Quantifizierung der Lipid-Fülle und Bewertung von Lipid Verteilung in Caenorhabditis Elegans von Nil-rot und Öl rot O Färbung

Summary

Nil rote Färbung der festen Caenorhabditis Elegans ist eine Methode zur quantitativen Messung der neutral Lipid Ablagerungen, während Öl rote Färbung O qualitative Bewertung der Lipid-Verteilung zwischen den Geweben ermöglicht.

Abstract

Caenorhabditis Elegans ist eine außergewöhnliche Modellorganismus in der Lipidstoffwechsel und Energie-Homöostase zu studieren. Viele seiner Lipid-Gene sind beim Menschen konserviert und metabolisches Syndrom oder anderen Krankheiten zugeordnet werden. Prüfung der Lipid-Akkumulation in diesem Organismus kann durch Fixativ Farbstoffe oder markierungsfreie Methoden durchgeführt werden. Fixativ Flecken wie Nil rot und rot O Öl sind preiswerte, zuverlässige Methoden zur Messung quantitativ Blutfettwerte und qualitativ Lipid-Verteilung über Gewebe, bzw. zu beobachten. Darüber hinaus erlauben diese Flecken für Hochdurchsatz-Screening von verschiedenen Lipid-Stoffwechsel-Gene und Wege. Darüber hinaus ihre hydrophoben Natur erleichtert Lipid Löslichkeit, Interaktion mit der umgebenden Gewebe reduziert und Dissoziation in das Lösungsmittel verhindert. Obwohl diese Methoden effektiv bei der allgemeinen Fettgehalt zu prüfen sind, bieten sie keine detaillierte Informationen über die chemische Zusammensetzung und Vielfalt der Lipid-Ablagerungen. Für diese Zwecke markierungsfreie Methoden wie GC-MS und CARS-Mikroskopie besser geeignet, deren Kosten trotz.

Introduction

Lipide sind lebensnotwendig. Sie sind integrale Bestandteile von Membranen, fungieren als sekundäre Botenstoffe und signal-Wandler und haben wichtige Funktionen der Energiespeicherung. Wenn Fettstoffwechsel Dysregulated ist, führt dies zu Krankheiten wie Adipositas und Diabetes Typ II, die öffentliche Gesundheit Bedenken⁹drücken. Caenorhabditis elegans (C. Elegans) ist eine ausgezeichnete Modellorganismus in der Fettstoffwechsel zu studieren, weil es eine relativ kurze Lebensdauer, ein transparenter Körper, eine bekannte Zelle Abstammung und ein vollständig sequenzierte Genom hat. In erster Linie ein Hermaphrodit, C. Elegans erlaubt es den Forschern zu zahlreicher isogenen Tiere in kurzen Zeiträume Mitnahmeservice Hochdurchsatz-vorwärts genetischer Bildschirme, eine breite Palette von metabolischen Gene und Wege⁴zu studieren. Dieser Ansatz hat ein hohes Maß an Schutz in 273 C. Elegans -Lipid-Stoffwechsel-Genen zwischen Menschen, Mäuse, Ratten und Drosophila ergeben. Darüber hinaus haben mehr als 300 Lipid-Gene in C. Elegans menschlichen Orthologe, die mit Krankheiten, die in keinem Zusammenhang mit metabolischem Syndrom¹¹verbunden sind. Prüfung der Lipid-Lagerung in C. Elegans hat traditionell meist auf Farbstoff-markierten Assays, gestützt, die robuste über Lipid-Ansammlung Auskunft. Seltener ist eine Beschreibung von Lipiden wo lokalisieren und gemessenen Unterschiede in Hülle und Fülle Lipid über Gewebe. Neuere Arbeiten ergaben jedoch, dass Lipid Verteilung genauso wichtig wie Lipid Ansammlung⁶sein kann.

In letzter Zeit Studien haben begonnen, Integration von Methoden wie hohe Leistung flüssige Chromatographie-Massenspektrometrie (HPLC-MS), Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) und kohärente Anti-stokes Raman-Streuung (Autos) Mikroskopie an Adresse der Mängel der Fleck-basierte Ansätze direkt analysiert den Inhalt der Lipid-Extrakte, spezielle Lipid Brüche und Lipid Ablagerungen, bzw.^10,11. Darüber hinaus hat CARS-Mikroskopie ergeben, dass Nils rot nur als Proxy für Fettansammlung Verwendung als Fixativ Farbstoff, für den Einsatz als ein wichtige Fleck zum Ziel-Färbung des Auto-fluoreszierende Organellen^{10 führt}dienen kann. Jedoch die erforderliche technische Know-how und Kosten im Zusammenhang mit diese Chromatographie und Mikroskopieverfahren nutzen ihre unhaltbar für viele Fragestellungen. In diesem Artikel besprechen wir eine bequeme und sichere Methode zum fixieren und neutral Lipid-Ablagerungen in C. Elegans mit Nil rot färben und Öl rot O um Lipid Fülle in ganze Tiere und in bestimmten Geweben zu unterscheiden.

Nil-rot, 9-diethylamino-5H-benzo[α]phenoxazine-5-one, ist ein Benzophenoxazone Farbstoff, der leicht löst sich in verschiedenen organischen Lösungsmitteln, aber meist in Wasser unlöslich. Es ist eine ausgezeichnete Lysochrome Farbstoff verwendet, neutralere Lipiden wie Triglyceride zu beflecken oder Cholesterin Ester da freuen Sie sich auf eine starke Farbe solubilisiert gut in Lipiden, hat vernachlässigbare Interaktion mit umgebenden Gewebe und ist weniger löslich im Lösungsmittel als in Lipide. Es verfügt über eine Anregung und Emission Maxima von 450-500 und 520 nm, bzw.¹. Bei Nil rot gefärbten C. Elegans für grüne Fluoreszenz angezeigt wird, können diskrete Lipid Körper beobachtet in den Darm und anderen Geweben entweder in Clustern oder gleichmäßig verteilt, je nach Genotyp oder experimentelle Behandlung des Tieres ⁷.

Öl rot O ist ein Lysochrome, fettlösliche Färbemittel verwendet, Triglyceride und Lipoproteine zu beflecken. Es ist eine Azo-Farbstoff genannt, weil seine chemische Struktur zwei azo Gruppen an drei aromatischen Ringen befestigt enthält. Es ist schwer zu ionisieren, das macht es sehr löslich in Lipiden. Seine Fleck Farbe ist rot und seine maximale Lichtabsorption 518 nm ³. C. Elegans gebeizt mit Öl rot O zeigen rote Lipid-Tröpfchen, die sich gegen das Tier durchsichtigen Körper, die qualitative Bewertung der Lipid-Verteilung zwischen den verschiedenen Geweben⁶erleichtert.

Protocol

(1) Nil rot (NR) Färbung der Lipide

1. Vorbereitung von 5 mg/mL NR Stammlösung
   1. Fügen Sie 100 mg NR Pulver in einen 500-mL-Flasche hinzu 200 mL 100 % Aceton.
   2. Decken Sie die Flasche mit Alufolie zu jeder Lichteinfall zu vermeiden.
   3. Vor dem Gebrauch rühren Sie die Lösung für 2 h im Dunkeln.
   4. Für langfristigen Gebrauch speichern Sie NR Vorratslösung in einer gut verschlossenen Flasche ohne jede Belichtung. NR-Stammlösung nach Forschungsbedarf zu skalieren. Sicherstellen Sie, dass die gleichen Stammlösung über NR-Färbung Experimente verwendet wird, um einheitliche Färbung und imaging Ergebnisse erhalten.
2. Vorbereitung der Arbeitslösung NR
   1. Fügen Sie für jeden 1 mL 40 % Isopropanol (V/V) 6 µL der Stammlösung NR.
   2. Jede Probe 600 µL Arbeitslösung NR vorbereiten.
      Hinweis: Stellen Sie frische NR arbeiten Lösung direkt vor der Färbung. NR-Stammlösung Bedürfnissen verwenden Sie eine 15 mL oder 50 mL absolvierte konischem Rohr.
3. Vorbereitung von Würmern NR Lipid Färbung
   1. Wachsen Sie Würmer zu früh L4 bei 20 ° C auf Nematoden Wachstumsmedium (NGM) mit späten Log OP50 E. Coliausgesät.
   2. Waschen Sie die Würmer aus der Platte mit 1 mL 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung + 0,01 % Triton x-100 (PBST) Lösung und die Wurm-Suspension in einem 1,5 mL Microfuge Rohr.
   3. Zentrifuge aus Aussetzung entfernen die Würmer bei 560 X g für 1 min. die überstand und wiederholen Sie diesen Schritt bis E. Coli deaktiviert ist.
   4. Das Wurm-Pellet 100 µL 40 % Isopropanol hinzu und bei Raumtemperatur 3 min inkubieren.
   5. Die Würmer bei 560 X g für 1 min Zentrifugieren und Entfernen des Überstands ohne Unterbrechung der Wurm Pellet.
      Hinweis: Nutzung höhere Volumina der PBST die Würmer von den Tellern zu waschen, wenn mit größeren Platten oder Färbung mehr Würmer pro Platte. Waschen Sie die Würmer in PBST mehr als 15 min vor der Fixierung der Probe nicht. Führen Sie weitere Waschungen, wenn der Überstand der Bakterien nicht deaktiviert ist. Führen Sie die Inkubation in 40 % Isopropanol mit einem Nutator oder Wippe. Immer überwachen Sie die Rohre, um sicherzustellen, dass vollständige Probe Erregung stattfindet.
4. Lipid Färbung mit NR
   1. Fügen Sie in der Dunkelheit 600 µL Arbeitslösung NR jeder Probe hinzu. Invertieren Sie die Rohre dreimal und mischen Sie die Würmer in NR-Lösung vollständig zu.
   2. Drehen Sie die Probe im Dunkeln bei Raumtemperatur für 2 h.
   3. Nach der Inkubation die Würmer bei 560 X g für 1 min Zentrifugieren und den Überstand zu entfernen.
   4. Fügen Sie 600 µL PBST und inkubieren Sie die Proben in der Dunkelheit für 30 min um überschüssige NR Fleck zu entfernen.
   5. Zentrifugieren Sie die Proben bei 560 X g für 1 min und entfernen Sie alle ca. 50 µL überstand.
      Hinweis: NR Inkubation erfordert keine Unruhe. Absetzen von Würmern ist üblich bei diesem Schritt.
5. Erstellung von Folien für Mikroskop Bildgebung
   1. Das Wurm-Pellet im restlichen überstand aufzuwirbeln.
   2. 5 µL der Wurm Aussetzung auf einen Objektträger legen Sie und einem Deckgläschen auf sorgfältig einfangen von Luftblasen zu vermeiden.
   3. Das Deckglas mit Nagellack vor imaging Würmer zu versiegeln.
   4. Bereiten Sie nur ein Paare Folien zu einem Zeitpunkt. Dadurch wird sichergestellt, dass NR Bildgebung über Proben konstant bleibt. Die Qualität der NR-gefärbten Bilder verringert sich nach 6 h. diskrete Lipid Tröpfchen schwer sind zu beobachten und Hintergrundfluoreszenz erhöht, die stört NR Signalerkennung.
6. Bildgebung des NR-gefärbten Würmer
   1. Bild der Würmer bei 5 X Vergrößerung, mehrere Tiere pro Gesichtsfeld zu erfassen.
   2. Wechseln Sie zu 10-facher Vergrößerung für bessere Quantifizierung der einzelnen Würmer.
   3. Verwenden Sie FITC/GLP-Kanal Bild NR-gefärbten Würmer und versuchen unterschiedliche Belichtungszeiten zu bestimmen, die optimale Bedingungen für die Quantifizierung.
   4. Speichern von Dateien im TIF-Format, um Datenverlust durch Kompression zu vermeiden.
      Hinweis: Typische Belichtungszeiten reichen von 100-1000 Frau, die eine optimale Belichtungszeit, verwenden Sie es für alle Proben um zu bildgebenden Konsistenz zu gewährleisten.
7. NR Färbung Bild Quantifizierung
   1. Hochladen Sie Mikrographen auf ImageJ. Verwenden Sie im Pulldown-Menü Plugins die Bio-Formate-Funktion, wenn die Image-Datei nicht erkannt wird.
   2. Verwenden Sie in der Bild-Pull-Down-Menü unter dem Stapel-Funktion Bilder-Stack, um einem Bildstapel zu erstellen, wenn mehrere Aufnahmen verglichen werden.
   3. In der gleichen Pull-Down-Menü anpassen von Helligkeit/Kontrast im Bild-Stapel und Änderungen auf alle Bilder zu verbreiten, indem Sie auf Übernehmen geklickt.
   4. Beschäftigen Sie die Polygon-Auswahl-Werkzeug jeder abgebildeten Wurm abzugrenzen und die Messfunktion unter Analyse Pull-Down-Menü um Fluoreszenzintensität emittierten NR zu quantifizieren.
   5. Messen Sie für jedes Bild fünf Hintergrund Standorten und berechnen Sie die durchschnittliche Hintergrund Fluoreszenz-Intensität.
   6. Subtrahieren Sie die Hintergrund-Fluoreszenzintensität von jeder abgebildeten Wurm mit Hilfe der Formel N = G - (A x B), wobei N für net Fluoreszenz, G für grobe Fluoreszenz, für insgesamt Wurm Bereich A und B für durchschnittliche Hintergrundfluoreszenz steht.
   7. Um der Fluoreszenzintensität nach Wurm Größe zu normalisieren, Teilen des Wurms net Fluoreszenz durch seine Gesamtfläche. Die Ergebnisse werden als Fluoreszenzintensität, in beliebigen Einheiten (AE), pro Pixel dargestellt.
      Hinweis: Vermeiden Sie die Bilder im JPEG-Format exportieren. Während Kompression Dateien übersichtlicher macht zu speichern, ist die Integrität der Daten durch dieses Format gefährdet. Stellen Sie sicher, dass alle Bilder modifiziert und identisch analysiert sind. Denken Sie daran, eine Maßstabsleiste um Größe bei verschiedenen Vergrößerungen richtig zu bewerten. Um Unterschiede in der Fluoreszenzintensität mit ImageJ besser zu visualisieren, wechseln Sie Bildtyp aus RGB 8-Bit zu und wählen Sie Feuer aus dem Menü "Bild Lookup Tabellen (LUT)". Dadurch entsteht eine Heatmap Bild in welcher erhöhte Farbe Helligkeit mit erhöhten Fluoreszenzintensität korreliert.

2. Öl rot O Färbung (ORO) von Lipiden

1. Vorbereitung der ORO-Stammlösung
   1. In einer 250 mL Flasche 100 mL 100 % Isopropanol 500 mg Pulver ORO hinzufügen und gut verrühren.
   2. Nachdem vorbereitet, speichern Sie die Lösung, die dicht mit keine Belichtung.
2. Vorbereitung der Arbeitslösung ORO
   1. ORO-Stammlösung in Wasser (3:2) zu 60 % Isopropanol zu verdünnen.
   2. Vor dem Gebrauch filtern Sie die Arbeitslösung ORO durch einen 0,2 µm Celluloseacetat sterile Spritze filter
      Hinweis: Für beste Lösungsqualität bereiten Sie Arbeitslösung ORO am Vortag vor, und lassen Sie es über Nacht mischen. Jedoch wenn Lösung benötigte gleichentags, verdünnen Sie und mischen Sie ORO Lösung auf einer Wippe für mindestens 2 Stunden vor Gebrauch. Wickeln Sie vor Schaukeln, konische Rohr in Paraffin Band zum Auslaufen der ORO-Lösung zu vermeiden.
3. Vorbereitung von Würmern ORO Lipid Färbung
   1. Wachsen Sie die Würmer bei 20 ° C auf Nematoden Wachstumsmedium (NGM) mit späten Log OP50 E. Coli , gewünschte Lebensstadium ausgesät.
   2. Die Platte 1 mL PBST-Lösung hinzu und schwenken Sie, bis alle Würmer aus der Platte sind. Kippen Sie die Platte und waschen Sie ihn mit 1 mL der PBST. Übertragen Sie die Wurm-Aussetzung zu einem 1,5 mL Microfuge Schlauch.
   3. Zentrifuge, die Würmer bei 560 X g für 1 min. den Überstand entfernen ohne Pellets und wiederholen Sie die Reinigung Schritt mit 1 mL PBST dreimal zu stören. Entfernen Sie alle überstand aber 100 µL.
   4. Das Wurm-Pellet 600 µL 40 % Isopropanol hinzu und bei Raumtemperatur 3 min rock.
   5. Zentrifugieren Sie die Würmer auf 560 x g für 30 s und entfernen alle überstand aber 100 µL ohne Unterbrechung der Wurm Pellet.
      Hinweis: Verwenden Sie höhere Volumina der PBST Würmer von Tellern zu waschen, wenn Hochdurchsatz-Färbung zu tun. Waschen Sie Würmer in PBST mehr als 15 min vor der Probe Fixierung nicht. Weitere Waschungen zu tun, wenn Überstand der Bakterien nicht deaktiviert ist. Inkubation in 40 % Isopropanol mit einem Nutator oder Wippe durchführen. Immer überwachen Sie Röhren, um sicherzustellen, dass vollständige Probe Erregung stattfindet.
4. Lipid Färbung mit ORO
   1. Jede Probe 600 µL ORO Arbeitslösung hinzufügen. Invertieren der Röhre dreimal und die Würmer in ORO gut mischen.
   2. Drehen Sie die Proben bei 30 u/min für 2 h bei Raumtemperatur.
   3. Zentrifugieren Sie die Proben bei 560 X g für 1 min und beseitigen Sie alle überstand aber 100 µL.
   4. Aufschwemmen Sie Proben in 600 µL PBST und drehen Sie der Rohre bei 30 u/min für 30 min um überschüssige ORO Fleck zu entfernen.
   5. Zentrifugieren Sie Proben bei 560 X g für 1 min und beseitigen Sie alle, aber 50 µL überstand.
   6. Um den Speicherort der Keimbahn und Darmzellen des Tieres besser zu unterscheiden, Fleck Kerne durch Zugabe von 1 µL (2-(4-amidinophenyl) - 1 H-Indol-6-Carboxamidine) (DAPI) für jeden 1 mL ORO funktionierende Lösung. ORO Färbung für 2 h mit dem Hinzufügen von DAPI vor der Montage der Folien für die Bildgebung durchführen. Intestinale Kerne sind größer und die Gonade zeichnet sich durch die entwickelnden Keimzellen.
      Hinweis: Nach ORO Färbung, können Würmer halten an den Seiten des Microfuge Rohres und nicht zu einen spürbaren Pellet bilden. In diesem Fall Zentrifugieren Sie die Würmer wieder oder lassen Sie Würmer durch die Schwerkraft für mindestens 10 min zu begleichen.
5. Vorbereitung der Folien auf Wurm imaging
   1. Aufschwemmen Sie der Würmer im restlichen überstand und mischen Sie die Lösung gut.
   2. 5 µL der Wurm Aussetzung auf einen Objektträger und stellen Sie einem Deckgläschen sorgfältig, um sicherzustellen, dass keine Form Luftblasen.
   3. Das Deckglas mit Nagellack und Bild Würmer zu versiegeln.
      Hinweis: Nach Fixierung und Färbung, können Würmer sehr steif und schwer zu pipette sein. Um dies zu umgehen, stellen Sie weite Bohrung Pipetten durch das Abschneiden ihrer Spitzen.
   4. Speichern Sie die Folien in einem Mikro-Zentrifuge Rack bei 4 ° C bis zu 24 Stunden, wenn nicht sofort nach dem Färben imaging.
6. Bildgebung der ORO-gefärbten Würmer
   1. Verwenden Sie eine Farbe-fähigen Kamera Bild ORO-gefärbten Würmer.
   2. Verwenden Sie 5 X Vergrößerung, um mehrere Würmer in einem Blickfeld Bild.
   3. Wechseln Sie zu 10-facher Vergrößerung für bessere Prüfung der einzelnen Würmer.
   4. Exportieren Sie Bilder im TIF-Format, um Datenverlust durch Kompression zu vermeiden.
      Hinweis: Wenn Färbung mit ORO + DAPI, wechseln Sie die Farbe-fähigen Kamera zu einem, die Fluoreszenz erfassen können.
7. Bildanalyse von ORO-gefärbten Würmer
   1. Laden Sie Micrograph(s) auf ImageJ. Verwenden Sie im Pulldown-Menü Plugins die Bio-Formate-Funktion, wenn die Image-Datei nicht erkannt wird.
   2. Verwenden Sie in der Bild-Pull-Down-Menü unter dem Stapel-Funktion Bilder-Stack, um einem Bildstapel zu erstellen, wenn mehrere Aufnahmen verglichen werden.
   3. Passen Sie Helligkeit/Kontrast unter der gleichen Pull-Down-Menü zur Verbesserung der Sichtbarkeit der Lipid-Tröpfchen.
   4. Kategorisieren Sie die Bilder nach Lipid-Akkumulation im gesamten Körper des Tieres oder in bestimmten Geweben.
   5. Zur besseren Beurteilung des Lipid-Lokalisierung und für die Identifizierung von unspezifischen Bildartefakte mit ImageJ wählen Sie die Farbe-Funktion unter dem Pulldown-Menü "Bild" und klicken Sie auf Stapel zu RGB, die Signale der einzelnen RGB-Komponenten zu zeigen.

Results

SKN-1 ist ein bZip, zellschützenden Transkriptionsfaktor, der teilt Homologie mit Säugetieren NRF2 und hat gezeigt, dass Fettsäureoxidation vermitteln. Abhängig von der Glukosekonzentration in ihrer Ernährung zeigen Würmer mit einer konstitutiv aktivierten Skn-1 Allel verschiedene Blutfettwerte bei Nil rot⁷klebt. Abbildung 1A -C zeigt aktivierten Skn-1 -Tiere, die Bedingungen, die zur Erhöhung der Blu...

Discussion

Der Anstieg der Adipositas und metabolische Krankheit Preise macht C. Elegans ein geeignetes Modell, die Mechanismen zu studieren, die Fettansammlung in Zellen und Geweben zu regulieren. Aktuelle Hinweise darauf, dass die Änderungen im Blutfettwerte mit zellulärer Prozesse von Insulin Signalisierung⁸, die Aktivierung der Hormon-Rezeptoren als²Reproduktionsleistung⁵korreliert sind. Im Vergleich zu markierungsfreie Mikroskopie und Chromatograp...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Imager.M2m Mikroskop	Zeiss	n/a	Fluoreszenzmikroskop
ERC5s Kamera	Axiocam	n/a	Farbfähige
MRm Kamera	Axiocam	n/a	Fluoreszenzfähig
Nilrot	Thermo Fisher	N1142	Lipidfleck
Öl rot O	Alfa Aesar	A12989	Lipidfleck
DAPI	Thermo Fisher	D1306	DNA-Färbung
Isopropylalkohol	BDH	BDH1133-1LP	Fixierlösung
0,2 & Mikro; m seterile Spritzenvorsatzfilter	VWR	28145-477	Celluloseacetat-Filter
Zentrifuge 5430	Eppendorf	5428000015	Zentrifugenschüttler
Rotisserie	Lab Quake	400110Q	Shaker
Tube Rotator	VWR	10136-084	Rotator
K2HPO4	Sigma-Aldrich	7758-11-4	NGM
KH2PO4	Sigma-Aldrich	7778-77-0	NGM
MgSO4	Alfa Aesar	7786-30-3	NGM
CaCl2	Sigma-Aldrich	10035-04-8	NGM
NaCl	Sigma-Aldrich	7647-14-5	NGM
Cholesterin	Sigma-Aldrich	57-88-5	NGM
Pepton	BD Biosciences	211677	NGM
Agar	Teknova	L9110	NGM
LB Medien	Sigma-Aldrich	L3147	Bakterienwachstum