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Methodenartikel

Vollständig-hängen konfokalen Mikroskopie für Erwachsene Ohr Haut: ein Modellsystem, Neuro-vaskuläre Verzweigung Morphogenese und Immunzelle Verteilung zu studieren

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DOI:

10.3791/57406

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29. März 2018

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1Laboratory of Stem Cell and Neuro-Vascular Biology, Genetics and Developmental Biology Center, National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health, 2Earle A. Chiles Research Institute, Robert W. Franz Cancer Center, Providence Portland Medical Center

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein hohe Auflösung vollständig-hängen bildgebende Verfahren in der gesamten erwachsenen Maus Ohr Haut, die was uns ermöglicht, verzweigte Morphogenese und Strukturierung der peripheren Nerven und Blutgefäße sowie Immunzelle Verteilung zu visualisieren.

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll einer ganzen-Mount Erwachsene Ohr Haut imaging Technik um umfassende dreidimensionale Neuro-vaskuläre Verzweigung Morphogenese und Strukturierung sowie Immunzelle Verteilung auf zellulärer Ebene zu untersuchen. Die Analyse der peripheren Nerven und Blutgefäße anatomischen Strukturen in adulten Geweben bietet einige Einblicke in das Verständnis der funktionellen Neuro-vaskuläre Verkabelung und Neuro-vaskuläre Degeneration unter pathologischen Bedingungen wie z. B. die Wundheilung. Als sehr informativ Modellsystem haben wir unsere Studien auf Erwachsene Ohr Haut, konzentriert, die bei Dissektion gut zugänglich ist. Unsere einfache und reproduzierbare Protokoll sieht eine genaue Darstellung der zellulären Komponenten in der gesamten Haut, z. B. periphere Nerven (sensorische Axone, sympathischen Axone und Schwann-Zellen), Blutgefäße (Endothelzellen und vaskulären glatten Muskelzellen ), und Entzündungszellen. Wir glauben, dass dieses Protokoll die Möglichkeit, morphologischen Anomalien in der peripheren Nerven und Blutgefäße sowie die Entzündung in der Haut von Erwachsenen Ohr unter verschiedenen pathologischen Bedingungen untersuchen ebnen wird.

Einleitung

Haut besteht aus drei Schichten: der Epidermis, Dermis und Hypodermis. Es wurde als Modellsystem verwendet, um Stammzellen Wartung, Differenzierung und Morphogenese in Entwicklung als auch die Regeneration, Tumorgenese und Entzündung in der Erwachsenenbildung zu studieren. Haut ist reich durchblutet und innerviert, so dass die Entwicklung des peripheren Nervensystems und Gefäßsystem gut aufeinander abgestimmt ist.

Eine ganze-Mount embryonalen Haut bildgebendes Verfahren mit mehreren Kennzeichnung auf intakten peripheren Nerven und Blutgefäße einschließlich ihrer zellulären Komponenten1,2,3, zu studieren haben wir bereits gezeigt. 4: sensorische Axone, sympathischen Axone, Schwann-Zellen in den Nerven, Endothelzellen, Perizyten und vaskulären glatten Muskelzellen (VSMCs) in den Blutgefäßen. Während die Angiogenese eine primäre Kapillarnetzes erfährt intensive vaskuläre remodeling und entwickelt sich zu einem hierarchischen vaskulären verzweigten Netzwerk. In den Entwicklungsländern Lederhaut/Unterhaut Arterien neben peripheren sensorischen Nerven und Adern verzweigen dann neben den Arterien bilden. Nachdem die hierarchische vaskuläre Netzwerk gründlich mit VSMCs bedeckt ist, sympathische Nerven erstrecken sich entlang und innervieren Großrohre Blutgefäße1,5,6. Trotz der Bedeutung in die enge Beziehung zwischen der Nerven- und Gefäßsystem Systeme entwickeln wurde eine wichtige Frage zu befassen, was passiert mit der Neuro-vaskuläre Netzwerke in verschiedenen pathologischen Situationen bei Erwachsenen. Eine dreidimensionale hochauflösende Bildgebung ist erforderlich, die Pathogenese, zusammen mit anatomisch erkennbaren Verzweigung Morphogenese und Musterung zu schätzen wissen.

Neuronale und vaskuläre Morphogenese in erwachsenen Maus Haut wird häufig durch Gewebe Abschnitt Färbung analysiert. Andere Studien haben ganze-Mount Bildgebung der Haut verwendet, um die peripheren Nerven und Blutgefäße, neben Arrector Pili Muskeln7,8,9, Haarfollikel und Talgdrüsen zu visualisieren. Allerdings hat die Dicke der Erwachsenen Haut, die Haut über seine gesamte Tiefe zu analysieren erschwert.

In der vorliegenden Studie entwickelten wir eine neuartige hochauflösende ganze-Mount Imaging Erwachsene Ohr Haut, diese Herausforderungen zu meistern. Ohr Haut ist über seine gesamte Tiefe für die Dissektion und anschließende ganze-Mount-Bildgebung der Haut leicht zugänglich. So ist es eine einfache und hoch reproduzierbare Methode, die angewendet werden kann, um dreidimensionale Architektur der peripheren Nerven- und Gefäßsystem Systeme in der Haut, mit umfassender Quantifizierung Messungen zu vergleichen. Wir zeigten, dass die Ausrichtung der peripheren sensorischen und sympathischen Nerven mit großem Durchmesser Blutgefäße in der Erwachsenen Haut erhalten bleibt. Das Ziel dieses Protokolls ist, verzweigte Morphogenese und die Strukturierung der peripheren Nerven und Blutgefäße sowie die Immunzelle Verteilung auf zellulärer Ebene in erwachsenen Maus-Modellen in verschiedenen Erkrankungen wie Entzündungen zu visualisieren und Regeneration.

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Protokoll

Alle Versuche in diesem Abschnitt wurden unter Zustimmung vom National Heart, Lung, Blood Institute (NHLBI) Animal Care und Use Committee durchgeführt.

1. erwachsener Mäuse Ohr Haut Kollektion

  1. Einschläfern Sie erwachsener Mäuse durch Kohlendioxid (CO2) Exposition in einer geschlossenen Kammer und bestätigen Sie die Euthanasie durch zervikale Dislokation.
    Hinweis: Das Experiment folgt der National Institutes of Health (NIH)-Leitfaden für die Euthanasie-Methode.
  2. Sezieren Sie das Ohr von der Basis zu und platzieren Sie es in ein 35 x 10 mm2 Petrischale mit 2 mL von Hank es ausgewogen Salz Lösung (HBSS). Kurz schneiden Sie Haare mit einer Schere.
  3. Schälen Sie die hinteren Haut und vorderen Haut entfernt von den dazwischen liegenden Knorpel vorsichtig.
    Hinweis: Knorpel legt auf die vorderen Haut.
  4. Transfer den hinteren und vorderen Haut separat auf einem gut 24 Teller mit 1 mL der eiskalte frische 4 % Paraformaldehyd (PFA) in Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) pro Bohrloch. Glätten Sie die hintere und vordere Haut in den 4 % PFA.
  5. Befestigen Sie die hintere und vordere Haut mit Knorpel bei 4 ° C für 1 h.
  6. Waschen Sie die hintere und vordere Haut 3 Mal für 5 min in 1 mL PBS mit schonendes Mischen auf einem Mischer bei Raumtemperatur.
  7. Die hintere und vordere Haut mit Knorpel an der Unterseite eines 35 x 10 mm2 Petrischale zu übertragen. Schneiden Sie den Basisbereich, die gefaltet und Fettgewebe und Bindegewebe. Der Knorpel vom vorderen Haut mit feinen gebogenen Pinzette abziehen.
  8. Entfernen Sie vorsichtig die Haare, Fettgewebe und Bindegewebe von der Innenseite der hinteren Haut mit feinen gebogenen Pinzette. Halten Sie die Haut nass mit PBS.

2. gesamte-Mount immunhistochemische Färbung der Maus Ohr Haut

Hinweis: Alle Experimente in den folgenden Abschnitten wurden entsprechend der NIH Labor Sicherheits-Richtlinien durchgeführt.

  1. Bereiten Sie die blockierenden Puffer. Filter 10 % Hitze inaktiviert Ziegenserum (HIGS) mit PBS-Puffer mit 0,2 % Triton x-100 (TX-100) blockierende Puffer verdünnt, oder 10 % Esel Serum (DS) verdünnt mit PBS-Puffer mit 0,2 % TX-100 blockierende Puffer, mit einer 0,45 µm-Filter-Einheit.
  2. Übertragen den hinteren und vorderen Haut auf einem 24 Teller gut mit 1 mL 10 % HIGS blockierende Puffer oder 10 % DS blockierende Puffer pro Bohrloch. Inkubieren Sie die Haut für 30 min mit schonendes Mischen auf einem Mischer bei Raumtemperatur.
  3. Bereiten Sie die primären Antikörper-Lösung durch die primären Antikörper (Table of Materials) in blocking-Puffer verdünnen (entweder 10 % HIGS oder 10 % DS).
    Hinweis: Ganze Mout immunhistochemische Analyse der Erwachsenen Ohr Haut mit Antikörper gegen Pan-neuronale Marker Neuron-spezifische Klasse III β-Tubulin (Tuj1, Kaninchen polyklonalen IgG oder Maus Monocloncal IgG2a, 1: 500 Verdünnung auf die letztendliche Konzentration von 2 µg/mL), Pan-Endothelzellen Marker Thrombozyten Endothelzellen Adhäsionsmolekül 1 (PECAM-1, Hamster monoklonaler IgG, Verdünnung 1: 300 an die Endkonzentration von 3,3 µg/mL), Myelinscheide Marker Myelin basic Protein (MBP, Kaninchen polyklonalen IgG, Verdünnung 1: 200 bei der Endkonzentration von 5 µg/mL) und entzündlichen myeloische Zellmarkierung CD11b (Ratte monoklonalen IgG2b, 01:50 Verdünnung auf die Endkonzentration von 20 µg/mL) wurde in Abbildung 1 und Abbildung 2gezeigt. Die Haut wurde mit Cy3 konjugierten Antikörper für vaskuläre Glattmuskel Zelle Marker α Glattmuskel Aktin (αSMA) sowie sekundäre Antikörper (2.6) inkubiert. Die primäre Antikörper, die von uns getestet wurden in Tabelle Materialienaufgeführt. Gleichzeitig können mehrere primäre Antikörper abgeleitet aus verschiedenen Arten gemischt werden.
  4. Übertragen Sie die hintere und vordere Haut auf neuen Brunnen mit 150 µL Primärantikörper Lösung. Inkubieren Sie die Haut mit schonendes Mischen auf einem Mischer bei 4 ° C über Nacht.
  5. Am nächsten Tag die hintere und vordere Haut auf neue Brunnen in der 24-well-Platte übertragen oder Aspirieren des blockierenden Puffers, primäre Antikörper enthält. Fügen Sie 1 mL oder 2 %, die HIGS verdünnt in PBS mit TX-100 waschen Puffer 0,2 % oder 2 % DS mit PBS-Puffer mit 0,2 % TX-100 waschen Puffer verdünnt. Waschen Sie die Haut mit 3 Änderungen des Puffers waschen alle 15 min mit schonendes Mischen auf einem Mischer bei Raumtemperatur.
  6. Bereiten Sie die sekundäre Antikörper-Lösung (Table of Materials). Sekundäre Antikörper in der blocking-Puffer verdünnen (entweder 10 % HIGS oder 10 % DS) und Filter der blockierende Puffer mit sekundären Antikörper durch einen 0,22 µm Polyvinylidene Difluoride (PVDF) Spritze Membranfilter an eine 1 mL Spritze angeschlossen.
    Hinweis: Alexa 488 oder 633 konjugiert Ziege Anti-Kaninchen IgG (H + L) oder Maus IgG2a für Tuj1, Alexa 647 konjugiert Ziege Anti-Hamster IgG (H + L) für PECAM-1, Alexa 488 konjugiert Ziege Anti-Kaninchen IgG (H + L) für MBP, und Alexa 594 konjugiert Ratte IgG (H + L) für CD11b dienten mit 1: 250 Verdünnung auf die Endkonzentration von 8 µg/mL. Die Haut wurde mit Cy3 konjugiert αSMA Antikörper (Verdünnung 1: 500 an die Endkonzentration von 2 bis 3 µg/mL) in Kombination mit dieser Sekundärantikörper inkubiert.
  7. Zentrifugieren Sie die Lösung bei 13.000 x g für 10 min, aggregierte Teilchen der sekundären Antikörper aus dem blockierenden Puffer zu entfernen.
    Hinweis: Verschiedene fluoreszierende konjugierten Sekundärantikörper abgeleitet aus verschiedenen Arten können gleichzeitig gemischt werden.
  8. Übertragen Sie die hintere und vordere Haut auf gut mit 150 µL der Sekundärantikörper Lösung. Wickeln Sie die 24-well-Platte in Alu-Folie zu vermeiden, Licht und die Haut für 1 h mit schonendes Mischen auf einem Mischer bei Raumtemperatur inkubieren.
  9. Übertragen Sie die hintere und vordere Haut auf neue Brunnen in der 24-well-Platte oder aspirieren Sie die sekundäre Antikörper-Lösung vollständig durch pipettieren. Fügen Sie 1 mL 2 % HIGS waschen Puffer oder 2 % DS waschen Puffer.
  10. Die 24-well-Platte in Alufolie wickeln und waschen mit 3 Änderungen des Puffers waschen alle 15 min mit schonendes Mischen auf einem Mischer bei Raumtemperatur.

3. Montage der Ohr Haut auf Folie

  1. Legen Sie die Haut an der Unterseite eines 35 x 10 mm2 Petrischale. Entfernen Sie vorsichtig die Haare, Fettgewebe, Bindegewebe, Stäube und Fasern aus dem Inneren der Haut mit feinen gebogenen Pinzette unter Stereomikroskop mit geringer Beleuchtung, um umfangreiche Foto bleichen zu minimieren. Halten Sie die Haut nass mit PBS.
  2. Übertragen Sie die Haut auf eine selbstklebende Mikroskop-Objektträger mit Pinzette. Legen Sie die hintere und vordere Haut mit der Innenseite nach oben auf der Folie. Glätten Sie die Haut mit einer Pinzette.
  3. Montieren Sie die Haut in eine flüssige Anti-Fade Eindeckmittel zu vermeiden Immunofluoreszenz und fluoreszierende Signale zu erhalten. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen im oder rund um die Haut sind.
  4. Abdecken mit Deckglas auf der Hautproben sorgfältig und Lagern montiert Haut Probe Folien in der dunklen Nacht bei Raumtemperatur, damit sich die Montage Medien fest bekommen. Das Deckglas auf die Folie mit Nagellack versiegeln und bei 4 ° C für die Langzeitspeicherung zu speichern.

4. der konfokalen Mikroskopie

  1. Richten Sie entsprechende Laser für Fluorophore. Ein confocal Mikroskop mit drei Laserquellen (Argon 488 nm, DPSS 561 nm und HeNe 633 nm) wird in diesem Experiment verwendet.
  2. Verwenden Sie das sequentieller Scan-Tool, das welches gleichzeitig Triple-gefärbten Proben erregt zu vermeiden und reduzieren Überschneidungen.
    Hinweis: Bilder werden in einer sequenziellen Weise mit sequentieller Scan-Modus aufgenommen werden.
  3. Bild unter einem 10 X-Objektiv. Verwenden Sie die Kachel-Scan-Tool, um das ganze Ohr Haut zu erfassen. Z-Stapel und stellen Sie sicher, dass die Z-Position die gesamte Dicke der Ohr Haut deckt.

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Ergebnisse

Erwachsenen Maus posterior Ohr (Abbildung 1A) und vorderen Ohr Haut (Abbildung 1 b) wurden Immunostained mit Antikörpern gegen αSMA (rot), Tuj1 (grün), und PECAM-1 (blau). Hinteren Haut war Immunostained, Neuro-immun-Verteilung über Antikörper gegen CD11b (rot) und MBP (grün), zusammen mit Tuj1 (blau) (Abbildung 2A) zu studieren. Vertrieb von CD11b+ Entzündungszellen, einschließlich Makrop...

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Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt die gesamte-Mount Immunonohistochemical Bildgebung Erwachsene Ohr Haut für die Analyse von Neuro-vaskuläre Strukturen und Immunzelle Verteilung. Wir glauben, dass diese Methode hat zahlreiche experimentelle Vorteile für Forscher, verzweigte Morphogenese und die Musterung der peripheren Nerven und Blutgefäße sowie dreidimensionale Verteilung der Haut-Komponenten einschließlich Immunzellen und Haare zu studieren Follikel. Die Ergebnisse der Bildgebung können mit imaging Software für weitere Quan...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Wir danken K. Gill für die Labor-Management und technische Unterstützung, J. Hawkins und das Personal des National Institute of Health (NIH) 50 Tierhaus für die Unterstützung bei der Maus Pflege und R. Reed und F. Baldrey für die Amtshilfe. Vielen Dank auch an S. Motegi und M. Udey für ihr Ohr Haut Dissektion Protokoll, N. Burns für redaktionelle Hilfe und Mitglieder von Labor Stem Cell und Neuro-vaskuläre Biologie für technische Hilfe und nachdenkliche Diskussion. T. Yamazaki wurde von der Japan Society für die Promotion of Science (JSPS) NIH-KAITOKU unterstützt. Diese Arbeit wurde von den intramuralen Forschungsprogramm von der National Heart, Lung and Blood Institute (HL005702-11, Y.M) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
10 x Phosphatgepufferte KochsalzlösungKD MedicalRGE-3210PBS, ohne Ca2+/Mg2+
Hank' s Balanced Salt SolutionGibco14025-092HBSS, mit Ca2+/Mg2+
16% ParaformaldehydElektronenmikroskopieSciences 15710PFA, Fixiermittel, verdünnt in PBS
Triton X-100SigmaX100Waschmittel
Normales ZiegenserumGibco16210064Bestandteil des Blockierungs-/Waschpuffers
Normal EselsserumJackson Immuno research017-000-121Bestandteil des Blockierungs-/Waschpuffers
Gebogene feine PinzetteDumontRS-5047
Gebogene PinzetteIntegra Miltex VantageV918-782, V918-784
Filtereinheit 0,45 mmThermo Scientific157-0045Zur Filtration
1 mL SpritzeCoviden8881501400Für Filtration
Spritzenfilter Einheit 0,22 mmMillex-GVSLGVR04NLZur Filtration
ProLong GoldThermo ScientificP36934Anti-Fade-Eindeckmedium
NagellackElektronenmikroskopie Sciences72180Zum Abdichten
PräpariermikroskopLeicaMZ95
KonfokalmikroskopLeicaTCS SP5
Photoshop CC 2017AdobeGraphics Editor-Software
Illustrator CC 2017AdobeGraphics Editor-Software
Image JNIHBildverarbeitungssoftware
Anti-PECAM-1 (CD31) AntikörperMilliporeMAB1398ZHamster IgG, vaskulärer Endothelzellmarker, 1:300
Anti-PECAM-1 (CD31) AntikörperBD Pharmingen553369Ratte IgG2a kappa, vaskulärer Endothelzellmarker, 1:300
Anti-αSMA Antikörper, konjugiert mit cy-3SigmaC6198Maus IgG2a, vaskulärer Marker glatter Muskelzelle, 1:500
Anti-EphB1 AntikörperSanta Cruzsc-9319Ziege polyklonaler, venöser Endothelzellmarker, 1:100
Anti-Neuronen-spezifisches Klasse III β-Tubulin (Tuj1)AbcamAB18207Tuj1, polyklonales Kaninchen-IgG, panaxonaler Marker, 1:500
Anti-Tuj1-AntikörperCovanceMMS-435PMaus IgG2a, panaxonaler Marker, 1:500
Anti-MBP-AntikörperAbcamAB40390Kaninchen polyklonales IgG, Myelinisierungsmarker, 1:200
Anti-Tyrosin-Hydroxylase-AntikörperChemiconAB152Kaninchen polyklonaler, sympathischer Neuronenmarker, 1:500
Anti-Peripherin-AntikörperChemiconAB1530Kaninchen polyklonal, peripherer Neuronenmarker, 1:1000
Anti-CD11b-AntikörperBio-RadMCA74GRatte IgG2b, Entzündungszellmarker (Makrophagen), 1:50
Anti-CD45-AntikörperThermo Fisher Scientific14-0451-85Ratten-IgG2b Kappa, pan-hämatopoetischer Zellmarker, 1:500
Anti-CD3-AntikörperBio-RadMCA1477TRatte IgG1, Immunzellmarker, 1:100
Anti-CD45R (B220) AntikörperThermo Fisher Scientific14-0452Ratte IgG2a Kappa, Marker für Entzündungszellen, 1:200
Anti-GFP AntikörperThermo Fisher ScientificA11122Kaninchen polyklonal, 1:300
Anti-GFP AntikörperAbcamAb13970Huhn polyklonal, 1:500
Anti-β-gal AntikörperCappel55976Kaninchen polyklonal, 1:5000
Anti-RFP AntikörperAbcamAb62341Kaninchen polyklonal, 1:300
Kaninchen Anti-Kaninchen IgG (H+L) Alexa 488Thermo Fisher ScientificA11034Kaninchen polyklonaler Sekundärantikörper, 1:250
Kaninchen Anti-Hamster IgG (H+L) Alexa 647Jackson Immuno research127-605-160Hamster polyklonaler Sekundärantikörper, 1:250
Ziegen-Anti-Ratten-IgG (H+L) Alexa 594Jackson Immuno Research112-585-167Polyklonaler Sekundärantikörper der Ratte, 1:250
Ziegen-Anti-Maus-IgG2a Alexa 633Thermo Fisher ScientificA21136Maus-IgG2a-Sekundärantikörper, 1:250

Referenzen

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Nachdrucke und Genehmigungen

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