Titration ELISA als eine Methode zur Bestimmung der Dissoziationskonstante Rezeptor Liganden Interaktion

Zusammenfassung

Ein detailliertes Protokoll, eine Titrierung ELISA durchzuführen wird beschrieben. Darüber hinaus wird ein neuartiger Algorithmus, Titration ELISAs zu bewerten und zu einer Dissoziationskonstante Bindung eines lösliche Liganden an einen Mikrotiter Platte immobilisiert Rezeptor präsentiert.

Zusammenfassung

Die Dissoziationskonstante beschreibt die Wechselwirkung zwischen zwei Partnern in das verbindliche Gleichgewicht und ist ein Maß für die Affinität. Es ist ein entscheidender Parameter verschiedener Liganden, z.B., wettbewerbsfähige Inhibitoren, Protein-Isoformen und Mutanten, für ihre Bindungsstärke an einen Bindungspartner zu vergleichen. Dissoziation-Konstanten werden durch Konzentrationen von gebundenen gegenüber freien Liganden als verbindliche Kurven Plotten bestimmt. Im Gegensatz dazu sind Titrierung Kurven, in denen ein Signal, das proportional zur Konzentration des gebundenen Liganden ist gegen die Gesamtkonzentration an zusätzlichen Liganden geplottet wird leichter zu erfassen. Das Signal kann spektroskopisch und durch Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA) erkannt werden. Dies wird in einem Protokoll für eine Titration ELISA illustriert, die die Bindung von der Schlange Venom-abgeleitete Rhodocetin in seiner immobilisierten Zieldomäne Integrin α2β1 misst. Titration ELISAs sind vielfältig und weit verbreitet. Jedes Paar von interagierenden Proteine können als immobilisierte Rezeptor und lösliche Liganden verwendet werden, vorausgesetzt, dass beide Proteine rein sind, und deren Konzentrationen sind bekannt. Die Schwierigkeit war bisher die Dissoziationskonstante aus einer Titration-Kurve zu bestimmen. In dieser Studie wird eine mathematische Funktion, die zugrunde liegenden Titrierung Kurven eingeführt. Ohne keine fehleranfällige grafische Schätzung einer Sättigung Rendite ermöglicht dieser Algorithmus Verarbeitung der Rohdaten (Signalintensitäten bei verschiedenen Konzentrationen von zusätzlichen Liganden) direkt durch mathematische Auswertung über eine nichtlineare Regression. So mehrere Titrierung Kurven können gleichzeitig aufgenommen und umgewandelt in eine Reihe von charakteristischen Parameter, darunter die Dissoziationskonstante und die Konzentration der Bindung-aktiv-Rezeptor, und sie können statistisch ausgewertet werden. In Kombination mit diesem Algorithmus Titration ELISAs profitieren die Dissoziationskonstante direkt zu präsentieren. Daher können sie in Zukunft effizienter genutzt werden.

Einleitung

Die Dissoziationskonstante K ist ein wichtiger Parameter, die Affinität eines Rezeptors (R) für seine Liganden (L) zu beschreiben. Basierend auf dem Gesetz der Masse, wird K für das Gleichgewicht definiert in denen die Rezeptor-Ligand-komplexen RL in den R-Rezeptor und Ligand L: distanziert sich

            Gleichung 1

mit den Indizes f , die frei/ungebundenen Zustand von Rezeptor und Ligand. Die Konzentration der Rezeptor-Ligand-Komplex, RL, ist identisch mit der Konzentration der R....

Protokoll

(1) auf lagerlösungen

1. Um 100 mL 10 X TBS pH 7.4 Lösung vorzubereiten, 6,06 g TRIS und 8,77 g NaCl in 90 mL entionisiertem Wasser auflösen, anpassen des pH-Werts 7,4 mit 37 % HCl-Lösung, die Lautstärke auf 100 mL mit entionisiertem Wasser füllen und Filtern Sie die Lösung.
2. 100 mL 1 vorbereiten M HEPES/NaOH, pH 7.4 Lösung 23,83 g HEPES in 90 mL entionisiertem Wasser auflösen, anpassen den pH-Wert 7,4 mit 1,5 M NaOH, füllen Sie die Lautstärke auf 100 mL mit entionisiertem Wasser und Filtern Sie die Lösung.
3. Lösen Sie um 100 mL 5 M NaCl-Lösung vorzubereiten, 29,2 g NaCl in 90 mL entionisiertem Wasser. Füllen Sie die Lautstärke auf 100 mL mit e....

Ergebnisse

Nach der ELISA entwickelt wurde, die gelbe Farbe des Substrats konvertierten alkalische Phosphatase, Para- Nitrophenolate, weist darauf hin, dass die Menge des gebundenen Rhodocetin Liganden sinkt mit abnehmender Konzentration von zusätzlichen Rhodocetin aus Spalten 1 bis 11 (Abbildung 1). Die farblosen Vertiefungen in der Rhodocetin-freien Brunnen in Spalte 12 zeigen eine niedrige Hintergrundsignal.

Diskussion

Die Titration ELISA ist ein vielseitiger Testsystem für die Dissoziation von einem Rezeptor-Ligand Interaktion bestimmen. Als die Titration ELISA umgeht die Notwendigkeit, freie und gebundene Liganden effektiv zu trennen und ihre Konzentration quantitativ analysieren wesentlich mehr Studien und Publikationen haben Titration ELISAs beschäftigt, anstatt Bindung Kurven . Darüber hinaus sind Titration ELISAs einfach durchzuführen und erfordert relativ geringe Mengen an Rezeptor und Ligand. Für die genaue Analyse der Dissozia.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
TRIS	neoFrox	1125KG001
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
NaCl	Applichem	1,316,591,214
MgCl2	Merck	172571
integrin a2A, wild-type und Mutant, rekombinant		isoliert im Labor des Autors
NiNTA Superflow Säule	Qiagen, Deutschland	30821
Coomassie-Brilliant Blue R250	Serva	35050
Bicinchoninic acid Assay (BCA), Proteinkonzentrationsbestimmungskit	Fisher Scientific	23225
Bovines Serumalbumin (BSA), Fraktion V	Applichem	A1391
25 %ige Lösung von Glutaraldehyd	Merck	354400
Anti-Kaninchen-Immunglobulin-Antikörper vom Ziegentyp, konjugiert mit alkalischer Phosphatase	Sigma-Aldrich	A9919
Glycin	Applichem	A1377
Zn(II)-acetat	Applichem	A4324
NaOH	Applichem	A1551
Alkaline Phosphatase Substrat Tablette (5 mg)	Sigma-Aldrich	S0942
Costar Halbflächen-Mikrotiterplatte	Thermo Scientific	Corning 3690
Mikroreaktionsröhrchen	Eppendorf	30120086
Microplate ELISA Reader	BioTek	Synergy HT