Die Bestimmung der Protease Spezifität im Maus-Gewebe extrahiert durch MALDI-TOF-Massenspektrometrie: PH um Spezifität Änderungen führen zu manipulieren

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Ihnen Auszüge mit MALDI-TOF-Massenspektrometrie ein Protokoll Protease Spezifität im Rohöl Maus Gewebe zu bestimmen.

Zusammenfassung

Proteasen haben mehrere biologische Funktionen, einschließlich der Proteinverdauung Aktivierung/Inaktivierung und Essen. Identifizieren Protease Spezifität ist wichtig für die Preisgabe von Protease Funktion. In dieser Studie die vorgeschlagene Methode bestimmt Protease Spezifität durch Messung des Molekulargewichts des einzigartigen Substrate mit Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionisation Time-of-Flight (MALDI-TOF) Massenspektrometrie. Die Substrate enthalten Iminobiotin, während die gespalten Site aus Aminosäuren besteht und das Distanzstück aus Polyethylenglykol besteht. Gespalten Substrat erzeugt eine einzigartige Molekulargewicht mit einer Aminosäure gespalten. Einer der Vorzüge dieser Methode ist, dass es in einen Topf mit groben Proben durchgeführt werden, und es eignet sich auch für die Beurteilung mehrerer Proben. In diesem Artikel beschreiben wir eine einfache experimentelle Methode optimiert mit Proben extrahiert aus Maus Lungengewebe, einschließlich Gewebe Extraktion, Platzierung des Verdauungssystems Substrate in Proben, Reinigung des Verdauungssystems Substrate unter verschiedenen pH-Bedingungen , und die Messung der Substrate Molekulargewicht mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie. Zusammenfassend lässt sich sagen erlaubt diese Technik für die Identifizierung von Protease Spezifität in grobe Proben abgeleitet von Gewebe-Extrakte mit MALDI-TOF-Massenspektrometrie, die leicht für mehrere Probenverarbeitung skaliert werden kann.

Einleitung

Proteasen regulieren die physiologischen Prozesse durch Spaltung von Proteinen, und die Einleitung der Protease-Aktivität zu bestimmten Zeiten und Orten geregelten¹. Es ist daher wichtig, identifizieren die Expression und Aktivität des Gewebes, die lokal reguliert werden und eine neuartige Methode zur Erkennung von Proteasen zu entwickeln. Die Methode vorgeschlagen, dieser Studie soll Protease Spezifität parallel zur Erkennung von Proteasen zu ermitteln.

Es gibt einige Methoden zur Erkennung von Protease Spezifität. Die Azocasein Methode ist bekannt für seinen Gebrauch bei der Erkennung von Proteasen² aber beschränkt sich in seiner Fähigkeit, weitere Informationen zu erhalten. Zymography ist eine weitere umfassende Protease-Erkennung-Methode, die verwendet werden kann, um festzustellen, das Molekulargewicht von Proteasen³, aber es kann nicht verwendet werden, zu prüfen, Substratspezifität. Protease-Spezifität kann durch spektrometrische Assays mit Substraten wie p-Nitroanilide-⁴, und fluorometrischen Assays, Verwendung von Cumarin Substrate⁵ oder Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer (FRET) Assays⁶bestimmt werden. Diese Methoden ermöglichen Einzel-Spezifität Erkennung von Substraten in einem einzigen Brunnen enthalten. In der vorliegenden Studie wird die Protease-Spezifität der Gewebe-Extrakte unter verschiedenen Bedingungen untersucht, da diese Extrakte mehrere Proteasen enthalten. Protease-Aktivität wird durch mehrere Faktoren, einschließlich pH-Wert, Coenzyme und prosthetischen Gruppen Ion Stärke reguliert. Vor kurzem wurden Proteomics-basierte Methoden zur Protease Spezifität zu identifizieren; zum Beispiel die Methode von Biniossek Et al.berichtet. ⁷ das Proteom Substratspezifität auch auszugsweise grob bestimmen verwendet und ermöglicht die genaue Bestimmung der Spaltung Aktivität von Proteasen, die mehrere Aminosäure-Sequenzen⁸erkennen. Diese Methode eignet sich jedoch nicht für die Analyse von zahlreichen Proben. Dagegen unsere Methode ermöglicht die gleichzeitige Bearbeitung mehrerer Proben und die Verwendung von Matrix Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight (MALDI-TOF) Massenspektrometrie für die Probenanalyse ermöglicht schnelle und einfache Erkennung von der gespalten Substrate.

Dieses Papier beschreibt eine Methode zur Evaluierung Protease Spezifität mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie, um das Molekulargewicht des einzigartigen Substrate zu messen. Die molekularen Formen gespalten Substrate, zusammen mit ihre theoretischen Molekulargewichte sind in Abbildung 1 und Tabelle 1gezeigt. Frühere Studien haben Substrate mit Polyglycine Spacer und Biotin⁹verwendet; diese Substrate sind jedoch fehlerhaft, weil die Polyglycine-Sequenz durch Enzyme gespalten werden kann, die die Glycin-Sequenz zu erkennen. Darüber hinaus kann die hohe Affinität zwischen Avidin und Biotin zu einer geringen Quote führen. Um diese Nachteile in dieser Studie zu verbessern wir eine einzigartige Substrat synthetisiert die bestand von Polyethylenglykol (PEG), Iminobiotin und eine Aminosäure, die der spaltstelle (Abbildung 1) identifizieren konnten. Zur Unterscheidung zwischen Aminosäuren von ähnlichen Molekulargewichten wurde D-Serin zwischen den PEG-Abstandhalter und die Aminosäure am gespalten Standort hinzugefügt.

Die N-terminalen des Substrates war mit Iminobiotin, bezeichnet die Affinitätsreinigung von groben Proben ermöglicht. Der Einsatz von Iminobiotin anstelle von Biotin ist entscheidend; Biotin hat eine starke Affinität zu Avidin, das führt zu niedrigen Wiederfindungsraten von Biotin-markierten Substraten von Avidin Harz, während Iminobiotin die Affinität zum Avidin durch den pH-Wert verändert werden kann. Mit der Bezeichnung der Iminobiotin Substrate binden an Avidin in Bedingungen oberhalb von pH 9, während Avidin mit der Bezeichnung der Iminobiotin Substrate in Bedingungen unter pH 4 veröffentlicht. Daher wurde Iminobiotin für Affinität Reinigung¹⁰verwendet. Zusammenfassend lässt sich sagen beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Erkennung von Protease Spezifität mit einzigartigen Substrate.

Protokoll

Tierische experimentelle Protokolle waren von der Nihon Pharmazeutische Universität Ethikkommission genehmigt und gemäß den Leitlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren der Nihon Pharmaceutical University durchgeführt. Das Protokoll wurde für die Gewebe-Extrakte von ICR Mäusen abgeleitet angepasst. ICR Mäuse wurden von Nippon SLC Ltd. (Shizuoka, Japan) gekauft.

1. Vorbereitung des Substrats Iminobiotin beschriftet

Das Substrat erfährt Festphasen-Synthese mit 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl-Gruppe (Fmoc)-geschützte Aminosäuren wie unten¹¹beschrieben. Verwenden Sie Tabelle 2 um die Fmoc-Verbindung verwendet, je nach der gewünschten Aminosäure und Stadium der Synthese zu bestimmen.

1. 0,2 g der Fmoc-NH-SAL Harz mit 10 mL N, N-Dimethylformamid (DMF) in einer Synthese Spalte hinunterspülen.
2. 5 mL 30 % Piperidin in DMF hinzugeben. Rock-die Lösung für 10 min in der Fmoc-Gruppe zu Spalten.
3. Fmoc-Spaltung mit der Trinitrobenzenesulfonic Säure (TNBS) testen¹²: Fügen Sie 10 µL 1 % TNBS in DMF und 10 µL Diisopropylethylamine (DIPEA) eine 10 x 75 mm² Glasröhrchen, dann Transfer eine kleine Menge des Harzes, das Glas Rohr. Die Fmoc-gespalten Harz sollte eine orange Farbe entwickeln.
   1. Wiederholen Sie die Schritte 1,2-1,3, wenn dieses Ergebnis negativ ist.
4. Waschen Sie das Harz dreimal mit 5 mL DMF.
5. Fügen Sie 5 mL DMF enthalten 0,3 Mmol der Fmoc-Verbindung in Tabelle 2 (beginnend mit der Verbindung, die in Phase 1 verwendet), 0,3 Mmol O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium Hexafluorophosphate (HCTU), 1 - 0,3 Mmol aufgelistet Hydroxy-1H-benzotriazol, Monohydrat (HOBt) und 0,6 Mmol Diisopropylethylamine (DIPEA). Rock-die Lösung für 30 min, mit dem Harz zu koppeln.
   1. Überprüfen Sie diesen Schritt mit dem TNBS-Test. Wenn das Ergebnis positiv ist, bedeutet dies die Reaktion ist nicht ausreichend fortgeschritten und diesen Schritt wiederholt werden muss.
6. Waschen Sie das Harz dreimal mit 5 mL DMF.
7. Wiederholen Sie der Dehnung Reaktion durch Wiederholen der Schritte 1,2-1,6, ändern die Fmoc-Verbindung in Schritt 1.5 nach Tabelle 2verwendet.
8. Fügen Sie 1 mL 2,5 % Wasser, 1 % Triisopropylsilane (TIS) und 2,5 % Ethanedithiol (EDT) in Trifluoroacetic Säure zu Peptiden aus dem Harz und Schutz Gruppen zu Spalten. Die Lösung für 60 min Rock.
9. Filtern Sie und sammeln Sie Filtrat in ein 50-mL-Tube.
10. Fügen Sie 40 mL kalte Diethyl Ethanol und laden über Nacht bei-20 ° C.
11. Zentrifuge 4.000 x g bei-20 ° C für 30 min. sammeln das Pellet.
12. Verwenden Sie ein Exsikkator für 3 h um den Diethylether entfernen.
13. Fügen Sie 1 mL 50 % Acetonitril auf Wasser und lösen sich die grobe Peptide. Lyophilize die Lösung um Trifluoroacetic Säure zu entfernen. Wiederholen Sie diesen Schritt mehrmals.
14. Reinigen Sie die Peptide mit einer C18 Patrone Spalte.
    1. Aktivieren Sie das Harz in der C18 Patrone Spalte mit 3 mL Acetonitril (ACN).
    2. Equilibrate mit 5 mL 5 % ACN, 0,1 % TFA in H₂O.
    3. Laden Sie die rohe synthetische Peptide in der C18 Patrone Spalte.
    4. Waschen Sie mit 10 mL 5 % ACN, 0,1 % TFA in H₂O.
    5. Die Proben mit 3 mL 60 % eluieren ACN, 0,1 % TFA in H₂O.
15. Überprüfen Sie die Peptide durch die Messung ihrer Molekulargewicht mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie.
    1. Pipette 1 µL des Elutionsmittels auf eine Zieltafel. Fügen Sie sofort gesättigte α-Cyano-4-Hydroxycinnamic Säurelösung (CHCA) in 50 % Acetonitril in 0,1 % Trifluoroacetic Säure
    2. Kristallisieren Sie die Mischung durch Lufttrocknung.
    3. Massenspektren von Proben gemäß Protokoll des Herstellers das Instrument zu erwerben.
       1. Manuell einstellen der MALDI-TOF Massenspektrometer zu einer positiven Modus spiegeln.
       2. Kalibrieren Sie das Massenspektrometer mit CHCA, Bradykinin fragment 1-7 (Monoisotopic Molekulargewicht = 756.3997 Da), und Angiotensin II (Monoisotopic Molekulargewicht = 1,045.5423 Da).
       3. Die Massenspektren von synthetischen Peptiden zu erwerben, und dann durch den Vergleich mit den theoretischen Molekulargewicht bewerten.

2. Vorbereitung des Gewebes extrahiert

1. Männlichen ICR Mäuse in einer Isofluran Inhalation Kammer zu betäuben und Anästhesie Tiefe über Zeh kneifen zu überprüfen. Die Mäuse durch zervikale Dislokation einschläfern.
2. Mit Schere, machen Sie eine Mittellinie Bauchschnitt durch die Haut, die sich bis zum Xiphoid Prozeß.
3. Schnitt durch das Zwerchfell und sammeln Sie alle Lungengewebe. Schneiden Sie das Gewebe wird in kleine Stücke.
4. Waschen Sie das Gewebe dreimal mit eiskalten 50 mM Tris-gepufferte Kochsalzlösung (pH 7,4).
5. Wiegen Sie das Gewebe und Transfer ca. 100 mg Gewebe in ein Glasrohr 12 x 75 mm² .
6. Hinzugeben Sie 0,3 mL Extraktionspuffer (50 mM Tris-Puffer, pH 7,4, mit 0,1 % Poly (Oxyethylene) Octylphenyl Äther).
7. Die Lunge Gewebeproben mit einer Rührschüssel Homogenisator zu homogenisieren.
   1. Die Proben auf Eis abkühlen.
   2. Homogenisieren der Proben bei 20.000 u/min für 30 s in einen Mixer geben. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis die Proben völlig homogen sind.
      Hinweis: Homogenisieren Sie nicht länger als 1 Minute kontinuierlich, um eine Erhöhung der Temperatur zu vermeiden.
8. 1.000 µL der Homogenat eines 1,5 mL Tube und Zentrifuge für 5 min bei 10.000 x g bei 4 ° c zu übertragen
9. Eine neue 1,5 mL Kunststoffrohr übermitteln Sie 500 µL des Überstands.
10. Verwenden Sie 10 µL der Probe, um Proteinkonzentration, mit Methoden wie der Bicinchoninic Säure (BCA) oder Coomassie Brilliant Blue (CBB) Methode zu bestimmen.
11. Fügen Sie 80 % Glycerin um das Einfrieren zu verhindern hinzu, die Proben für eine Endkonzentration von 50 % Glycerin.
12. Speichern Sie die Proben bei-80 ° C bis zur weiteren Verwendung.

3. Verdauung von Substraten in Modell Protease und Gewebe-Extrakte

1. Fügen Sie 10 µL von 0,1 µg/µL des N-Tosyl-L-Phenylalanin Chloromethyl Keton (TPCK)-Trypsin, 0,1 µg/µL Staphylococcus Aureus V8 Protease oder 10 µg/µL Gewebe-Extrakte in 890 µL eines Puffers Verdauung.
   1. Verwenden Sie zur Klärung den Unterschied in der Protease Spezifität je nach der pH-Wert Puffer eingestellt auf pH 3, 5, 7 und 9. Die Zusammensetzung des Puffers Verdauung ist in Tabelle 3dargestellt.
   2. Führen Sie eine Negativkontrolle mit inaktiven Protease in Gewebe-Extrakte, Inkubation in kochendem Wasser (oder Heizung bei 100 ° C) für 10 min erstellt.
2. Fügen Sie 10 µL mit der Bezeichnung der Iminobiotin Substrate (aufgelöst in Dimethyl Sulfoxid (DMSO), Endkonzentration = 100 Pmol/10 µL).
3. 3 Stunden bei 37 ° C, mit der Bezeichnung der Iminobiotin Substrate zu verdauen inkubieren.
4. Stoppen Sie nach der Inkubation die Verdauung von Substraten mit kochendem Wasser (oder durch Erhitzen bei 100 ° C) für 10 min.
5. Zentrifugieren der verdauten Substrate für 5 min bei 10.000 x g bei 4 ° C.
6. Übertragen Sie den überstand in eine neue 1,5 mL Tube.

4. Reinigung des Substrats Iminobiotin beschriftet

1. Fügen Sie 50 µL 50 % Streptavidin-Sepharose-Kügelchen in 1 M Tris-Puffer (pH 9) mit 0,1 % poly(oxyethylene) Octylphenyl Äther.
   1. Verwenden Sie pH-Test-Papier, um sicherzustellen, dass die Lösung um pH 9 ist. Wenn der pH-Wert der Lösung niedrig ist, durch Zugabe von 1 M Tris-Puffer (pH 9) mit 0,1 % poly(oxyethylene) Octylphenyl Äther auf ca. pH 9 einstellen. Dieser Schritt ist wichtig, da es Bindung des Substrates Iminobiotin beschriftet Streptavidin beinhaltet.
2. Inkubation über Nacht bei 4 ° C mit kontinuierlichen schonendes mischen auf einem Rotator-Rad mit der Bezeichnung der Iminobiotin Substrate binden an die Streptavidin. Die Perlen sollten während der Inkubation schweben.
3. Zentrifuge für 1 min bei 10.000 x g bei 4 ° C. Den überstand zu entfernen.
4. Waschen Sie die Perlen fünfmal wie folgt:
   1. Die Perlen 1.000 µL einer Waschpuffer (50 mM Tris-Puffer, pH 9) hinzufügen.
   2. Für 10 min bei 4 ° C mit kontinuierlichen schonendes mischen auf einem Rotator Rad waschen. Die Perlen sollten während der Inkubation schweben.
   3. Für 1 min bei 10.000 x g bei 4 ° C zentrifugiert und den überstand zu entfernen.
5. Die Perlen 100 µL 0,2 % Trifluoroacetic Säure hinzufügen.
   1. Verwenden Sie pH-Test-Papier, um sicherzustellen, dass die Lösung unter pH 2. Wenn der pH-Wert der Lösung hoch ist, stellen Sie den pH-Wert auf unter 2 durch Zugabe von 1 % Trifluoroacetic Säure.
6. Inkubieren Sie für 30 min bei Raumtemperatur mit kontinuierlichen schonendes mischen auf einem Rotator-Rad.
7. Für 1 min bei 10.000 x g bei 4 ° C zentrifugiert, dann des Überstands auf eine neue 1,5 mL Tube.

5. Probieren Sie Vorbereitung und Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF-Massenspektrometrie)

Hinweis: Alle Lösungen in den folgenden Schritten sollten bereit sein, mit Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC)-Grade oder Aminosäure-Sequenzierung-Grade Wasser.

1. Pipette 500 µL Acetonitril auf C18 Harz zu aktivieren. Entfernen Sie die gebrauchte Acetonitril. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal.
2. Equilibrate C18 Harz mit 100 µL 0.1 % Trifluoroacetic Säure. Das Laufmittel zu entfernen. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal.
3. Um die Proben zu laden, binden Sie die Proben an das Harz mit einer Pipette.
4. Waschen Sie das Harz mit 20 µL 0.1 % Trifluoroacetic Säure. Wiederholen Sie diesen Schritt fünf Mal.
5. Eluieren Sie die Proben mit 3 µL 60 % Acetonitril in 0,1 % Trifluoroacetic Säure. Pipette Laufmittel auf eine Zieltafel für MALDI-TOF-Massenspektrometrie. Fügen Sie sofort gesättigte α-Cyano-4-Hydroxycinnamic Säurelösung (CHCA) in 50 % Acetonitril in 0,1 % Trifluoroacetic Säure.
6. Kristallisieren Sie die Mischung durch Lufttrocknung.
7. Massenspektren von Proben nach Instrument Hersteller Protokoll zu erwerben.
   1. Manuell einstellen der MALDI-TOF Massenspektrometer zu einer positiven Modus spiegeln.
   2. Kalibrieren Sie das Massenspektrometer mit CHCA, Bradykinin fragment 1-7 (Monoisotopic Molekulargewicht = 756.3997 Da), und Angiotensin II (Monoisotopic Molekulargewicht = 1,045.5423 Da).
   3. Die Massenspektren von Proben, aufmerksam auf die Massenspektren von 700 bis 900 Da für gespalten Form der Biotin-Label Substrate zu erwerben.
8. Identifizieren Sie die gefundenen Peaks mit Tabelle 1. Erkennung von entsprechenden Molekulargewicht zeigt Dekolleté am C-Terminus der entsprechenden Aminosäure.

Ergebnisse

Bewertung der Methode zur Identifizierung von Protease Spezifität durch Modell protease

Die Effizienz dieses Systems wurde bewertet mit TPCK-Trypsin und V8 Protease, dessen Substrat Besonderheiten gewonnen wurden. TPCK-Trypsin und V8 Protease wurden geschätzt, um die Aminosäure-Sequenz am C-Terminal von Lysin und Arginin-Rückständen und Carboxy seitlich der Asparaginsäure und Glutaminsäure Rückstände bzw. Spalten. Tabelle 1...

Diskussion

Dieses Protokoll verwendet MALDI-TOF-Massenspektrometrie Protease Spezifität in grobe Proben von Gewebe-Extrakte abgeleitet identifizieren und kann leicht für mehrere Probenverarbeitung hochskaliert werden. Vor allem manipuliert wir pH-Wert um eine Änderung im Substratspezifität bewirken.

Die Avidin-Biotin Komplex (ABC) Methode, die in der Biochemie aufgrund seiner Bindung Besonderheit verbreitet wurde in unserem Protokoll eingesetzt. Aufgrund der starken Affinität von ABC ist die Bindung von ...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Fmoc-NH-SAL-Harz(-[2,4-Dimethoxyphenyl-N-(9-fluorenylmethoxycarbonyl) aminomethyl]phenoxyharz)	Watanabe Chemical Co., Ltd.	A00102
N,N-Dimethylformamid (DMF)	Watanabe Chemical Co., Ltd.	A00185
Piperidin	Watanabe Chemical Co., Ltd.	A00176
Trinitrobenzolsulfonsäure (TNBS)	WAKO Chemical	209-1483
O-(6-Chlor-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-Tetramethyluroniumhexafluorphosphat (HCTU)	Watanabe Chemical Co., Ltd.	A00067
1-Hydroxy-1H-benzotriazol, Monohydrat (HOBt)	Watanabe Chemical Co., Ltd.	A00014
Diisopropylethylamin (DIPEA)	Watanabe Chemical Co., Ltd.	A00030
Triisopropylsilan (TIS)	Watanabe Chemical Co., Ltd.	A00170
Ethanedithiol (EDT)	Watanabe Chemical Co., Ltd.	A00057
Trifluoressigsäure (TFA)	Millipore	S6612278 403
Acetonitril	Kokusan Chemical	2153025
C18 Kartuschensäule	Wasser	WAT051910
Poly(oxyethylen)-octylphenylether	WAKO Chemical	168-11805	Triton X-100
Mischhomogenisator	Kinematica	PT3100	Polytron Homogenisator
Coomassie Brilliant Blue (CBB) -G250	Nakarai Chemical	094-09
Glycerin	Nakarai Chemical	170-18
N-Tosyl-L-phenylalanin, Chlormethylketon (TPCK)-trypsin,	Sigma-Aldrich	T1426
Dimethylsulfoxid (DMSO)	WAKO Chemical	043-07216
Streptavidin-Sepharose	GE Healthcare	17-511-01
ZipTipC18	Millipore	ZTC18S096
α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure (CHCA)	Sigma-Aldrich	C2020
MALDI-TOF Massenspektrometrie	Bruker Daltonics, Deutschland	autoflex
2-iminobiotin	Sigma-Aldrich	I4632
Fmoc-Aminosäuren	Watanabe Chemical Co., Ltd.