Wir beschreiben eine einfache und leichte Protokoll zur Messung der Antikörper abhängige Verstärkung der Infektion durch Zika Virus genesenden Serum mit Dengue-Virus Reporter Viruspartikel.
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Methodenartikel
Eine einfache Durchflusszytometrie basierten Test um festzustellen, In-vitro- Antikörper abhängige Verbesserung des Dengue-Virus mit Zika-Virus genesenden Serum
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Antikörper abhängige Verstärkung der Infektion hat sich gezeigt, eine wichtige Rolle in Dengue-virale Pathogenese zu spielen. Traditionelle Assays, die die Kapazität von Antikörpern oder Serum Infektion in unzulässige Zelllinien zu messen haben stützte sich auf mit viralen Ausgabe in den Medien, gefolgt von Plaque-Assays, um Infektion zu quantifizieren. Diese Tests haben in jüngerer Zeit, Dengue-Virus (DENV) Infektion in die Zell-Linien mit Gewebekulturen beschriftete Antikörper untersucht. Beide Ansätze haben Einschränkungen, die den weit verbreiteten Einsatz dieser Techniken einschränken. Hier beschreiben wir einen einfachen in Vitro Assay mit Dengue-Virus Reporter Viruspartikel (RVP), die Ausdrücken grün fluoreszierendes Protein und K562-Zellen zu Antikörper abhängige Verstärkung (ADE) der DENV Infektion mit Serum, das Rhesus entnommen wurde Makaken 16 Wochen nach der Infektion mit Zika-Virus (ZIKV). Diese Technik ist zuverlässig, beinhaltet minimale Manipulation von Zellen, beinhaltet jedoch nicht die Verwendung von live Replikation zuständigen Virus und in einem hohen Durchsatz-Format für eine quantitative Auslesen mit Durchflusszytometrie erhalten durchgeführt werden kann. Darüber hinaus kann dieser Assay leicht angepasst werden, um Antikörper abhängige Verstärkung (ADE) der andere Flavivirus Infektionen wie Gelbfieber-Virus (YFV), japanische Equine Enzephalitis-Virus (JEEV), West-Nil-Virus (WNV) etc., RVP vorliegen, zu untersuchen. Die einfache Einrichtung der Assay, Datenanalyse und Interpretation der Ergebnisse macht es sehr geeignet, um die meisten Labor-Einstellungen.
Einleitung
Antikörper abhängige Verstärkung (ADE) der Infektion ist ein Prozess, wobei teilweise kreuzreaktiven Antikörperantworten induziert durch einen Serotyp des Virus verbessert die Aufnahme von einem anderen Serotyp des Virus, was zu erhöhten Virusreplikation und Virämie. ADE wurde ausgiebig in Dengue-Virusinfektionen (DENV) dokumentiert, wo die vier wichtigsten Serotypen weit verbreitet sind. Bei einem Teil der Patienten ist ADE Dengue hämorrhagisches Fieber (DHF) zugeordnet. Wir haben vor kurzem gezeigt, dass Zika-Virus (ZIKV)-Infektion signifikant hohe DENV kreuzreaktiven Antikörperantworten induziert, die ADE DENV in Vitro verursacht und wahrscheinlich dazu be....
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Protokoll
Die Serumproben verwendet, um die hier beschriebenen Protokoll demonstrieren wurden von Rhesus-Makaken erhalten, die untergebracht und umsorgt in Übereinstimmung mit lokalen, staatlichen und bundesstaatlichen Richtlinien in einem Verein für die Bewertung und Zulassung von Laboratory Animal Care International (AAALAC)-akkreditierten Einrichtung. Alle Tierversuche wurden überprüft und durch institutionelle Animal Care and Use Committee genehmigt und Proben wurden durch eine sharing-Protokoll übernommen.
1. Tag 1
Hinweis: Führen Sie die Schritte, die unten beschriebenen in einem sterilen Laminar-Flow Biosafety Kabinet....
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Ergebnisse
Seren von 4 Rhesus Makaken und auf ihr Potenzial zur Verbesserung DENV-1 getestet wurden gesammelt 16 Wochen nach Infektion mit ZIKV, 2, 3 und 4 Infektion in K562-Zellen. Die Tiere hatten Spitze Virämie von ~ 1 x 105 Exemplare von ZIKV RNA/mL Plasma vom 3. Tag nach der Infektion, die auf ein Niveau gesunken, die unter der Nachweisgrenze von 7 Tage nach der Infektion lagen. Keine Virämie wurde im Plasma auf 16 Wochen nach der Infektion festgestellt. Dann die RVP-Assay wurde durc.......
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Diskussion
Flaviviren wie DENV und ZIKV Teilen deutlichen Anzeichen Homologie in ihre strukturelle und nicht strukturelle Proteine, die Antikörper zu erzeugen, die mit einander13,14Kreuzreaktion. Diese kreuzreaktiven Antikörperantworten nachweislich zur Verbesserung der Infektion in Vivo und in Vitro mit einer heterologen Serotyp oder andere im Zusammenhang mit Flaviviren1,2. Kreuz zu verbessern, I.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Das beschriebene Projekt wurde aus Mitteln der Sonstiges Services University of Health Sciences, JJM unterstützt. Meinungen oder Aussagen, die hierin enthaltenen sind die privaten, der Autoren und nicht um sein als offizielle oder reflektierenden die Aussicht auf das Department of Defense, Sonstiges Dienstleistungen University Health Sciences oder einer anderen Agentur der USA ausgelegt Regierung.
WGV alle Experimente durchgeführt und analysiert die Daten; JJM konzipiert und betreut die Studie; WGW und JJM, schrieb die Zeitung.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| DENV 1-4 RVP | Integral Molecular | RVP-501 | |
| K562 Zellen | ATCC | CCL-243 | |
| RPMI | Corning | 10-040-CV | |
| FBS | GE Lebensgeschichten | SH 30910.03 | 10% FBS in RPMI-10 |
| Penicillin-Streptomycin | MP biomedizinische 1670049 | 100 IE Pen/ml, 100 ug Streptomycin in RPMI-10 | |
| HEPES | Cellegro | 25-060-Cl | 0,025 M in RPMI-10 |
| MEM Nicht-essentielle Aminosäurelösung (100 mal;) | Sigma | M7145 | 1x in RPMI-10 |
| Natriumpyruvat | Cellegro | 25-000-Cl | 1mM in RPMI-10 |
| L-Glutamin | Fisher | Scientific MT25005CI | |
| Sterile V-Bodenplatten | Thomas Scientific | 333-8001-01V | |
| BD Falcon Polypropylen 5 ml FACS-Röhrchen | VWR | 60819-728 | |
| Unsterile U-Bodenplatten | Falcon | Ref 353910 | Eine Alternative zu FACS-Röhrchen |
| 5 ml, steril, serologische Pipette | Denville | P7127 | |
| 200 μl sterile Pipettenspitzen | Denville | P3020 CPS | |
| 20uL sterile Pipettenspitzen | Denville | P1121 | |
| 50-200uL Mehrkanalpipette | Denville | P3975-8-B | |
| 5-50uL Mehrkanalpipette | Denville | P3975-9-B | |
| 20% formadehyde | Tousimis | #1008B | |
| Wasserbad | ThermoFisher | TSCOL35 | |
| Thermomixer | Eppendorf | 2231000387 | Eine Alternative zu einem Wasserbad zur Wärmeinaktivierung |
| CO2-Inkubator | ThermoFisher | 13-998-213 | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023 | |
| Flüssigbleiche | Fisher Scientific | NC9724348 | |
| Flowjo 9.8 | TreeStar, Inc. | Software für die Durchflusszytometrie-Analyse | |
| BD FACSDiva 6.1.2 | Becton Dikinson | ||
| BD LSR II Durchflusszytometer | Becton Dikinson | ||
| Flüssigbleiche | Fisher | Scientific NC9724348 |
Referenzen
- George, J., et al. Prior exposure to zika virus significantly enhances peak dengue-2 viremia in rhesus macaques. Sci Rep. 7 (1), 10498(2017).
- Stettler, K., et al. Specificity, cross-reactivity, and function of antibodies el....
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Nachdrucke und Genehmigungen
