Summary
Recombinante retrovirale integrase en DNA oligomeren nabootsen van virale DNA uiteinden kunnen een enzymatisch actieve complex bekend als een intasome vormen. Intasomes kan worden gebruikt voor biochemische, structurele en kinetische studies. Dit protocol detailleert hoe te monteren en te zuiveren van prototype schuimend virus intasomes.
Abstract
A het definiëren van functie en noodzakelijke stap in de levenscyclus van retrovirus is de integratie van het virale genoom in het genoom van de gastheer. Alle retrovirussen coderen een integrase (IN)-enzym dat katalyseert de covalente verbinding van virale naar host DNA, die staat bekend als strand overdracht. Integratie kan worden gemodelleerd in vitro met recombinant retrovirale IN en DNA oligomeren nabootsen van de uiteinden van het virale genoom. Om te recapituleren nauwer de integratie-reactie die in vivo, integratie optreedt zijn complexen van recombinante IN en synthetische oligomeren geassembleerd door dialyse in een lagere zoutconcentratie buffer. De integratie complex, een intasome, genaamd kan worden gezuiverd door grootte uitsluiting chromatografie. In het geval van prototype schuimend virus (PFV), de intasome is een tetrameer van IN en twee DNA oligomeren en is gemakkelijk gescheiden van monomeer IN en gratis oligomeren DNA. De efficiëntie van de integratie van PFV intasomes kan worden bepaald onder verschillende experimentele omstandigheden voor een beter begrip van de dynamiek en mechanica van retrovirale integratie.
Introduction
Integratie van het virale genoom in het genoom van de gastheer is een verplichte stap in de levenscyclus van alle retrovirussen1. Het virale enzym integrase (IN) katalyseert de covalente verbinding van elk uiteinde van het virale genoom van DNA tot de host DNA. Tijdens een cellulaire infectie, is IN onderdeel van een complex van pre integratie die integratie bemiddelt. Integratie in een doel DNA in vitro2kan ook worden uitgevoerd door recombinant IN complexvorm met dubbele gestrande DNA oligomeren nabootsen van de virale DNA-uiteinden. Een gemeenschappelijk integratie assay in vitro maakt gebruik van een supercoiled plasmide als het DNA van het doel. Integratie van beide virale DNA oligomeren (vDNA) naar de plasmide resulteert in een lineair product en gecoördineerde integratie (figuur 2A) wordt genoemd. De integratie assay in vitro kunnen ook producten opleveren met slechts één vDNA covalent toegevoegd aan de doel-plasmide resulterend in een ontspannen cirkel. Dit half-site integratie-product lijkt te zijn van een artefact van de bepaling in vitro.
Recombinant IN en vDNA mogen verrichten integratie in vitro, maar ze zijn niet ideaal reagentia voor de studie van de dynamiek of de structuur van integratie complexen als monomeer IN relevante visualisatie zou verhullen. Gezuiverde integratie complexen, of "intasomes," zijn vereist voor dynamische enkel molecuul analyse of structurele studies. PFV IN en vDNAs kunnen worden geassembleerd door dialyse uit de buffer van een relatief hoge zoutconcentratie aan een lagere zoutconcentratie3,4. Tijdens de dialyse, een neerslag vormen. Deze neerslag wordt verwijderd uit de dialyse en de zoutconcentratie wordt verhoogd. De hogere concentratie van het zout lost de overhaaste met PFV intasomes. De intasomes zijn dan gezuiverd door grootte uitsluiting chromatography (SEC). Recombinante prototype schuimend virus (PFV) IN blijkt te bestaan als een monomeer in oplossing bij concentraties tot 225 µM5. SEC fractionering scheidt effectief de PFV intasomes (225.5 kDa), waaronder een tetrameer van PFV IN en twee vDNAs, monomere PFV IN (44.4 kDa) en gratis vDNA (24.0 kDa). De PFV intasomes kunnen worden bevroren en integratie activiteit behouden gedurende ten minste zes maanden van opslag bij-80 ˚C.
Recombinante PFV intasomes kan ook worden gewijzigd om IN aminozuur vervangingen of afkappen mutaties of vDNAs voorzien van fluorophores of Biotine4,6te nemen. De gezuiverde PFV intasomes uitvoeren gemakkelijk integreren een doelwit supercoiled plasmide DNA in vitro. Bulk biochemische integratie testen met intasomes kunnen de effecten van testen IN mutaties, IN-remmers of andere chemische additieven. Biotinyleerd intasomes kan worden gebruikt om de sonde affiniteit met nucleic zuren of eiwitten. PFV intasomes zijn functioneel bij kamertemperatuur waardoor enkel molecuul microscopie p.a. door magnetische pincet voor het meten van de tijd tussen het verbinden van de twee uiteinden van de vDNA of de totale interne reflectie fluorescentie te visualiseren het intasome zoeken op doel DNA6. Daarnaast waren PFV intasomes de eerste die structureel worden gekenmerkt aanzienlijk invloed op het gebied van retrovirale integratie3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. het gloeien van vDNA
- Combineer 1 X tien Buffer (10 X 10 voorraad: 100 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 M NaCl, 10 mM EDTA), 10 µM Oligo 1 (5' ATTGTCATGGAATTTTGTATATTGAGTGGCGCCCGAACAG 3', 100 µM voorraad) en 10 µM Oligo 2 (5' CTGTTCGGGCGCCACTCAATATACAAAATTCCATGACA 3', 100 µM voorraad) in een eindvolume van 1,5 mL . Aliquot 25 µL in zestig 0,2 mL polymerase kettingreactie (PCR) buizen.
Opmerking: Afhankelijk van de toepassing, oligomeren kunnen worden gewijzigd met fluorophores of tags aan de 5'-eind van Oligo 2 of als een interne amino-T op basis 13 van het 5'-eind van Oligo 1. Gemodificeerde oligomeren moeten gezuiverd worden door krachtige vloeibare chromatografie (HPLC) vóór het gloeien. We hebben vastgesteld dat de efficiëntie van de vergadering intasome 10-fold 5'-eind Cy3 of Cy5 fluorophore labeling van Oligo 2 vermindert. Labelen van de interne fluorophore vermindert niet vergadering efficiëntie. - Anneal met behulp van een thermocycler met de volgende tijden en temperaturen: 1 cyclus op 94.0 ˚C 3 min, 99 cycli bij (94.0 ˚C 1 min, 93,6 ˚C 1 min) beide temperaturen te verlagen met 0.8 ˚C per cyclus (de laatste cyclus is 14,8 ˚C 1 min, 14.4 ˚C 1 min) , en op te slaan op 4.0 ˚C.
- Combineer de onthardende reacties van alle zestig buizen. Laden 500 µL aan twee 0,5 mL 3 kDa molecuulgewicht cutoff (MWCO) ultracentrifugal filter concentratie eenheden. Het concentreren van de ontharde vDNA door centrifugeren in een microcentrifuge bij 14.000 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT).
Opmerking: Het retentate volume moet ~ 50 µL in elke concentratie-eenheid. - Gooi de stroom door. Voeg 250 µL van de resterende ontharde vDNA aan elke filter eenheid. Herhaal de spin en het negeren van de stroom door. Uitwisseling in TE buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA) van de buffer door driemaal met 450 µL TE wassen.
- Omkeren van de eenheid van de filter en de spin bij 1.000 x g gedurende 2 min op RT. Het volume van de laatste retentate voor elke eenheid van de filter moet ~ 50 µL. Combineer de retentates en de overdracht aan een tube van 1,5 mL schroefdop.
- Meet de extinctie van de 260 nm ultraviolette (UV) van de vDNA. Gebruik deze waarde voor de berekening van de uiteindelijke Molaire concentratie van DNA. De uitsterven coëfficiënt (ε260) van deze vDNA is 622,803 cm-1 M-1 en zijn moleculair gewicht is 23,972 Da. winkel bij-20 ˚C.
2. Intasome vergadering
- Uitvoeren, indien mogelijk, de vergadering van de intasome in een kleine kamer met een regelbare thermostaat. Pas de thermostaat aan ongeveer 18-22 ˚C.
Opmerking: In onze ervaring, intasome vergadering op 4 ˚C is inefficiënt. - Bereiden 1 L voor dialyse buffer (20 mM Bis-tris propaan, pH 7.5, 200 mM NaCl, 2 mM dithiothreitol (DTT), 25 µM ZnCl2) in een bekerglas van 2 L met een roer-balk in een bord roer. Equilibreer de buffer in de 18-22 ˚C ruimte voor ten minste 6 uur.
- Om de intasomes te monteren, 50 mM Bis-tris propaan, pH 7.5, 500 mM NaCl, 120 µM PFV IN en 50 µM vDNA in een totaal volume van 150 µL te combineren.
Opmerking: De PFV IN moet vrij zijn van contaminerende7,8van de activiteit van de nuclease. Als de concentratie van PFV IN ook verdund voor 120 µM IN in 150 µL volume, is dan is het mogelijk om het eindvolume naar 200 µL. De kritische factoren voor deze stap zijn om de molaire IN verhouding tot het vDNA (2.4:1) en te zorgen voor genoeg complex te visualiseren tijdens chromatografie. - Een ~ 10-cm lang stuk 10-mm 6-8 kDa MWCO dialyse buizen en clips met dubbel gedestilleerd water (ddH2van O), of het hoogste beschikbare zuiverheid water schoon. Bevestig één uiteinde van de buis.
Opmerking: Dialyse buis moet voorzichtig behandeld worden om te voorkomen dat elke mogelijke besmetting van de lab-ruimte. - Breng 15 mL dialyse buis spoelen buffer (50 mM Bis-tris propaan, pH 7.5, 500 mM NaCl). Spoel de binnenkant van de buis van de dialyse drie keer met 1-2 mL spoelen buffer. Verwijder zo veel van de buffer van de spoelen zoveel mogelijk met een pipet en dunne gel laden tip.
- Indien nodig, gebruik een schone scheermesje of scalpel te snijden de dialyse buizen zodat een dunne gel laden tip tot het einde van de buis oplopen.
- De vergadering van de intasome van stap 2.3 overbrengen aan de buis van de dialyse met een pipet en een dunne gel laden tip. Clip van het open uiteinde van de buis van de dialyse, minimaliseren van de hoeveelheid lucht die in de buis. Plaats de buis in de dialyse-buffer.
- Dialyze overnachting (16-20 h) met zachte roeren, zodat de slang draait maar niet in een draaikolk is. Zorg ervoor dat de dialyse-buis onder het zeeoppervlak en mobiele. Na ongeveer een uur, een zichtbare neerslag in de buis te observeren.
Opmerking: Met Cy3 en Cy5 fluorescently label vDNA de neerslag is meer voor de hand. Dit geldt voor zowel einde gemarkeerd als intern gelabelde fluorescerende vDNA.
3. Intasome solubilisatie
- Twee opstellen breed droeg Pipetteer tips door het verwijderen van 2-4 mm vanaf het einde van een 200 µL-tip met een nieuwe scheermes of scalpel blad op een schoon oppervlak.
Opmerking: De tips zal worden gebruikt in stap 3.3 en 3.5. - Verwijder de dialyse-buis uit de dialyse-buffer. Om te voorkomen dat de verdunning van het monster intasome met dialyse buffer die aan het einde van de buis in de buurt van de clip blijven kan, gebruik een micropipet met een kleine pipet tip wilt verwijderen van alle overtollige dialyse-buffer. Verwijder de clip uit één uiteinde van de buis van de dialyse.
- Gebruik een breed droeg pipette uiteinde van stap 3.1 overdracht van het monster met inbegrip van de neerslag in de dialyse-buis naar een 1.5-mL-buis op ijs. Opmerking het totale volume van het teruggewonnen materiaal; het totale volume is meestal ~ 140 µL.
- Het monster met neerslag bedraagt 200 mM NaCl; het zout tot een eindconcentratie van 320 mM NaCl verhogen door toe te voegen het juiste volume van een stamoplossing 5 M NaCl. Bijvoorbeeld, voor een voorbeeld van 150 µL, voeg 3.9 µL 5 M NaCl en 1.1 µL ddH2O voor een eindvolume van 155 µL. overdracht ijsemmer met proeven in een koude kamer 4 ˚C.
- Gebruik een breed droeg pipette uiteinde van stap 3.1 resuspendeer en solubilize van de neerslag door pipetteren. Herhaal elke 20 min voor ten minste 1 h. Let op dat de meeste van de neerslag in oplossing gaan.
Opmerking: Pipetting om resuspendeer de neerslag kan gestopt worden wanneer blijkt dat de neerslag langer aanzienlijk wordt verminderd tussen de tijdstippen. Wanneer vDNA is niet het label of intern heet, wordt het precipitaat verminderd met ~ 90% gebaseerd op visuele inspectie. In het geval van Cy5 einde label vDNA, is de neerslag met alleen ~ 20% verminderd; de meeste van de neerslag met fluorophore einde label vDNA zal niet solubilize. De hoeveelheid neerslag die is effectief ontbindend is variabel en empirisch bepaald moet worden.
4. Intasome zuivering
- Bereiden grootte uitsluiting chromatography (SEC) 250 mL buffer (20 mM Bis-tris propaan, pH 7.5, 320 mM NaCl, 10% glycerol) uitgevoerd. Steriel filter de buffer met een 0,2-µm filter eenheid en bewaren bij 4 ˚C.
Opmerking: Alle zuivering stappen worden uitgevoerd in een koude kamer 4 ˚C. - Een kolom kruislings gekoppelde agarose SEC equilibreer (diameter = 10 mm; lengte = 300 mm; bed volume = 24 mL; proeven volume = 25-500 µL; maximale druk = 1,5 MPa; uitsluiting limiet = 4 x 107 Da; scheidt molecuulgewicht tussen 5 en 5.000 kDa, zie de van de placemat erials) met de lopende buffer SEC op een debiet van 0.4 mL/min.
Opmerking: Deze zuivering kan worden aangepast aan verschillende grootte uitsluiting kolommen als ze kunnen effectief scheiden 300 kDa van 44 kDa, zoals Superose 12 10/300 GL of Superose 6 verhogen. Superose 12 10/300 GL heeft lagere resolutie, wat leidt tot meer overlap van pieken. Omgekeerd, Superose 6 verhogen heeft een hogere resolutie en betere scheiding biedt. - Centrifugeer het intasome monster in een microfuge bij 14.000 x g gedurende 10 minuten op 4 ˚C tot een eventueel resterende neerslag pellet. Verwijder voorzichtig het supernatant. De bovendrijvende vloeistof aan een 200 µL injectie lus (leidingen die ~ 200 μl houden kan) worden geladen. Het monster van toepassing op de SEC-kolom.
Opmerking: Kleinere belasting volumes toestaan grotere resolutie door de SEC. - Elueer met 25 mL SEC uitvoeren buffer en verzamelen van 95 breuken van 270 µL. ziet dat het chromatogram SEC wordt weergegeven drie A280/A260 pieken (Figuur 1).
Opmerking: De eerste moet een aggregaat (~9.0 - 11,5 mL elutie), gevolgd door de PFV tetrameer intasome piek (~12.0 - 14,75 mL elutie) en PFV IN monomeer met gratis vDNA piek (~15.0 - 18,0 mL).
5. integratie Strand overdracht Assay, de selectie van de breuk en opslag
- Combineer 2 µL van elke intasome piek breuk en 50 ng 3 kb supercoiled plasmide DNA (voorraad concentratie is 50 ng/µL) in reactie buffer (10 mM Bis-tris propaan, pH 7.5, 110 mM NaCl, 5 mM MgSO4, 4 µM ZnCl2, 10 mM DTT) in een uiteindelijke reactie volume van 15 µL. Incubeer bij 37 ˚C gedurende 5 minuten.
- Omvatten een negatieve controle met geen toegevoegde PFV intasome. Stop de reactie met 0,75 µL proteïnase K (20 mg/mL stockoplossing) en 0,75 µL SDS (stockoplossing 10%). Incubeer bij 55 ˚C voor 1 h. winkel monsters zo nodig bij-20 ˚C voor latere analyses.
Opmerking: Deze test is een kwalitatieve beoordeling van integratie activiteit. De molaire concentratie van intasome van elke breuk wordt niet bepaald voorafgaand aan deze test. Breuken in de integratie strand overdracht bepaling opgenomen kunnen worden opgeslagen op het ijs (inclusief overnachting opslag) tot integratie activiteit is bevestigd en geselecteerde breuken zijn aliquoted. Hier gebruiken we pMP2, een afgeleide van pUC199. We hebben ook met succes gebruikt de 5.4 kb plasmide pcDNA 3.1. Een plasmide die kan worden omgezet in cirkel, lineaire, ontspannen en supercoiled formulieren kunnen worden gebruikt als een doel voor integratie. - Bereiden een 120 mL 1% gewicht per volume (w/v) agarose gel in 1 X TAE-buffer (40 mM Tris-acetaat, 1 mM EDTA) met 0,1 μg/mL ethidium bromide (EtBr, 10 mg/mL stockoplossing)10. Smelt de agarose oplossing en giet het in een lade van 15 x 10 cm gel gieten. Invoegen van een 15-well kam met 5 mm breed, 0,75 mm dik wells.
Opmerking: Smaller putten levert betere band resolutie ten opzichte van 1,5 mm dikke wells. - Laat de gel te stollen bij kamertemperatuur. Dompel de gel in 1 X TAE met 0,1 μg/mL EtBr.
- 3 µL 50% glycerol aan elke integratie reactie toevoegen vanaf stap 5.2. Het laden van het volume van de hele reactie aan de gel. Laden 1 µL van 10 kb DNA grootte markering (150 ng/µL voorraad concentratie) op de rijstroken aan beide zijden van de monsters; met andere woorden, moet de DNA grootte markering flankeren de monster rijstroken.
- Laden in een buitenste rijstrook, 6 µL oranje G kleurstof (0,25% oranje G, 30% glycerol). Stel de gel bij constante spanning, 10 V/cm (100 V) bij kamertemperatuur gedurende 1 uur, of totdat de voorkant van de kleurstof oranje G bereikt het einde van de gel.
- Direct het imago van de agarose gel met een fluorescerende scanner ingesteld op EtBr (532 nm excitatie, 610 nm emissie filter) detecteren. Als fluorophore met het label vDNAs werden gebruikt, ook beeld met passende fluorophore instellingen.
Opmerking: bijvoorbeeld, om op te sporen Cy5 label DNA, beeld met behulp van 633 nm excitatie en 670 nm emissie filters. Gecoördineerde integratie producten (CI, lineaire DNA) moeten uitvoeren trouw grootte bij ~ 3 kb, spoorverontreiniging supercoiled plasmide (SC) moet sneller (~ 2 kb) worden uitgevoerd en half-site integratie producten (HSI, ontspannen cirkel DNA) moeten langzamer (~3.5 kb) worden uitgevoerd. Spoorverontreiniging vDNA moet draaien trouw grootte op ~ 40 bp. - Kwantificeren van de bands in iedere baan met imaging software7. Berekenen van de Fractie van DNA in elke rijstrook thats CI, HSI of SC; vDNA wordt niet meegenomen in deze berekening.
Opmerking: Integratie efficiëntie, of de Fractie van SC geconverteerd naar een lineaire product, werd berekend door het volume van de pixel van gecoördineerde integratie producten (CI) door het volume van de totale pixel van drie bands (HSI + CI + SC). Als intasomes fluorophore met het label bent, kunnen de HSI en CI producten ook worden quantitated door fluorescentie. - Selecteer breuken die het meest gecoördineerde integratie activiteiten hebben.
Opmerking: In onze ervaring, de piek gecoördineerde integratie activiteit samenvalt met de piek van de eiwitten tetramere PFV intasomes genoemd. De A-280 van elk van deze gehalten meten en berekenen van de uiteindelijke intasome-concentratie. De Epsilon280 voor een tetrameer van wild type PFV IN met twee vDNAs die hier beschreven wordt 908,339 cm-1M-1 en het moleculair gewicht is 225.5 kDa. De concentraties moeten volgen hetzelfde patroon als de SEC chromatografische piek en in de bepaling van de overdracht deel. - Elke fractie in 5 µL aliquots verdelen en snap bevriezen in vloeibare stikstof. Opslaan aliquots bij-80 ˚C. Breuken geselecteerd voor opslag zijn meestal tussen 200-600 nM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PFV intasomes zijn samengesteld uit recombinante IN en vDNA. Na montage, zijn intasomes gezuiverd door SEC (Figuur 1). Integratie activiteit van elke breuk is bepaald met een supercoiled DNA target en agarose gelelektroforese (Figuur 2). Deze gel is beeld met een fluorescerende scanner ingesteld op het detecteren van EtBr (en fluorophore, als vDNA met het fluorophore-label wordt gebruikt). Met behulp van de software van de analyse van de afbeelding, kunnen band pixel volumes worden gebruikt voor het berekenen van de efficiëntie van de integratie (Figuur 3). Breuken met de hoogste efficiëntie van de integratie zijn module bevroren voor later gebruik. Bevroren breuken behouden integratie activiteit (Figuur 4), waardoor voor de lange termijn opslag van geassembleerde intasomes. Elk label molecuul en haar positie binnen de vDNA kunnen beïnvloeden intasome vergadering efficiëntie (Figuur 5).
Figuur 1: grootte uitsluiting chromatogram. Een PFV intasome vergadering werd gescheiden met een agarose SEC kolom. Deze kolom maakt de scheiding van het aggregaat (1), PFV intasome bestaande uit een tetrameer PFV IN twee vDNA (2), en monomeer PFV IN en vDNA (3). In dit voorbeeld opgenomen vDNA met een interne Cy5 fluorophore label gedetecteerd door 650 nm excitatie. De y-as geeft de optische dichtheid (OD) in milli-absorptie-eenheden (mAU). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: bepaling van de integratie van de SEC breuken. (A) schema van integratie strand overdracht reactie. Links, cartoon van een PFV intasome waaronder een tetrameer van IN (blauwe cirkels) en twee vDNA (dikke zwarte lijnen) en een doel plasmide (dunne zwarte lijnen). De supercoils (SC) van de plasmide doel worden niet getekend. Centrum, cartoon van een half-site integratie (HSI) product te gebruiken wanneer een vDNA covalent toegetreden aan het doel-plasmide tot is. De reactie van de verbindende introduceert een nick en ontspant de supercoils. Recht, cartoon van een onderling afgestemde feitelijke integratie (CI) product waar twee vDNAs gezelschap hebben gekregen om het DNA van het doel. Deze integratie product resulteert in een lineaire DNA met vDNAs aan de uiteinden. (B) Supercoiled plasmide-DNA is toegevoegd op elke SEC breuk #49-55. Na incubatie, de integratie reacties waren deproteinated en gescheiden door 1% agarose gelelektroforese met EtBr. Negatieve controle was plasmide DNA met geen eiwit (T). DNA-merkers voor grootte worden in kb weergegeven. Supercoiled plasmide (SC), gecoördineerde integratie producten (CI), half-site integratie producten (HSI) en vDNA worden aangegeven. (C) de agarose gel is doorzocht op de aanwezigheid van Cy5. Alleen de vDNA CI en HSI producten zichtbaar zijn. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: kwantificatie van integratie assay. De agarose gel uit Figuur 2 was gescand en gekwantificeerd voor de aanwezigheid van zowel (A) EtBr en (B) Cy5. (A) voor de berekening van de EtBr, HSI, CI en SC band pixel volumes werden verkregen met behulp van de software van de analyse van de gel. Integratie-efficiëntie werd berekend door het volume van de pixel van gecoördineerde integratie producten (CI) door het volume van de totale pixel van alle drie bands (HSI + CI + SC). Bijvoorbeeld, de pixelwaarden in de EtBr voor de bands van breuk #49 zijn kanaal: 110565.2 SC, 25152.56 CI en 6313.04 HSI. De totale waarde van de pixel van de DNA voor fractie #49 is de som van deze waarden, 142030.8. De efficiëntie van de integratie is de CI pixel hoeveelheid 25152.56 gedeeld door de totale waarde van de DNA 142030.8 0.18 evenaren. (B) Cy5 CI band pixel volumes zijn opgenomen in een grafiek als willekeurige eenheden. Breuken met piek integratie activiteit zijn individueel aliquoted en bevroren. In dit voorbeeld werden breuken #50-53 geselecteerd. Aliquots zijn module met vloeibare stikstof bevroren en opgeslagen bij-80 ˚C voor toekomstig gebruik.
Figuur 4: Effect op intasome activiteit te bevriezen. Helft van een SEC breuk was flash bevroren met vloeibare stikstof, opgeslagen op-80 ˚C voor 1 h en vervolgens langzaam ontdooid op ijs. De resterende helft van de SEC-Fractie werd gehouden op het ijs in een koude kamer terwijl de eerste helft was bevroren en ontdooid. Intasomes werden uitgetest voor activiteit zonder (-) en met (+) bevriezen/ontdooien. Integratie-efficiëntie werd gemeten zoals hierboven beschreven. (A) EtBr gekleurd agarose gel van integratie reactieproducten. Supercoiled plasmide (SC), gecoördineerde integratie producten (CI), half-site integratie producten (HSI) en spoorverontreiniging vDNA worden aangegeven. DNA-merkers voor grootte worden in kb weergegeven. (B) de kwantificatie van de efficiëntie van de integratie van het EtBr beeld. Berekeningen worden beschreven in Figuur 3 legenda. Er is geen verlies van integratie activiteit na bevriezen en ontdooien. De gemiddelde integratie efficiëntie wordt ook weergegeven voor 5 onafhankelijke experimenten met 2 intasome preparaten. Foutbalken geven de standaarddeviatie. Gepaarde t-toets analyses leverde een tweezijdige P = 0.011, wat suggereert dat de vorst/dooi kan hebben enigszins verbeterd integratie activiteit. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: Label molecuul en positie effecten intasome vergadering. PFV intasome assemblages inbegrepen vDNAs die waren labelloze (rood), label op 2 van de Oligo met Cy5 (blauw), intern met het label op Oligo 1 met Cy5 (zwart), einde of einde gemarkeerd op Oligo 2 met biotine (oranje). Alle vergaderingen werden gescheiden met een agarose SEC-kolom. De y-as geeft OD in mAU. Chromatogrammen zijn representatief voor ten minste 2 onafhankelijk assemblages voor elk type intasome. De opbrengst van PFV intasomes met Cy5 10-fold einde labeling vermindert en biotine 1.8-fold. Einde Cy5 en biotine vergaderingen hebben aanzienlijk meer neerslag overblijft na hoog zout resolubilization (stap 3.5), wat resulteert in duidelijk verlies van materiaal op de kolom grootte uitsluiting. Interne labeling van de vDNA met de Cy5 fluorophore leidt tot een gelijke opbrengst van intasomes als labelloze vDNA. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Retrovirale INs vormen een complex met virale genomic DNA uit te voeren van de integratie en de virale levenscyclus blijven multimeric. Het aantal IN monomeren per intasome kan worden tetramers, octamers of eventueel hogere orde multimeren11,12,13,14. PFV intasomes zijn een tetrameer van recombinant met double-stranded DNA oligomeren, die virale genomic DNA na te bootsen eindigt3. Deze intasomes werden gebruikt in structurele en dynamische studies3,5,13,14.
De vergadering van PFV intasomes treedt op tijdens de dialyse uit de buffer van een relatief hoge zoutconcentratie aan een lagere zoutconcentratie. Dit resulteert in de vorming van een neerslag waarin de PFV intasomes. De intasomes zijn ontbindend doordat de zoutconcentratie. PFV IN is aangetoond als monomeer bij concentraties tot 225 µM5. De complexen zijn dan geïsoleerd uit monomeer IN en gratis vDNA door de SEC. We hebben de zuivering van PFV intasomes met glycerol in de SEC buffer6bewerkt. De toevoeging van glycerol kunt de PFV intasomes te worden bevroren voor toekomstig gebruik zonder verlies van activiteit (Figuur 4).
Er zijn een aantal belangrijke functies van dit protocol. Hoewel eiwitreiniging wordt vaak uitgevoerd bij lage temperaturen, hebben we empirisch gevonden dat PFV intasome vergadering op 4 ˚C inefficiënt is. In plaats daarvan plaatsvinden de dialyse vergadering in het bereik van 18-22 ˚C. Het is ook belangrijk om recombinant PFV IN die vrij is van besmetting van bacteriële nuclease7,8. Ten slotte, IN de verhouding tot het vDNA is een belangrijke factor van de vergadering. Als de begin IN eiwitconcentratie lager dan aanbevolen hier is, moet de concentratie van vDNA proportioneel wordt verlaagd. Hoewel het mogelijk is te monteren PFV intasomes bij lagere concentraties, moet de complexen op een hoog genoeg concentratie voor detectie tijdens SEC scheiding.
Deze methode kan worden gebruikt voor PFV intasomes met labelloze of gelabelde vDNA. We hebben vastgesteld dat de vDNA efficiënt kan worden aangeduid met een fluorophore of Biotine6. Andere kleine molecuul etiketten ook mogelijk. In het geval van Cy5 fluorophore vinden we dat eind vDNA het label vermindert het rendement van de geassembleerde intasomes met de concentratie van de piek 10-fold verminderd. Echter, intern Cy5 label vDNA heeft een equivalente rendement tot labelloze vDNA. Deze vergadering-methode kan ook worden gebruikt met puntmutaties of afkappen mutaties van PFV IN4. Aangezien PFV IN wordt geremd door klinisch relevante IN strand overdracht remmer (ins) drugs gericht op HIV-1 IN, is het mogelijk met deze PFV intasomes te bestuderen van het mechanisme van INSTIs3. Bovendien, plaatsvinden sommige DISCRE resistente mutaties van HIV-1 IN op geconserveerde residuen in PFV IN, waardoor studies van medicamenteuze resistentie met gemanipuleerde PFV intasomes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de NIH AI099854 en de AI126742 sleutel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNA Oligomers | IDT | N/A | Custom DNA Oligos |
| Tris Ultra Pure | Gojira Fine Chemicals | UTS1003 | |
| NaCl | P212121 | RP-S23020 | |
| UltraPure EDTA | Invitrogen/Gibco | 15575 | |
| Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filters | Sigma-Aldrich | Z677094-24EA | 3 kDa MWCO |
| DTT | P212121 | SV-DTT | |
| BIS-TRIS propane,>=99.0% (titration) | Sigma-Aldrich | B6755-500G | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | 208086 | |
| MgSO4 | Amresco | 0662 | |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | G37-20 | |
| Gel-loading tips, 1 - 200 μL | Corning | CLS4853-400EA | |
| Razor blade; Single-edged; 100/Pk.; Pack of 100 | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 250mL | Thermo Fisher Scientific | 568-0020 | |
| Dialysis tubing clips | Spectrum Labs | 132734 | |
| 6-8 kDa 10 mm Dialysis Tubing | Spectrum Medical | 132645 | |
| Superose 6 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 17517201 | |
| Hi-Res Standard Agarose | AGTC Bioproducts | AG500D1 | |
| Ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific | BP1302 | |
| Orange G | Fisher Scientific | 0-267 | |
| Hyladder 10kb, 500 lanes | Denville Scientific | CB4225-4 |
References
- Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. Retroviruses. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1997).
- Valkov, E., et al. Functional and structural characterization of the integrase from the prototype foamy virus. Nucleic Acids Res. 37 (1), 243-255 (2009).
- Hare, S., Gupta, S. S., Valkov, E., Engelman, A., Cherepanov, P. Retroviral intasome assembly and inhibition of DNA strand transfer. Nature. 464 (7286), 232-236 (2010).
- Li, M., Lin, S., Craigie, R. Outer domains of integrase within retroviral intasomes are dispensible for catalysis of DNA integration. Protein Sci. 25 (2), 472-478 (2016).
- Gupta, K., et al. Solution conformations of prototype foamy virus integrase and its stable synaptic complex with U5 viral DNA. Structure. 20 (11), 1918-1928 (2012).
- Jones, N. D., et al. Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration. Nat Commun. 7, 11409 (2016).
- Lopez, M. A., Mackler, R. M., Altman, M. P., Yoder, K. E. Detection and removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase. J Vis Exp. , (2017).
- Lopez, M. A., Mackler, R. M., Yoder, K. E. Removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase. J Virol Methods. 235, 134-138 (2016).
- Poirier, M. G., Bussiek, M., Langowski, J., Widom, J. Spontaneous access to DNA target sites in folded chromatin fibers. J Mol Biol. 379 (4), 772-786 (2008).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
- Ballandras-Colas, A., et al. Cryo-EM reveals a novel octameric integrase structure for betaretroviral intasome function. Nature. 530 (7590), 358-361 (2016).
- Ballandras-Colas, A., et al. A supramolecular assembly mediates lentiviral DNA integration. Science. 355 (6320), 93-95 (2017).
- Passos, D. O., et al. Cryo-EM structures and atomic model of the HIV-1 strand transfer complex intasome. Science. 355 (6320), 89-92 (2017).
- Yin, Z., et al. Crystal structure of the Rous sarcoma virus intasome. Nature. 530 (7590), 362-366 (2016).
- Maertens, G. N., Hare, S., Cherepanov, P. The mechanism of retroviral integration from X-ray structures of its key intermediates. Nature. 468 (7321), 326-329 (2010).
- Maskell, D. P., et al. Structural basis for retroviral integration into nucleosomes. Nature. 523 (7560), 366-369 (2015).
