Rekombinante Retroviren Integrase und DNA-Oligomere imitiert virale DNA enden können einen enzymatisch aktiven Komplex bekannt als ein Intasome bilden. Intasomes können für biochemische, strukturellen und kinetischen Studien verwendet werden. Dieses Protokoll beschreibt, wie zu montieren und zu reinigen Prototyp schaumig Virus Intasomes.
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Methodenartikel
Montage und Reinigung der Prototyp schaumig Virus Intasomes
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
A Definition von Funktion und notwendiger Schritt des Lebenszyklus Retrovirus ist die Integration des viralen Genoms in das Wirtsgenom. Alle Retroviren kodiert eine Integrase (IN)-Enzym, das katalysiert die kovalente Verbindung von viralen Host DNA, bekannt als Strang übertragen. Integration kann modelliert in Vitro mit rekombinante Retroviren und DNA-Oligomere imitiert die Enden des Virusgenoms. Um genauer rekapitulieren die Integration-Reaktion, die auftritt, in Vivo, Integration sind komplexe von rekombinanten IN und synthetischen Oligomere durch Dialyse in einem reduzierten Salzgehalt Puffer montiert. Die Integration komplexer, genannt eine Intasome kann durch Größe Ausgrenzung Chromatographie gereinigt werden. Bei Prototyp schaumig Virus (PFV) der Intasome ist ein Tetramer von innen und zwei DNA-Oligomere und ist leicht von Monomeren IN und kostenlose Oligomer DNA getrennt. Die Effizienz der Integration des PFV Intasomes kann unter einer Vielzahl von experimentellen Bedingungen für die Dynamik besser zu verstehen und Mechanik der retroviralen Integration untersucht.
Einleitung
Integration des viralen Genoms in das Wirtsgenom ist ein obligatorischer Schritt im Lebenszyklus von allen Retroviren1. Das virale Enzym Integrase (IN) katalysiert die kovalente Verbindung der beiden Enden der viralen DNA-Genom an den Host DNA. Während einer zellulären Infektion gehört eine Vorintegration Komplex, die die Integration vermittelt. Rekombinante IN komplexiert mit doppelten gestrandeten DNA-Oligomere imitiert die virale DNA-enden können auch die Integration in ein Ziel DNA in Vitro2durchführen. Eine gemeinsame Integration Assay in Vitro nutzt ein supercoiled Plasmid als Ziel DNA. Integratio....
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Protokoll
(1) Glühen des vDNA
- Mähdrescher 1 X 10-Puffer (10 X 10 Lager: 100 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 M NaCl 10 mM EDTA), 10 µM Oligo-1 (5' ATTGTCATGGAATTTTGTATATTGAGTGGCGCCCGAACAG 3', 100 µM-Lager) und 10 µM Oligo-2 (5' CTGTTCGGGCGCCACTCAATATACAAAATTCCATGACA 3', 100 µM-Lager) in einem Endvolumen von 1,5 mL . Aliquoten 25 µL in sechzig 0,2 mL Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Röhren.
Hinweis: Abhängig von der Anwendung können Oligomere mit Fluorophore oder Tags am 5'-Ende von Oligo 2 oder als eine interne amino-T im Boden 13 vom 5'-Ende von Oligo 1 geändert werden. Modifizierte Oligomere sollte durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) vor Glühen gereinigt ....
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Ergebnisse
PFV Intasomes werden von rekombinanten IN und vDNA montiert. Nach der Montage sind Intasomes durch SEC (Abbildung 1) gereinigt. Integration-Aktivität der einzelnen Fraktionen ist mit einem supercoiled DNA Ziel- und Agarose Gelelektrophorese (Abbildung 2) untersucht. Dieses Gel wird mit einem fluoreszierenden Scanner eingestellt, erkennt EtBr (und Fluorophor, wenn Fluorophore beschriftet vDNA verwendet wird) abgebildet. Bildanalys.......
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Diskussion
Retroviren INs bilden einen Komplex mit viralen genomischen DNA führen Integration und weiter den viralen Lebenszyklus Multimeric. Die Anzahl der im Monomeren pro Intasome möglicherweise Tetramers, Octamers oder eventuell höhere Ordnung Multimere11,12,13,14. PFV Intasomes sind, dass ein Tetramer des rekombinanten mit doppelsträngigen DNA-Oligomere, die viralen genomischen DNA zu imitieren endet.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von NIH AI099854 und AI126742 auf Schlüssel unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| DNA-Oligomere | IDT | N/A | Custom DNA Oligos |
| Tris Ultra | Pure Gojira Fine Chemicals | UTS1003 | |
| NaCl | P212121 | RP-S23020 | |
| UltraPure EDTA | Invitrogen/Gibco | 15575 | |
| Amicon Ultra 0,5 mL Zentrifugalfilter | Sigma-Aldrich | Z677094-24EA | 3 kDa MWCO |
| DTT | P212121 | SV-DTT | |
| BIS-TRIS Propan, >=99,0% (Titration) | Sigma-Aldrich | B6755-500G | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | 208086 | |
| MgSO4 | Amresco | 0662 | |
| Glycerin | Thermo Fisher Scientific | G37-20 | |
| Gel-Ladespitzen, 1 - 200 μ L | Corning | CLS4853-400EA | |
| Rasierklinge; Einschneidig; 100/Pk.; Packung mit 100 | sterilen | 12-640 | |
| mit PES-Membran > 250 ml | Thermo Fisher Scientific | 568-0020 | |
| Dialyseschlauch-Clips | Spectrum Labs | 132734 | |
| 6-8 kDa 10 mm Dialyseschlauch | Spectrum Medical | 132645 | |
| Superose 6 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 17517201 | |
| Hi-Res Standard Agarose | AGTC Bioprodukte | AG500D1 | |
| Ethidiumbromid | Thermo Fisher Scientific | BP1302 | |
| Orange G | Fisher Scientific | 0-267 | |
| Hyladder 10kb, 500 Bahnen | Denville Scientific | CB4225-4 |
Referenzen
- Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. Retroviruses. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1997).
- Valkov, E., et al. Functional and structural characterization of the integrase from the prototype foamy virus. Nucleic Acids Res. 37 (1), 243-255 (2009).
- Hare, S., Gupta, S. S., Valkov, ....
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Nachdrucke und Genehmigungen
