Hier präsentieren wir Ihnen Auszüge mit MALDI-TOF-Massenspektrometrie ein Protokoll Protease Spezifität im Rohöl Maus Gewebe zu bestimmen.
Methodenartikel
Hier präsentieren wir Ihnen Auszüge mit MALDI-TOF-Massenspektrometrie ein Protokoll Protease Spezifität im Rohöl Maus Gewebe zu bestimmen.
Proteasen haben mehrere biologische Funktionen, einschließlich der Proteinverdauung Aktivierung/Inaktivierung und Essen. Identifizieren Protease Spezifität ist wichtig für die Preisgabe von Protease Funktion. In dieser Studie die vorgeschlagene Methode bestimmt Protease Spezifität durch Messung des Molekulargewichts des einzigartigen Substrate mit Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionisation Time-of-Flight (MALDI-TOF) Massenspektrometrie. Die Substrate enthalten Iminobiotin, während die gespalten Site aus Aminosäuren besteht und das Distanzstück aus Polyethylenglykol besteht. Gespalten Substrat erzeugt eine einzigartige Molekulargewicht mit einer Aminosäure gespalten. Einer der Vorzüge dieser Methode ist, dass es in einen Topf mit groben Proben durchgeführt werden, und es eignet sich auch für die Beurteilung mehrerer Proben. In diesem Artikel beschreiben wir eine einfache experimentelle Methode optimiert mit Proben extrahiert aus Maus Lungengewebe, einschließlich Gewebe Extraktion, Platzierung des Verdauungssystems Substrate in Proben, Reinigung des Verdauungssystems Substrate unter verschiedenen pH-Bedingungen , und die Messung der Substrate Molekulargewicht mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie. Zusammenfassend lässt sich sagen erlaubt diese Technik für die Identifizierung von Protease Spezifität in grobe Proben abgeleitet von Gewebe-Extrakte mit MALDI-TOF-Massenspektrometrie, die leicht für mehrere Probenverarbeitung skaliert werden kann.
Proteasen regulieren die physiologischen Prozesse durch Spaltung von Proteinen, und die Einleitung der Protease-Aktivität zu bestimmten Zeiten und Orten geregelten1. Es ist daher wichtig, identifizieren die Expression und Aktivität des Gewebes, die lokal reguliert werden und eine neuartige Methode zur Erkennung von Proteasen zu entwickeln. Die Methode vorgeschlagen, dieser Studie soll Protease Spezifität parallel zur Erkennung von Proteasen zu ermitteln.
Es gibt einige Methoden zur Erkennung von Protease Spezifität. Die Azocasein Methode ist bekannt für seinen Gebrauch bei der Erkennung von Proteasen
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Tierische experimentelle Protokolle waren von der Nihon Pharmazeutische Universität Ethikkommission genehmigt und gemäß den Leitlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren der Nihon Pharmaceutical University durchgeführt. Das Protokoll wurde für die Gewebe-Extrakte von ICR Mäusen abgeleitet angepasst. ICR Mäuse wurden von Nippon SLC Ltd. (Shizuoka, Japan) gekauft.
1. Vorbereitung des Substrats Iminobiotin beschriftet
Das Substrat erfährt Festphasen-Synthese mit 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl-Gruppe (Fmoc)-geschützte Aminosäuren wie unten11beschrieben. Verwenden Sie Tabelle 2
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Bewertung der Methode zur Identifizierung von Protease Spezifität durch Modell protease
Die Effizienz dieses Systems wurde bewertet mit TPCK-Trypsin und V8 Protease, dessen Substrat Besonderheiten gewonnen wurden. TPCK-Trypsin und V8 Protease wurden geschätzt, um die Aminosäure-Sequenz am C-Terminal von Lysin und Arginin-Rückständen und Carboxy seitlich der Asparaginsäure und Glutaminsäure Rückstände bzw. Spalten. Tabelle 1.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Dieses Protokoll verwendet MALDI-TOF-Massenspektrometrie Protease Spezifität in grobe Proben von Gewebe-Extrakte abgeleitet identifizieren und kann leicht für mehrere Probenverarbeitung hochskaliert werden. Vor allem manipuliert wir pH-Wert um eine Änderung im Substratspezifität bewirken.
Die Avidin-Biotin Komplex (ABC) Methode, die in der Biochemie aufgrund seiner Bindung Besonderheit verbreitet wurde in unserem Protokoll eingesetzt. Aufgrund der starken Affinität von ABC ist die Bindung von .......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Die Autoren erklären keinen Interessenskonflikt.
Diese Arbeit wurde teilweise von Nihon Pharmaceutical University Research Grant von Nihon Pharmaceutical University (2016) und MEXT KAKENHI Grant Nummer JP17854179 unterstützt.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Fmoc-NH-SAL-Harz(-[2,4-Dimethoxyphenyl-N-(9-fluorenylmethoxycarbonyl) aminomethyl]phenoxyharz) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00102 | |
| N,N-Dimethylformamid (DMF) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00185 | |
| Piperidin | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00176 | |
| Trinitrobenzolsulfonsäure (TNBS) | WAKO Chemical | 209-1483 | |
| O-(6-Chlor-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-Tetramethyluroniumhexafluorphosphat (HCTU) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00067 | |
| 1-Hydroxy-1H-benzotriazol, Monohydrat (HOBt) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00014 | |
| Diisopropylethylamin (DIPEA) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00030 | |
| Triisopropylsilan (TIS) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00170 | |
| Ethanedithiol (EDT) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00057 | |
| Trifluoressigsäure (TFA) | Millipore | S6612278 403 | |
| Acetonitril | Kokusan Chemical | 2153025 | |
| C18 Kartuschensäule | Wasser | WAT051910 | |
| Poly(oxyethylen)-octylphenylether | WAKO Chemical | 168-11805 | Triton X-100 |
| Mischhomogenisator | Kinematica | PT3100 | Polytron Homogenisator |
| Coomassie Brilliant Blue (CBB) -G250 | Nakarai Chemical | 094-09 | |
| Glycerin | Nakarai Chemical | 170-18 | |
| N-Tosyl-L-phenylalanin, Chlormethylketon (TPCK)-trypsin, | Sigma-Aldrich | T1426 | |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | WAKO Chemical | 043-07216 | |
| Streptavidin-Sepharose | GE Healthcare | 17-511-01 | |
| ZipTipC18 | Millipore | ZTC18S096 | |
| α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure (CHCA) | Sigma-Aldrich | C2020 | |
| MALDI-TOF Massenspektrometrie | Bruker Daltonics, Deutschland | autoflex | |
| 2-iminobiotin | Sigma-Aldrich | I4632 | |
| Fmoc-Aminosäuren | Watanabe Chemical Co., Ltd. |
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden
Genehmigung beantragen