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Punktion-induzierte Iris Neovaskularisation als einem Mausmodell der Rubeosis Iridis

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DOI:

10.3791/57398

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8. März 2018

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1Department of Clinical Neuroscience, Section of Eye and Vision, St Erik Eye Hospital, Karolinska Institutet

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Iris Neovaskularisation, eine häufige Komplikation der ischämischen Netzhauterkrankung kann zu Anblick-bedrohlichen neovaskulären Glaukoms führen. Hier beschreiben wir eine murinen Protokoll zur Induktion experimentelle Iris Neovaskularisation, die für nicht-invasive Beurteilung der Angiogenese-modulierender Substanzen verwendet werden kann.

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein Modell der Iris Punktion-induzierte Neovaskularisation als ein allgemeines Modell für nicht-invasive Evaluation der Angiogenese. Das Modell ist auch relevant für die Zielgruppenadressierung neovaskulären Glaukom, eine Sicht lebensbedrohliche Komplikation der diabetischen Retinopathie. Diese Methode beruht auf der Induktion von Iris vaskuläre Antwort von einer Reihe von selbstdichtend vorderen Pannen an Mäusen BALB/c und nutzt die Vorteile der postpartalen Reifung der Maus okuläre Gefäßsystem. Maus Welpen durchlaufen vorderen Punktionen von postnatale Tag 12,5, wenn die Welpen bis postnatale Tag 24,5 natürlich ihre Augen öffnen. Durch die Transparenz der Hornhaut kann Iris Gefäßsystem leicht Zeitreise durch nicht-invasive in-Vivo -Methoden analysiert werden. Darüber hinaus kann die halbtransparente Iris von BALB/c Mäusen Flatmounted für genaue Immunohistologic Analyse mit minimale unspezifische Hintergrundfärbung sein. In diesem Modell Angiogenese ist hauptsächlich durch die entzündliche und Plasminogen aktivieren Systeme. Die Punktion-induzierte Modell ist das erste, Iris Neovaskularisation bei kleinen Nagern zu induzieren und hat den Vorteil, dass direkte nicht-invasive in Vivo Analyse des Prozesses zur Angiogenese. Darüber hinaus das Modell angiogenen modulierender Substanzen, kombinierbar mit die highlights sein Potenzials in der Studie der Angiogenese mit einer in-Vivo -Perspektive.

Einleitung

Iris, zusammen mit dem Ziliarkörper und der Aderhaut, umfasst die Uvea, die die meisten vaskularisierte Gewebe des Auges ist. Iris Gefäßsystem ist unerlässlich bei der Aufrechterhaltung der Homöostase in der Vorderkammer des Auges. Als Folge der reichlich Anastomosen Verbindungen zwischen Arterien und Venen bieten Iris Blutgefäße Nähr- und Sauerstoffversorgung nicht nur um die Iris selbst, sondern auf das gesamte vordere Segment des Auges1.

Die Bildung neuer Blutgefäße oder Angiogenese aus bereits vorhandenen ist grundlegend in physiologischen Prozessen, wie Entwicklung und Wundheilung2. Angiogenese ist durch eine Vielzahl von kanonischen Faktoren, wie z. B. vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) und Plasminogen-Aktivator-Inhibitor (PAI), sowie mehrere Entzündungsfaktoren fein reguliert, und ein Ungleichgewicht dieser Faktoren kann zu pathologischen führen Angiogenese-3.

In den Augen verursacht Neovaskularisation Anblick lebensbedrohliche Krankheiten wie proliferative diabetische Retinopathie (PDR) und neovaskulären Glaukoms (NVG). Bei diesen okulären Erkrankungen die fokale Neovaskularisation liegt häufig in retinalen Gewebe, doch das Ungleichgewicht bei entzündlichen und angiogenen Faktoren in den hinteren und vorderen okulären Kammern des Auges wurde mit Rubeosis Iridis, die klinische Bezeichnung für Iris pathologischen Neoangiogenese4. Diese Erkrankungen zeigen die Fähigkeit der Erwachsenen Iris Angiogenese zu unterziehen. Bei Mäusen okuläre Gefäßsystem ist nach der Geburt unreif und Reifung nach der Geburt weiter. Diese Besonderheit der Entwicklung wird im Mausmodell der Sauerstoff-induzierte Retinopathie, ein Modell ausgenutzt, die den klinischen Zustand des Retinopathy der Frühreife5eng imitiert. Darüber hinaus Angiogenese und Entzündungen spielen eine Schlüsselrolle bei der Wundheilung Mechanismen6und Wundheilung selbst Angiogenese Modelle7zugeordnet wurde.

In dieser Studie beschreiben wir ein Modell der Iris Punktion-induzierte Neovaskularisation. In der Nähe die äußere Grenze des Limbus, induzieren die Iris Neovaskularisation durch das Auslösen der Wundheilungssystem vorderen Einstiche erfolgt. Durch die Transparenz der Hornhaut, Iris Gefäßsystem kann leicht in Vivo durch nicht-invasive Methoden analysiert. Punktierte Augen präsentieren eine Erhöhung des vaskulären Bettes in der Iris, die was einer Steigerung von Plasminogen aktivieren und Entzündungsmarker8zugeordnet wurde. Das vorgestellte Modell hat großes Potential als ein neues Instrument zur Angiogenese und screening-angiogenen Verbindungen zu studieren und ermöglicht direkte in Vivo Visualisierung der angiogenen Prozesse.

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Protokoll

BALB/c Maus Welpen beiderlei Geschlechts wurden gemäß der Erklärung für den Einsatz von Tieren in ophtalmologischen und Vision Research verwendet, und die Protokolle wurden von Stockholms Ausschuss für ethische Animal Research genehmigt. Mäuse waren untergebracht in Würfen, zusammen mit der stillenden Mutter mit 12 h-Tag/Nacht-Zyklus, freien Zugang zu Futter und Wasser, und täglich überwacht.

Hinweis: Für den chirurgischen Eingriff wurden Mäuse mit flüchtigen Isoflurane Narkose gehalten. Okuläre Salben sind bei okulären Eingriffen abgeraten, da diese Behandlungen und verwendeten Substanzen stören könnte. Bei Bedarf kann zur Vermeidung von trocken-Auge, ein Tropfen sterile normale Kochsalzlösung angewendet werden. Obwohl vorderen Punktionen zur Selbstheilung, wurde darauf im vorderen Punktionen geachtet, Sterilität mit chirurgischen Instrumenten. Postoperative Behandlung inklusive subkutan, Hydratation mit normalen Kochsalzlösung und Analgesie mit okulärer topische Verabreichung von Tetracaine Hydrochlorid. Die Welpen durften sternalen liegen auf ein Heizkissen wiederherstellen, bevor Sie an die stillende Mutter in einem sauberen Käfig zurück. Würfe wurden gehalten, mit der gleichen stillenden Mutter, Stress zu vermeiden.

(1) Anästhesie

  1. Bereiten Sie die Narkose Induktion Kammer Isoflurane Narkose zu verwalten und sicherstellen, dass eine kleine Maus Maske auch gekoppelt ist.
    Hinweis: Führen Sie alle Tierversuche in Übereinstimmung mit allen geltenden ethischen Genehmigungen.
  2. Vorausfüllen Sie Induktion Kammer mit 3-4 % flüchtige Isofluran in atmosphärischer Luft.
    Hinweis: Verschiedene betäubende Stoffe außer Isofluran können, nach ethischen Genehmigungen verwendet werden. Volatilere Anästhetikums Verfahren sollte auf einer belüfteten Bank oder Dunst Haube durchgeführt werden.
  3. Legen Sie eine postnatale (P) 12,5-Tag-alte BALB/c Maus Welpe in der Induktion-Kammer. Bestätigen Sie, dass das Anästhesie-Gerät bereit, Isofluran zur Induktion Kammer zu liefern.
    Hinweis: Maus Welpen sind zerbrechlich und am besten behandelt durch das Genick. Halten Sie die Welpen zusammen mit der stillenden Mutter, Stress zu vermeiden oder einen Wurf.
  4. Lassen Sie die Pup, vollständig betäubt werden.
  5. Sanft, abholen der Maus Welpe durch das Genick.
    Hinweis: Halten Sie die Induktion Kammer geschlossen an allen Zeiten für sicheren und stabilen Induktion.
  6. Übertragen Sie die Maus auf die Nager Maske. Achten Sie darauf, die Narkose Strömung aus der Induktion Kammer die Maske wechseln beim Bewegen der Maus.
  7. Führen Sie eine Zehe Prise Anästhesie zu bestätigen.

2. Verfahren nach chirurgischen Stereoskop Punktion

  1. Positionieren Sie den Mauszeiger im seitlichen liegen Stellung. Bestätigen Sie, dass die Maske gut aufgestellt ist, so ist die Maus Auge in das Blickfeld der Stereoskop.
  2. Drehen Sie sanft den Maus-Kopf, das Auge in Richtung das Stereoskop nach oben.
    Hinweis: Klare Fokussierung des Auges sollte unter das Stereoskop erreicht werden. Für die Positionierung, empfiehlt eine Vergrößerung von 16 X, während 40 X verwendet werden soll, um den chirurgischen Eingriff durchzuführen. Wenn ethische Genehmigungen es erlauben, kann trimmen die Spitze der Schnurrhaare erleichtern die Visualisierung des Auges.
  3. Ragen Sie mit kleinen binden Pinzette, sorgfältig die Pup Auge indem Abwärtsdruck auf die Augenlider dorsalen und ventralen für das Auge.
  4. Halten Sie eine sanfte, aber feste der Welpe Auge Deckel, mit kleinen Zangen.
    Hinweis: Es wird empfohlen, zur Durchführung des Auge-Vorsprungs und Deckel mit der nichtdominanten Hand halten, als die dominante Hand die Punktion durchführen sollte.
  5. Verwenden Sie das Stereoskop um die Hornhaut Limbus zu finden. Albino BALB/c Limbus kann leicht durch die kreisförmige vaskulären Plexus posterior der Hornhaut identifiziert werden.
  6. Führen Sie mit einer 0,25 mm Durchmesser (30 G) abgeschrägte Nadel eine kleinen vorderen Punktion, in der Nähe der hinteren limbisches maximal der Uvea. Verwenden Sie nur die Spitze der Nadel, und nicht mehr als die Hälfte die Abschrägung (entspricht 0,5 mm), Punktion der Uvea. Wenn richtig ausgeführt, die vorderen Stiche sind selbstdichtend, dennoch intraokulare Injektion Studie Stoffe kann durch die gleichen Einstichwunde verabreicht werden.
    Hinweis: Wenn mit Maus augenfällige Anatomie erfahren, wird die vorderen Punktion zwischen dem Ziliarkörper und Ora Serrata ausgeführt. Vorsicht ist geboten bei der Durchführung der vorderen Punktion zur Brechung der Linse zu vermeiden.
  7. Führen Sie die zweiten vorderen Punktion in der gegenüberliegenden Seite des Auges von der ersten Einstichstelle. Optimieren Sie die Entfernung und Position von den Pannen; Betrachten Sie 12 und 06:00 Einstiche mit 12:00 wird als dorsal wie möglich.
  8. Wiederholen Sie die vorderen Löcher alle vier Tage bis P24.5. Überwachen Sie vor jedem aufeinanderfolgenden vorderen Punktion Tier Status besonderes Augenmerk auf Anwesenheit von traumatische Katarakt aufgrund Objektiv Schäden während des vorderen Punktion oder offensichtliche verminderten Augeninnendruck. Ziel ist es für die Ausführung von wiederholten Einstiche an den gleichen Positionen als frühere Einstiche für optimale Effekte.

(3) nicht-invasive in Vivo Überwachung

  1. Betäuben Sie vor der Punktion oder Injektionen täglich experimentelle die Maus wie oben durchgeführt.
  2. Ragen Sie mit der Maus im seitlichen liegen Position sanft das Auge.
  3. Konzentrieren Sie sich auf Iris Gefäßsystem mit chirurgischen Stereoskop.
  4. Nehmen Sie ein Bild von der Iris Gefäßsystem mit einer Kamera ausgestattet, um die chirurgische Stereoskop.
    Hinweis: Obwohl nicht notwendig, induzierende Meiose Iris Fläche pro Tier zu normalisieren kann. Auswahl einen Meiose-induzierende Agent ethische Genehmigungen berücksichtigen. Sorgfältige Fokus des Gefäßsystems Iris werden Quantitative Analyse weiter erleichtern. Eine Größe von 40 X wird empfohlen.

4. postoperative Pflege

  1. BALB/c-Welpen aus der Nager Maske entfernen und sanft auf ein Heizkissen mit einer chirurgischen Matte Schichten übertragen.
  2. Ein Tropfen von 1 % Tetracaine Lösung auf durchlöcherten Augen anwenden.
    Hinweis: Andere schmerzstillenden Lösungen können, nach ethischen Genehmigungen verwendet werden.
  3. Das Tier mit einer subkutanen Injektion von 200 µL sterile normale Kochsalzlösung-Hydrat.
  4. Der Welpe die stillende Mutter in einem sauberen Maus Käfig zurück.
  5. Die Recovery-Prozess zu überwachen. Der Welpe sollte in der Lage, deambulate und zurück zu dem Wurf.

5. Auge Enukleation

  1. Das Tier durch zervikale Dislokation einschläfern. Führen Sie Enukleation und Dissektion unter ein Stereoskop zur besseren Visualisierung des Verfahrens.
    Hinweis: Verschiedene Euthanasie Verfahren können verwendet werden. Es wird empfohlen, sich strikt an ethischen Genehmigungen.
  2. Auseinanderziehen der Augenlider, die Exposition des Auges zu verbessern.
  3. Machen Sie einen kleinen Schnitt (ca. 0,5 cm) in der Nähe der Augenwinkel die Augenlider mit gebogenen Bonn Auge Schere.
  4. Mithilfe des exponierten Periorbitalregion Raumes Mikro binden Zange hinter (unter) der ganzen Welt im Orbit einfügen.
  5. Schnappen Sie sich das Gewebe rund um das Auge und ziehen Sie es vorsichtig nach oben. Vermeiden Sie festhalten an den Augapfel zu, verwenden Sie das umliegende Gewebe näher an die Augenhöhle.
  6. Legen Sie die gebogene Bonn Auge Schere hinter des Augapfels im Orbit.
  7. Geschnitten Sie durch das umliegende Gewebe, bis das Auge aus der Steckdose freigegeben wird.
    Hinweis: Diese Dissektion Technik unterhält Auge Anatomie und anschließende Analyse profitiert.
  8. Fahren Sie mit der Entfernung des überflüssigen Gewebes aus dem Auge. Das Entfernen des überflüssigen Gewebes kann nach der Fixierung, durchgeführt werden, falls gewünscht.
    Hinweis: BALB/c Mäuse Melanin mangelhaft, daher sind dagegen erhöhen wird ein dunkler Hintergrund empfohlen, Dissektion zu erleichtern.
  9. Kurz spülen das gesamte Auge in einer Petrischale mit sterilem Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) gefüllt.
  10. Übertragen Sie das Auge auf eine 2 mL-Röhrchen mit 1,5 mL 4 % gepuffert Formalin-Lösung.
  11. Befestigen Sie das Auge für 6 h bei Raumtemperatur.
    Hinweis: Fixierung verleiht die Steifigkeit des Gewebes und erleichtert die Dissektion der Iris. Zeit sollte getestet und für unterschiedliche Anwendungen angepasst werden.

6. Iris Dissektion Verfahren unter Stereoskop

  1. Entfernen Sie die Fixativ Lösung aus dem Rohr mit einer 1,5 mL Kunststoff Pasteurpipette (oder ähnlich), und spülen Sie das Auge dreimal mit frischen PBS.
  2. Legen Sie das feste Auge in eine trockene Oberfläche (Dissektion Stand) mit der Vorderkammer nach oben.
  3. Führen Sie mit einer abgeschrägten 30 G Nadel nach dem Limbus Einstiegspunkt.
  4. Sie den vorderen Augenabschnitt mit kleinen binden Zange halten, legen Sie ein Tipp Clayman-Vannas geraden Schere in die zuvor entstandene Öffnung.
    Hinweis: Es wird empfohlen, die Zange mit der nichtdominanten Hand, und die Schere mit der dominanten zu kontrollieren.
  5. Beim Drehen des Auges mit der Kopplung Zange schneiden um den Limbus, die hintere Segment des Auges zu entfernen.
    Hinweis: Teilweise Kürzungen durchführen wird damit die innere Spitze der Schere weiter in das Gewebe und erheblich erleichtert den Prozess.
  6. Positionieren Sie den vorderen Augenabschnitt nach unten, Freilegung der Linse.
  7. Nehmen Sie das Objektiv vorsichtig mit kleinen Zangen greifen und nach oben ziehen.
    Hinweis: Eine abgeschrägte Nadel kann zu punktieren und ziehen die Linse verwendet werden.
  8. Positionieren Sie den vorderen Augenabschnitt mit der Hornhaut nach unten und der Schnitt senkrecht auf das Sichtfeld.
  9. Greifen Sie sanft das Gewebe nach der Ziliarkörper mit der kleinen binden Zange.
  10. Fahren Sie mit der geraden Schere Clayman-Vannas mit trim nur anterior der Ziliarkörper die trabekuläre Geflecht zu entfernen und die Iris zu isolieren. Bestätigen Sie, dass die trabekuläre Geflecht entfernt ist; die Iris sollte innerhalb der Hornhaut bewegen.
  11. Übertragen Sie die vordere Augenmuschel vorsichtig mit der kleinen binden Zange, hält die Hornhaut zu einer 96-Well-Platte mit 200 µL PBS
  12. Halten Sie die Hornhaut in den Brunnen und sezieren Sie die Iris durch Spülen mit PBS mit einer Pipette zu.
    Hinweis: Wenn der Iris bleibt Anhänger an der Hornhaut, einige trabekuläre Geflecht Gegenwart und die Abschrägung einer 30 G-Nadel könnte einsetzbar, verdrängen die Iris zu helfen.
  13. Entfernen der Hornhaut von 96-Well mit der kleinen binden Zange, und halten die isolierte Iris in den Brunnen zur weiteren Analyse.
  14. Freischwebende Iris Proben bei 4 ° c lagern
    Hinweis: Trotz fixiert, wird langfristige Lagerung der Iris frei schwebenden Proben nicht empfohlen.

7. mögliche experimentelle auslesen

  1. Um die Blutgefäße in die seziert Iris sichtbar zu machen, verwenden Sie frei schwebenden ganze-Mount immunhistochemische Färbung Methoden für Marker wie Thrombozyten Endothelzellen Adhäsionsmolekül (PECAM)-1 oder Isolectin B4. Alternativ können Sie Ganzkörper-Perfusion mit vaskulären Färbung, wie Leuchtstofflampen beschriftet hochmolekularen Dextrans.
  2. Verwenden Sie in Vivo nicht-invasive Bilder in Silico Wohnung-Montage und volle Iris Gefäßsystem mit entsprechenden Bildbearbeitungssoftware zu quantifizieren.
    Hinweis: Gefäßsystem kann quantifiziert werden, sowohl in Vivo und in Vitro, mit Densitometrie oder Gefäßsystem Analyse Software9.
  3. Verarbeiten des ganze Augapfels für Nukleinsäuren und Protein-Extraktion, gefolgt von PCR oder Immunoblotting Methoden, molekulare Analyse der punktierten Augen durchführen.
    Hinweis: Molekulare Analyse der Gewebe erfolgt am besten mit nicht feste Gewebe, aber Dissektion nicht feste Iris ist sehr anspruchsvoll und die Nutzung des gesamten Auges hat statistisch signifikante Ergebnisse in früheren Studien8gerendert.

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Ergebnisse

Albino BALB/c Maus Welpen am P12.5 vorderen Löcher, jeden vierten Tag wiederholt ausgesetzt waren (experimentelle Tag 0, 4, 8, 12), bis P24.5. Am P27.5 Mäuse wurden eingeschläfert und Iris sorgfältig seziert (experimentelle 15.Tag). Maus Augen wurden mit einer Kamera angeschlossen an eine chirurgische Stereoskop vor jeder Punktion Serie in experimentellen täglich fotografiert, nicht-invasive Beurteilung der Iris vaskuläre Antwort zu bewerten. Vorderen Einstiche induzieren eine vaskuläre A...

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Diskussion

Dieses Protokoll ist eine neuartige Methode zur Induktion von Iris vaskuläre Reaktion durch vorderen Punktion vorgestellt. Die Punktion Wunde heilende Mechanismen auslöst und fördert die vaskuläre Reaktionen in der Iris10,11. Dies ist im Einvernehmen mit okulärer Pathologien wie PDR und NVG, wo verschärfter angiogenen Antworten von der Netzhaut im hinteren Bereich des Auges in den klinischen Zustand des Rubeosis Iridis, eine verstärkte Vaskularisierung der Iris

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Die Autoren danken Linnea Tankred und Diana Rydholm für Tierhaltung.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Bonn AugenschereBausch & Lomb23060
Clayman-Vannas gebogene SchereBausch & LombE3383 C
Clayman-Vannas gerade SchereBausch & LombE3383 S
Objektivadapter für KameraHandgefertigtN/AOder jedes System, das die Anpassung einer Kamera an das Mikroskop ermöglicht
Heizkissen 100-110 WattNicht zutreffendN/AErhältlich in Tier- und Tiergeschäften
Injektionsnase 30g abgeschrägte NadelKDM GmBH Deutschland911914
Iphone 4SAppleNicht anwendbarOder andere hochauflösende Bildaufnahmegeräte
IsofluranBaxterKDG 9623
McPherson BindezangeBausch & LombE1815 S
Mikro-BindezangeBausch & Lomb63140
Minims TetracainhydrochloridBausch & LombN/A1 % (w/v) Augentropfen
Neutralgepuffertes FormalinBioreagens0018-40
Normale KochsalzlösungFresenius Kabi2103520,9 % (w/v) NaCl in injizierbarem Wasser
Phosphatgepufferte KochsalzlösungThermoFisher Scientific10010023Ausgewogen und gepuffert PBS pH 7,4
Petrischale 10 cmStarstedt83.3902
Petrischale 3 cmStarstedt83.3900
Safe Seal Tube 2,0 mLStarstedt72.685.200Oder beliebige Eppendorf Style Röhrchen
TC plate 96-wellStarstedt83.3924
Transferpipette 3,5 mLStarstedt86.1171Oder eine andere Pasteur Pipette
Style Univentor 400 AnästhesieeinheitUniventor LimitedN/AOder gleichwertiger Durchflussregler mit Induktionskammer und Maske für flüchtige Anästhesie
Wild M650 OperationsmikroskopWild HeerbruggN/AOder anderes chirurgisches oder vergrößerndes Stereoskop

Referenzen

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Punktionsinduziertes Modelluveale PunktionSektion des M useaugesAnalyse der Irisgef enichtinvasive In vivo Bildgebungalbino BALB c M useImmunhistochemie PECAM1Identifikation des HornhautlimbusIsolation des vorderen Augenabschnitts

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