axio Imager.A2	Fisch Embryo-Bildgebung
Epifuoreszente Stereo-Dissektions-Scope	Zeiss	Stereo Discovery.V12	Embryo-Bildgebung von Fischen
Fluoreszenzlichtquelle	Lumendynamik	X-cite seris 120	Lichtquelle für Fluoreszenzmikroskope
Pinzette #5	WPI	500342	Dechorionation und Nadelbruch
Gateway BP Clonase II Enzymmischung	Thermo Scientific	11789020	Gateway BP Rekombinationsklonierung
Gateway LR Clonase II Plus Enzym	Thermo Scientific	12538120	Gateway LR Rekombinationsklonierung
Gel DNA Recovery Kit	Zymo Research	D4002	DNA-Gel-Aufreinigung
Ladespitze	Eppendorf	930001007	Zum Laden von Injektionslösung in Capilärnadeln
Methylcellulose (1600cPs)	Alfa Aesar	43146	Fischembryo-Montage
Methylenblau	Sigma-Aldrich	M9140	Unterdrückt Pilzausbrüche in Petrischalen
Mikrospritzgussform	Adaptive Science Tools	TU-1	Zur Vorbereitung der Agaorse-Formschale für die Aufbewahrung von Fischembryonen während der Injektion
Mikroinjektor	WPI	Pneumatische Picopump PV820	Mikroinjektionsinjektor
Mikromanipulator	WPI	Mikroinjektor MM3301R	Mikroinjektionsbetrieb
Mikropipettenabzieher	Sutter Instrument	P-1000	Zur Vorbereitung der Kapillarnadel
Mineralöl	Amresco	J217-500ml	Zur Kalibrierung des Injektionsvolumens
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transkriptionskit	Thermo Scientific	AM1340	mRNA in vitro Transkription
Monocolor Kamera	Zeiss	AxioCam MRm	Bildaufzeichnung von Fischembryonen
Plasmid Miniprep Kit	Zymo Research	D4020	Bereiten Sie eine kleine Menge Plasmid-DNA
Petrischalen aus Kunststoff	VWR	25384-088	Zum Halten von Fischen oder Fischembryonen während des Bildgebungsprozesses
RNA Clean & Concentrator-5	Zymo Research	R1015	mRNA-Reinigung nach der In-vitro-Transkription
Spektrophotometer	Thermo Scientific	NanoDrop 2000	Zur Messung von DNA- und RNA-Konzentrationen
Tischmikrometer	Am Scope	MR100	Mikroinjektionsvolumenkalibrierung
Thermocycler	Bio-Rad	T100	DNA-Amplifikation für die Genklonierung
Dünnwandig Glaskapillaren	WPI	TW100F-4	Rohglas zur Herstellung von Kappilarnadeln
Tol2-exL1 Primer	IDT DNA	GCAACACCAGAAATGCCCTC	Tol2 Excise
Assay Tol2-exR Primer	IDT DNA	ACCCTCACTAAAGGGAACAAAAG	Tol2 Excise Assay
TOP10 Chemisch kompetente E. coli	Thermo Scientific	C404006	Wird für die Transformation während der Genklonierung verwendet
Tricainmesylat	Sigma-Aldrich	A5040	Zur Betäubung von Fischen oder Fischembryonen
UV-Transilluminator 302nm	UVP	M-20V	DNA-Visualisierung
	Wasserbad Thermo Scientific	2853	Für den Transformationsprozess der Genklonierung