Hier beschreiben wir ein hohe Auflösung vollständig-hängen bildgebende Verfahren in der gesamten erwachsenen Maus Ohr Haut, die was uns ermöglicht, verzweigte Morphogenese und Strukturierung der peripheren Nerven und Blutgefäße sowie Immunzelle Verteilung zu visualisieren.
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Methodenartikel
Vollständig-hängen konfokalen Mikroskopie für Erwachsene Ohr Haut: ein Modellsystem, Neuro-vaskuläre Verzweigung Morphogenese und Immunzelle Verteilung zu studieren
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll einer ganzen-Mount Erwachsene Ohr Haut imaging Technik um umfassende dreidimensionale Neuro-vaskuläre Verzweigung Morphogenese und Strukturierung sowie Immunzelle Verteilung auf zellulärer Ebene zu untersuchen. Die Analyse der peripheren Nerven und Blutgefäße anatomischen Strukturen in adulten Geweben bietet einige Einblicke in das Verständnis der funktionellen Neuro-vaskuläre Verkabelung und Neuro-vaskuläre Degeneration unter pathologischen Bedingungen wie z. B. die Wundheilung. Als sehr informativ Modellsystem haben wir unsere Studien auf Erwachsene Ohr Haut, konzentriert, die bei Dissektion gut zugänglich ist. Unsere einfache und reproduzierbare Protokoll sieht eine genaue Darstellung der zellulären Komponenten in der gesamten Haut, z. B. periphere Nerven (sensorische Axone, sympathischen Axone und Schwann-Zellen), Blutgefäße (Endothelzellen und vaskulären glatten Muskelzellen ), und Entzündungszellen. Wir glauben, dass dieses Protokoll die Möglichkeit, morphologischen Anomalien in der peripheren Nerven und Blutgefäße sowie die Entzündung in der Haut von Erwachsenen Ohr unter verschiedenen pathologischen Bedingungen untersuchen ebnen wird.
Einleitung
Haut besteht aus drei Schichten: der Epidermis, Dermis und Hypodermis. Es wurde als Modellsystem verwendet, um Stammzellen Wartung, Differenzierung und Morphogenese in Entwicklung als auch die Regeneration, Tumorgenese und Entzündung in der Erwachsenenbildung zu studieren. Haut ist reich durchblutet und innerviert, so dass die Entwicklung des peripheren Nervensystems und Gefäßsystem gut aufeinander abgestimmt ist.
Eine ganze-Mount embryonalen Haut bildgebendes Verfahren mit mehreren Kennzeichnung auf intakten peripheren Nerven und Blutgefäße einschließlich ihrer zellulären Komponenten1,2<....
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Protokoll
Alle Versuche in diesem Abschnitt wurden unter Zustimmung vom National Heart, Lung, Blood Institute (NHLBI) Animal Care und Use Committee durchgeführt.
1. erwachsener Mäuse Ohr Haut Kollektion
- Einschläfern Sie erwachsener Mäuse durch Kohlendioxid (CO2) Exposition in einer geschlossenen Kammer und bestätigen Sie die Euthanasie durch zervikale Dislokation.
Hinweis: Das Experiment folgt der National Institutes of Health (NIH)-Leitfaden für die Euthanasie-Methode. - Sezieren Sie das Ohr von der Basis zu und platzieren Sie es in ein 35 x 10 mm2 Petrischale mit 2 mL von Hank es ausgewogen Salz Lösung (HB....
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Ergebnisse
Erwachsenen Maus posterior Ohr (Abbildung 1A) und vorderen Ohr Haut (Abbildung 1 b) wurden Immunostained mit Antikörpern gegen αSMA (rot), Tuj1 (grün), und PECAM-1 (blau). Hinteren Haut war Immunostained, Neuro-immun-Verteilung über Antikörper gegen CD11b (rot) und MBP (grün), zusammen mit Tuj1 (blau) (Abbildung 2A) zu studieren. Vertrieb von CD11b+ Entzündungszellen, einschließlich Makrop.......
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Diskussion
Dieses Protokoll beschreibt die gesamte-Mount Immunonohistochemical Bildgebung Erwachsene Ohr Haut für die Analyse von Neuro-vaskuläre Strukturen und Immunzelle Verteilung. Wir glauben, dass diese Methode hat zahlreiche experimentelle Vorteile für Forscher, verzweigte Morphogenese und die Musterung der peripheren Nerven und Blutgefäße sowie dreidimensionale Verteilung der Haut-Komponenten einschließlich Immunzellen und Haare zu studieren Follikel. Die Ergebnisse der Bildgebung können mit imaging Software für weitere Quan.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Wir danken K. Gill für die Labor-Management und technische Unterstützung, J. Hawkins und das Personal des National Institute of Health (NIH) 50 Tierhaus für die Unterstützung bei der Maus Pflege und R. Reed und F. Baldrey für die Amtshilfe. Vielen Dank auch an S. Motegi und M. Udey für ihr Ohr Haut Dissektion Protokoll, N. Burns für redaktionelle Hilfe und Mitglieder von Labor Stem Cell und Neuro-vaskuläre Biologie für technische Hilfe und nachdenkliche Diskussion. T. Yamazaki wurde von der Japan Society für die Promotion of Science (JSPS) NIH-KAITOKU unterstützt. Diese Arbeit wurde von den intramuralen Forschungsprogramm von der National Heart, Lung and Blood Institu....
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 10 x Phosphatgepufferte Kochsalzlösung | KD Medical | RGE-3210 | PBS, ohne Ca2+/Mg2+ |
| Hank' s Balanced Salt Solution | Gibco | 14025-092 | HBSS, mit Ca2+/Mg2+ |
| 16% Paraformaldehyd | Elektronenmikroskopie | Sciences 15710 | PFA, Fixiermittel, verdünnt in PBS |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | Waschmittel |
| Normales Ziegenserum | Gibco | 16210064 | Bestandteil des Blockierungs-/Waschpuffers |
| Normal Eselsserum | Jackson Immuno research | 017-000-121 | Bestandteil des Blockierungs-/Waschpuffers |
| Gebogene feine Pinzette | Dumont | RS-5047 | |
| Gebogene Pinzette | Integra Miltex Vantage | V918-782, V918-784 | |
| Filtereinheit 0,45 mm | Thermo Scientific | 157-0045 | Zur Filtration |
| 1 mL Spritze | Coviden | 8881501400 | Für Filtration |
| Spritzenfilter Einheit 0,22 mm | Millex-GV | SLGVR04NL | Zur Filtration |
| ProLong Gold | Thermo Scientific | P36934 | Anti-Fade-Eindeckmedium |
| Nagellack | Elektronenmikroskopie Sciences | 72180 | Zum Abdichten |
| Präpariermikroskop | Leica | MZ95 | |
| Konfokalmikroskop | Leica | TCS SP5 | |
| Photoshop CC 2017 | Adobe | Graphics Editor-Software | |
| Illustrator CC 2017 | Adobe | Graphics Editor-Software | |
| Image J | NIH | Bildverarbeitungssoftware | |
| Anti-PECAM-1 (CD31) Antikörper | Millipore | MAB1398Z | Hamster IgG, vaskulärer Endothelzellmarker, 1:300 |
| Anti-PECAM-1 (CD31) Antikörper | BD Pharmingen | 553369 | Ratte IgG2a kappa, vaskulärer Endothelzellmarker, 1:300 |
| Anti-αSMA Antikörper, konjugiert mit cy-3 | Sigma | C6198 | Maus IgG2a, vaskulärer Marker glatter Muskelzelle, 1:500 |
| Anti-EphB1 Antikörper | Santa Cruz | sc-9319 | Ziege polyklonaler, venöser Endothelzellmarker, 1:100 |
| Anti-Neuronen-spezifisches Klasse III β-Tubulin (Tuj1) | Abcam | AB18207 | Tuj1, polyklonales Kaninchen-IgG, panaxonaler Marker, 1:500 |
| Anti-Tuj1-Antikörper | Covance | MMS-435P | Maus IgG2a, panaxonaler Marker, 1:500 |
| Anti-MBP-Antikörper | Abcam | AB40390 | Kaninchen polyklonales IgG, Myelinisierungsmarker, 1:200 |
| Anti-Tyrosin-Hydroxylase-Antikörper | Chemicon | AB152 | Kaninchen polyklonaler, sympathischer Neuronenmarker, 1:500 |
| Anti-Peripherin-Antikörper | Chemicon | AB1530 | Kaninchen polyklonal, peripherer Neuronenmarker, 1:1000 |
| Anti-CD11b-Antikörper | Bio-Rad | MCA74G | Ratte IgG2b, Entzündungszellmarker (Makrophagen), 1:50 |
| Anti-CD45-Antikörper | Thermo Fisher Scientific | 14-0451-85 | Ratten-IgG2b Kappa, pan-hämatopoetischer Zellmarker, 1:500 |
| Anti-CD3-Antikörper | Bio-Rad | MCA1477T | Ratte IgG1, Immunzellmarker, 1:100 |
| Anti-CD45R (B220) Antikörper | Thermo Fisher Scientific | 14-0452 | Ratte IgG2a Kappa, Marker für Entzündungszellen, 1:200 |
| Anti-GFP Antikörper | Thermo Fisher Scientific | A11122 | Kaninchen polyklonal, 1:300 |
| Anti-GFP Antikörper | Abcam | Ab13970 | Huhn polyklonal, 1:500 |
| Anti-β-gal Antikörper | Cappel | 55976 | Kaninchen polyklonal, 1:5000 |
| Anti-RFP Antikörper | Abcam | Ab62341 | Kaninchen polyklonal, 1:300 |
| Kaninchen Anti-Kaninchen IgG (H+L) Alexa 488 | Thermo Fisher Scientific | A11034 | Kaninchen polyklonaler Sekundärantikörper, 1:250 |
| Kaninchen Anti-Hamster IgG (H+L) Alexa 647 | Jackson Immuno research | 127-605-160 | Hamster polyklonaler Sekundärantikörper, 1:250 |
| Ziegen-Anti-Ratten-IgG (H+L) Alexa 594 | Jackson Immuno Research | 112-585-167 | Polyklonaler Sekundärantikörper der Ratte, 1:250 |
| Ziegen-Anti-Maus-IgG2a Alexa 633 | Thermo Fisher Scientific | A21136 | Maus-IgG2a-Sekundärantikörper, 1:250 |
Referenzen
- Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin. Cell. 109, 693-705 (2002).
- Mukouyama, Y. S., James, J., Nam, J., Uchida, Y.
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Nachdrucke und Genehmigungen
