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Summary

Dieses Protokoll zeigt ein sicheres und effizientes Verfahren zur CD133 ändern⁺ Hämatopoetischen Stammzellen. Der vorgestellte nicht-viralen, magnetische Polyplex basierenden Ansatz kann eine Grundlage für die Optimierung der therapeutischen Stammzellen Effekte sowie für die Überwachung der verabreichten Zelle Produkt per Magnet-Resonanz-Tomographie bilden.

Abstract

Während CD133⁺ Hämatopoetischen Stammzellen (SCs) erwiesen sich als um hohes Potenzial auf dem Gebiet der regenerativen Medizin zu bieten, ihre geringe Abscheideraten nach Injektion in das verletzte Gewebe sowie die massive beobachtete Sterbeziffern führen zu sehr eingeschränkten therapeutischen Wirkungen. Um diese Einschränkungen zu überwinden, haben wir versucht, ein nicht-viralen basierte Protokoll für geeignete Zelle Engineering vor ihrer Verwaltung zu etablieren. Die Änderung der menschlichen CD133⁺ mit dem Ausdruck SCs mit magnetischen Polyplexes MicroRNA (MiR) geladen richtete sich in Bezug auf die Aufnahme-Effizienz und Sicherheit sowie das targeting Potential der Zellen. Unter Berufung auf unserem Protokoll, erreichen wir hohe MiR Inanspruchnahme von 80 – 90 %, während die CD133⁺ Stammzelle Eigenschaften bleiben unberührt. Darüber hinaus bieten diese veränderten Zellen die Möglichkeit der magnetischen Ausrichtung. Wir beschreiben hier ein sicheres und hoch effiziente Verfahren für die Änderung von CD133⁺ SCs. Wir erwarten, dass dieser Ansatz zu eine Standardtechnologie zur Optimierung der therapeutischen Stammzellen Effekte sowie für die Überwachung des Messguts verabreichten Zelle per Magnetresonanztomographie (MRT) zur Verfügung zu stellen.

Introduction

CD133⁺ SCs repräsentieren eine heterogene Zellpopulation Stamm- und Vorläuferzellen mit vielversprechenden Potential für die regenerative Medizin. Ihre myogen hämatopoetischen und endothelialen Differenzierung möglicher^1,2,3 ermöglicht die CD133⁺ Zellen, z. B., Beitrag zur Neovaskularisation Prozesse durch eine Differenzierung in Schiffen und Aktivierung der Pro-angiogenen Signalisierung durch Parakrine Mechanismen^4,5,6,7neu bilden.

Trotz ihres hohen Potenzials in mehr als 30 genehmigten klinischen Studien (ClinicalTrails.gov) gezeigt ist ihre therapeutische Ergebnis noch unter kontroverse Diskussion⁴. In der Tat wird eine klinische Anwendung der SCs durch niedrige Retention in der Orgel von Zinsen und massive erste Zelle Tod^5,8,9behindert. Weitere engineering von CD133 könnte helfen, diese Herausforderungen zu meistern⁺ SCs vor Transplantation.

Eine Voraussetzung für eine effiziente Zelltherapie wäre die Reduktion von den massiven erste Zelltod, das Engraftment therapeutisch relevanten Zellen¹⁰zu verbessern. Aktuelle Studien zeigten eine immense Zellverlust von 90-99 % in höchst PERFUNDIERTEN Organen wie Gehirn und Herz während der ersten 1 – 2 Std., unabhängig von der Art der transplantierten Zellen oder Anwendung route^{11,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21}. SC Kennzeichnung mit magnetischen Nanopartikeln (MNPs) ermöglicht eine innovative nicht-invasive Strategie an Zielzellen auf der Website von Interesse^{22,23,24,25,26} und gleichzeitig ermöglicht die Handy Überwachung mittels MRI²⁷ und magnetic Particle imaging (MPI). Die effizienteste in Vivo Studien Anwendung magnetisierten Zelle gezielt verwendete Zelle Aufbewahrung nach der lokalen Verabreichung bevorzugt Zelle Führung nach intravenöser Injektion^23,24,28 . Daher entwickelt unsere Gruppe ein Delivery-System bestehend aus superparamagnetischen Eisenoxid-Nanopartikeln²⁹. Mit dieser Technik, CD133⁺ SCs und menschlichen nabelader Endothelzellen (Mediumwechsel) effizient ausgerichtet sein könnte, wie durch in-vitro- Versuche^30,31.

Eine weitere Hürde für SC-Therapien ist die feindlichen entzündlichen Umgebung des betroffenen Gewebes nach der Transplantation, die auf die erste Zelle Tod³²beiträgt. Neben mehreren Vorkonditionierung Studien war die Anwendung der therapeutischen relevanten MiRs getesteten³³; Es wurde erfolgreich nachgewiesen, dass Anti-apoptotische MiRs Apoptose in Vitro hemmen und Zelle Engraftment in Vivo³³verbessern. Diese kleinen Moleküle, bestehend aus 20 – 25 Nukleotide, spielen eine entscheidende Rolle als posttranskritionelle Modulatoren der Messenger-RNAs (mRNAs) und beeinträchtigen somit Stammzellen Schicksal und Verhalten³⁴. Darüber hinaus die exogene Einführung MiRs vermeiden unerwünschte stabile Integration in die Host-Genom-³⁴.

Aktuelle Versuche zur effizienten Einführung von Nukleinsäuren (NAs) in primäre SCs basieren meist auf rekombinante Viren^8,35. Trotz der hohen Transfektion Effizienz stellt rekombinanten Virus Manipulation ein großes Hindernis für eine Bank-zu-Bett-Übersetzung, z.B.unkontrollierbare Genexpression, Pathogenität, Immunogenität und insertional Mutagenese^{35 ,36}. Nicht-viralen-Delivery-Systeme wie Polymer-basierten Konstrukte sind daher kritisch zu entwickeln. Unter denen Polyethylenimine (PEI) stellt eine gültige Lieferfahrzeug bietet Vorteile für MiRs wie NA Kondensation zum Schutz vor Abbau, zelluläre Aufnahme und intrazellulären Freigabe durch Endosomal entgehen^37,38. Darüber hinaus zeigte MiR-PEI-komplexe eine hohe Biokompatibilität in klinischen Studien³⁹. Unser Liefersystem besteht also aus einem biotinylierte verzweigten 25 kDa PEI gebunden zu einem Streptavidin beschichteten MNP-Kern^30,31,40.

In diesem Manuskript präsentieren wir ein umfassendes Protokoll beschreiben (i) die manuelle Isolierung von CD133⁺ SC aus menschlichen Knochenmark (BM) Spende mit einer ausführlichen Charakterisierung von SC Produkt- und (Ii) ein effizientes und schonendes Transfektion von einem magnetisch nicht-viralen Polymer-basierten Liefersystem für gentechnische Veränderung von CD133⁺ SCs mit MiRs. CD133⁺ SCs sind isoliert und magnetisch aus menschlichen sternale BM Aspiraten mit einer Oberfläche Antikörper-basierten magnetisch aktivierte Zelle Sortieranlage (MACS) angereichert. Danach sind die Zellviabilität sowie die Zelle Reinheit mit Durchflusszytometrie analysiert. Folge MiR/PEI/MNP-komplexe sind vorbereitet und CD133⁺ SCs sind transfiziert. 18 h nach Transfektion, die Aufnahme-Effizienz und die Auswirkungen der Transfektion auf SC Marker Ausdruck und Zelle überleben werden analysiert. Darüber hinaus erfolgt Bewertung der intrazelluläre Verteilung der Transfektion komplexer Verbindungen mit vierfarbigen Kennzeichnung und strukturierte Beleuchtung Mikroskopie (SIM).

Protocol

Sternale menschlichen BM für Zelle isoliert war informierte Spender entnommen, schenkte ihr schriftliche Einverständnis, ihre Proben für die Forschung nach der Deklaration von Helsinki zu verwenden. Die Ethikkommission der Universität Rostock hat die Studie (VO Nr. A 2010 23, im Jahr 2015 verlängert) genehmigt.

1. Zelle-Vorbereitung

Hinweis: Verwenden Sie Heparin Natrium (250 IU/mL BM), Koagulation für BM Prüfung zu verhindern.

1. CD133⁺ SC Isolierung
   1. Vorbereitung der erforderlichen Lösungen
      1. Bereiten Sie Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) / Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) stock Lösung (2 mM) durch das Mischen von 996 mL 1 X PBS mit 4 mL EDTA (0,5 M). Kräftig mischen Sie die Lösung und Filtrat mit einem 0,45 µm-Filter. Lagerung bei Raumtemperatur (RT).
      2. Bereiten Sie den MACS-Puffer durch das Mischen von 995 mL 2 mM PBS/EDTA mit 5 g Rinderserumalbumin (BSA). Kräftig mischen Sie die Lösung und Filtrat mit einem 0,45 µm-Filter. Shop bei 4 ° C.
      3. Bereiten Sie Kollagenase B-Stammlösung (40 mg/mL), 500 mg Kollagenase B (von Clostridium Histolyticum) in 12,5 mL PBS verdünnen. Kräftig mischen Sie die Lösung, Aliquote von 350 µL und die Lagerung bei-20 ° C.
      4. Bereiten Sie Deoxyribonuclease (DNAse) ich Lager Lösung (10 mg/mL) durch Verdünnung 100 mg der DNase I (aus bovine Bauchspeicheldrüse) in 10 mL PBS. Kräftig mischen Sie die Lösung, Aliquote von 350 µL und die Lagerung bei-20 ° C.
   2. Enzymatische Verdauung von menschlichen BM
      1. Vorwärmen der menschlichen Lymphozyten Mittel-bis RT und Enzyme (1 Aliquot jeder Kollagenase B und DNAse pro 20 mL BM) Auftauen.
      2. Sammle die BM von Spritzen in ein 50 mL konische Röhrchen und vorsichtig mischen. Entsorgen Sie alle vorhandenen Klumpen.
         Hinweis: Übertragen Sie 200 µL unverdünnte BM in einem 1,5 mL-Tube für nachfolgende durchflusszytometrischen Analyse. Bei 4 ° C bis zur Verwendung aufbewahren.
      3. 10 mL BM in ein neues 50 mL konische Röhrchen überführen, fügen Sie 6 mL PBS/EDTA (2 mM), 20 mL von menschlichen Lymphozyten Medium, 175 µL Collagenase B (40 mg/mL) und 175 µL der DNAse ich (10 mg/mL). Vorsichtig mischen Sie die Lösung und inkubieren Sie für 30 min bei RT in einen Shaker geben. Wiederholen Sie für die verbleibenden BM-Probe.
   3. Dichte-Gradienten-Zentrifugierung
      1. Prime ein 50 mL Dichte Gradienten Zentrifugation Rohr durch die Anwendung 15 mL des menschlichen Lymphozyten Trennung Medium in ein 50 mL-Tube. Zentrifuge bei 1.000 X g für 30 s.
      2. Sorgfältig Schicht 35 mL verdünnten BM auf dem Dichte-Gradienten-Zentrifugierung Kerzenfilter und Zentrifuge bei 445 X g für 35 min bei RT
         Hinweis: Zentrifuge Einstellungen sind niedrige Beschleunigung (3) und keine Bremse (1).
      3. Entfernen Sie vorsichtig den Schlauch aus der Zentrifuge ohne schütteln. Entsorgen Sie sorgfältig ~ 20 mL aus der oberen klare Lösung ohne die trübe Schicht direkt auf den Filter.
      4. Vorsichtig die trübe Schicht (die direkt auf den Filter und enthält die mononukleären Zellen (MNU)) in ein neues 50 mL konische Röhrchen zu übertragen und mit PBS/EDTA zu einem Endvolumen von 50 mL auffüllen.
         Hinweis: Kombinieren Sie alle MNCs aus einer Patientenprobe BM in eine neue Röhre.
      5. Zählen Sie die multinationalen Konzerne durch die Übertragung von 10 µL Zellsuspension 50 mL in einem 1,5 mL-Tube. Fügen Sie 10 µL 3 % Essigsäure mit Methylenblau. Vorsichtig mischen Sie und Auftragen Sie 10 µL in einer Zählkammer. Berechnen Sie die Anzahl der multinationalen Konzerne.
      6. Zentrifuge die MNC Aussetzung bei 300 X g für 10 min. verwerfen den überstand.
         Hinweis: Bei der Zentrifugation, Abkühlen der Zentrifuge von RT bis 4 ° C.
   4. Magnetische Auswahl von CD133⁺ SCs mit menschlichen CD133 Antikörper verbunden superparamagnetischen Dextran Eisenteilchen
      Hinweis: Während dieses Schrittes arbeiten Sie auf Eis. Shop-Lösungen bis zur Verwendung bei 4 ° C. Speichern Sie MACS Permanentmagnet, Trennsäulen und Vorabscheidung Filter bei 4 ° C.
      1. Wählen Sie die Spaltengröße. Für < 1,2 x 10⁸ MNCs, Nutzung MS Spalten und für > 1,2 x 10⁸ MNCs verwenden LS Spalten (siehe Tabelle der Materialien).
      2. Um magnetische Auswahl 1 x 10⁸ Ergebniszelle Anzahl vorzubereiten, sorgfältig Aufschwemmen MNCs in 300 µL MACS-Puffer (4 ° C). Fügen Sie 100 µL FcR blocking Reagenz (4 ° C) und 100 µL CD133 Antikörper verbunden superparamagnetischen Dextran Eisenpartikel (4 ° C).
      3. Vorsichtig mischen Sie die Zellsuspension und 30 min bei 4 ° c inkubieren Schütteln Sie die Zellsuspension während der Inkubation (2 – 3 X).
      4. Fügen Sie 2 mL MACS-Puffer (4 ° C) pro 1 x 10⁸ insgesamt MNCs. sanft die Zellsuspension und Zentrifuge bei 300 X g für 10 min bei 4 ° c-Mix
      5. MACS Magnet Holder richten Sie ein und zuordnen Sie der MACS Permanentmagnet. Installieren Sie die Spalte MACS zu und wenden Sie die Vorabscheidung Filter an, an der Spitze.
      6. Equilibrate der ersten MACS MS/LS-Spalte und Vorabscheidung Filter mit 0,5 mL (MS) oder 3 mL (LS) MACS-Puffer (4 ° C).
         Hinweis: Lassen Sie niemals die MACS Spalten nach Gleichgewichtherstellung austrocknen.
      7. Den überstand verwerfen und Aufschwemmen der erhaltenen Pellet in 500 µL Puffer MACS (4 ° C) pro 1 x 10⁸ Ergebniszelle Betrag. Die Zellsuspension in der Vorabscheidung Filter anwenden.
      8. Waschen Sie den MACS Spalte und Vorabscheidung Filter dreimal mit jedem Waschgang 0,5 mL (MS) oder 3 mL (LS) MACS-Puffer (4 ° C).
         Hinweis: Während der dritten Waschschritt installieren eine zweite Spalte von MACS in den MACS-Permanent-Magneten und equilibrate der zweiten Spalte der MACS MS/LS mit 0,5 mL (MS) oder 3 mL (LS)-MACS-Puffer (4 ° C).
      9. Entsorgen Sie die Vorabscheidung Filter.
      10. Eluieren Zelle Bruchteil direkt auf die zweite Säule der MACS: 1 mL (MS) oder 5 mL (LS) MACS-Puffer (4 ° C) auf die ersten MACS Säule vom hinzufügen und entfernen die MACS Spalte die MACS-Permanent-Magnet. Sofort die erste MACS Spalte oberhalb der zweiten Spalte des MACS zu übertragen und die Zellsuspension durch die MACS-Säule mit der mitgelieferten Kolben schieben.
      11. Waschen der MACS Spalte dreimal, mit jedem Waschgang 0,5 mL (MS) oder 3 mL (LS) MACS-Puffer (4 ° C).
      12. Eluieren Sie die Zelle-Fraktion aus der Spalte durch Zugabe von 1 mL (MS) oder 5 mL (LS) MACS-Puffer (4 ° C) auf die zweite Säule der MACS und entfernen die MACS-Spalte aus der MACS Permanentmagnet. Sofort die zweite Spalte der MACS über einen 1,5 mL-Tube (MS) oder 15 mL konische Rohr (LS) zu übertragen und die Zellsuspension durch die MACS-Säule mit der mitgelieferten Kolben schieben.
      13. Zentrifuge bei 300 X g für 10 min bei 4 ° C. Sorgfältig überstand verwerfen und erneut das erhaltene Pellet in 100 µL Puffer MACS (4 ° C).
      14. Zählen die CD133⁺ Zellen: Transfer 6 µL Zellsuspension in einem 1,5 mL-Tube. Fügen Sie 6 µL Trypan blau Lösung (0,4 %). Vorsichtig mischen Sie und Auftragen Sie 10 µL in einer Zählkammer. Berechnen Sie die Anzahl von CD133⁺ Zellen.
      15. Speichern der CD133⁺ Zellen auf Eis bis zu säen.
2. Charakterisierung von frisch isolierte CD133⁺ SCs
   Hinweis: Die folgende Arbeiten sollten in einem Raum, geschützt von hellem Licht (nur schwache Beleuchtung) durchgeführt werden. Halten Sie Rohre, Puffer und Antikörper auf Eis, sofern nicht anders angegeben.
   1. Vorbereitung des SCs durchflusszytometrischen Analyse
      1. Verwenden Sie zwei Proben (jeweils 10 µL) BM Aliquote und eine Probe des frisch isolierte CD133⁺ SCs (mindestens, 1 x 10-⁴ LiPo-Zellen) für die Analyse. Übertragen Sie die Zellen in einem 1,5 mL-Tube. Fügen Sie 10 µL blocking Reagenz FcR und füllen Sie sich mit MACS-Puffer (4 ° C) auf ein Volumen von 33 µL.
      2. Fügen Sie die folgenden Antikörper auf der Innenseite des jeweiligen Rohr (siehe Tabelle 1): Anti-CD34-Fluorescein erfolgt (FITC) (Klon: AC136), Anti-CD133/2-Phycoerythrin (PE) (Klon: 293 (3), Isotype Steuern Maus IgG 2 b-PE, Anti-CD45-Allophycocyanin () APC)-H7 (Klon: 2D 1), und 7-Aminoactinomycin (AAD). Nachdem alle Antikörper hinzugefügt haben, schütteln Sie Antikörper Schattenseite des Rohres. Vorsichtig mischen Sie die Lösung (50 µL Endvolumen) und 10 min bei 4 ° c inkubieren
      3. Fügen Sie 1 mL 1 X Rote Blutzelle (RBC) Lysis Puffer, sanft vermischen Sie die Aussetzung und auf Eis 10 min. Zentrifuge die Aussetzung bei 300 X g für 10 min bei 4 ° c inkubieren
      4. Den überstand verwerfen und Aufschwemmen der erhaltenen Pellet in 100 µL PBS (4 ° C). Speichern Sie auf Eis bis durchflusszytometrischen Analyse.
   2. Durchflusszytometrischen Analyse von CD133 fließen⁺ SCs
      1. Die Zellviabilität und Reinheit von CD133 prüfen⁺ SC, verwenden Sie eine angepasste internationale Gesellschaft der Hematotherapy und Graft Engineering (ISHAGE) Flow Cytometry gating Strategie⁴¹ (siehe die repräsentative Darstellung in Abbildung 1). Verwenden Sie die folgende Reihenfolge:
         Schritt 1: Auswahl der Zellpopulation (Abbildung 1A)
         Schritt 2: Auswahl der CD45⁺ Zellen (Abbildung 1 b)
         Schritt 3: Auswahl der lebensfähigen CD45⁺ Zellen (Abbildung 1)
         Schritt 4: Auswahl der lebensfähigen CD45⁺/CD34⁺ Zellen (Abbildung 1)
         Schritt 5: Auswahl der lebensfähigen CD45⁺/CD34⁺/CD133⁺ Zellen (Abbildung 1E)
         Durchflusszytometer ausführen (siehe Tabelle der Materialien) entsprechend den Anweisungen des Herstellers.
      2. Berechnen Sie die Zellviabilität und Reinheit mit den folgenden Gleichungen:

   Gleichung 1

   Gleichung 2

3. Zellkultur von frisch isolierte CD133⁺ SCs
   1. Aliquoten 100 x rekombinanten menschlichen Zytokin in 100 µL-Aliquots ergänzen und speichern bei-20 ° C. Tauwetter ein 100 X aliquoten vor der mittleren Aufbereitung.
   2. Vorbereiten der CD133⁺ SC Kulturmedium, serumfreien hämatopoetischen Zellen Erweiterung Medium mit rekombinanten menschlichen Zytokin-Ergänzung (letzte 1 X) und 1 % Penicillin/Streptomycin ergänzt.
   3. Samen 5 x 10⁴ frisch isolierte CD133⁺ SCs zur Transfektion in einer 24-Well-Platte mit 500 µL Kulturmedium. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C, 5 % CO₂ und 20 % O₂.
      Hinweis: Samen 5 x 10⁴ frisch isolierte CD133⁺ SCs als Steuerelement für durchflusszytometrischen Analyse.

2. Vorbereitung der Transfektion komplexe

Hinweis: Bei diesem Schritt halten die gesamte Arbeit Raum Ribonuklease (RNAse)-freie RNAse Dekontaminationslösung mit und verwenden Sie nur RNAse-freie Verbrauchsmaterial.

1. Vorbereitung von miR
   Hinweis: Die folgende Arbeiten sollten in einem Raum, geschützt von hellem Licht (nur schwache Beleuchtung) durchgeführt werden.
   Hinweis: für die MiR-Probe: Verwendung Cyanin 3 Farbstoff mit der Bezeichnung Vorläufer MiR und unbeschriftete Vorläufer MiR.
   1. Um MiR Stammlösung (50 µM) vorzubereiten, verdünnen Sie die gewünschte Menge an MiR in das entsprechende Volumen der Nuklease-freies Wasser (z. B.verdünnte 5 Nmol von MiR in 100 µL Wasser). Vorsichtig mischen Sie die Lösung, aliquoten MiR Lager (5 µL) und speichern unter-20 ° C.
2. Vorbereitung von PEI
   1. Vorbereiten der PEI nach Standardprotokollen und Erläuterung der PEI Lager Konzentration^31,42 .
3. Vorbereitung der MNP
   1. Bereiten Sie die MNPs nach Standardprotokollen und beachten Sie die MNP Lager Konzentration^31,42.
4. Vorbereitung von MiR/PEI-komplexe
   1. Bereiten Sie 5 % Glukoselösung durch Verdünnung d-(+)-Glukose im Nuklease-freies Wasser. Vorsichtig mischen Sie die Lösung, aliquoten Lager (1,5 mL), und bei 4 ° c Lagern
      Hinweis: Die folgende Arbeiten sollten in einem Raum, geschützt von hellem Licht (nur schwache Beleuchtung) durchgeführt werden.
   2. Verwenden Sie 20 Pmol MiR pro Bohrloch von einer 24-Well-Platte-³⁰. Verdünnen Sie MiR in die 5 % Glukose-Lösung, um eine Endkonzentration von 0,25 Pmol MiR/µL.
   3. Berechnen Sie die Höhe der erforderlichen PEI anhand der MiR Betrag (20 Pmol, Step 2.3.1) und optimale Stickstoff (PEI), Phosphat (von MiR) (N/P) Verhältnis der PEI-Lager-Konzentration (Schritt 2.2.1; hier ein Verhältnis von 7,5 verwendet wurde)³⁰. Verdünnen Sie die PEI in gleicher Höhe von 5 % Glukoselösung verdünnt werden anhand der Gleichung:
      
      die ordnet an
          Gleichung 3
      wo PEI Volumen in µL und [PEI] ist in mM und N/P (optimiert für dieses Protokoll) ist 0,75. 0.12 ist ein Umrechnungsfaktor zu MiR.
   4. Fügen Sie die vorverdünnt PEI in vorverdünnt MiR und Wirbel für 30 s.
   5. Inkubieren Sie die MiR/PEI-Komplex für 30 min bei RT
5. Vorbereitung der MiR/PEI/MNP-komplexe
   Hinweis: Die folgende Arbeiten sollten in einem Raum, geschützt von hellem Licht (nur schwache Beleuchtung) durchgeführt werden.
   1. Während der Inkubation bereiten MiR/PEI-komplexe, die MNPs durch beschallen MNPs für 20 min bei 35 kHz in der Beschallung Wasserbad bei RT um sicherzustellen, dass die Partikel in der Schwebe sind und nicht aggregiert.
   2. Berechnen Sie die Anzahl der erforderlichen MNPs (Eisen 3 µg/mL) basierend auf der MNP-Stammlösung (Schritt 2.3.1).
   3. Fügen Sie den beschallten MNPs in MiR/PEI-komplexe und Vortex für 30 S. Incubate MiR/PEI/MNP-komplexe für 30 min bei RT
6. Vorbereitung der Transfektion komplexe für vierfarbige Kennzeichnung mit SIM
   Hinweis: Verwenden Sie unbeschriftete Vorläufer MiR.
   1. Beschriften Sie die MiR mit Cyanin 5 Farbstoff eine Cyanin 5 Farbstoff MiR labeling kit (siehe Tabelle der Materialien) nach den Anweisungen des Herstellers. Die letzte MiR Konzentration mit den aufgeführten Spektralphotometer Messen (siehe Tabelle der Materialien) in Übereinstimmung mit der Voreinstellung des Herstellers (Nukleinsäure RNA-40). Teilprobe, die MiR (5 µL) und Speicher bei-80 ° C vor Licht geschützt.
   2. Beschriften Sie die PEI mit einem hellen grün fluoreszieren Farbstoff eine entsprechende Protein-Kennzeichnung kit (siehe Tabelle der Materialien) nach den Anweisungen des Herstellers. Definieren Sie die Endkonzentration PEI unter Verwendung der Ninhydrin–Assay (Schritt 2.2.1). Aliquot der PEI (im Volumen berechnet je nach Gleichung 3) und bei 4 ° C, vor Licht geschützt aufbewahren.
   3. Beschriften Sie die MNPs mit Rhodamin Farbstoff konjugiert, Biotin mit einem Verhältnis von 1:1,000 w/w, Färben Sie, MNP. Der Farbstoff Rhodamin und MNPs zeitgleich mit der Vorbereitung der MiR/PEI-Komplexbildung mischen und die Lösung für 30 Minuten im Dunkeln inkubieren. Beschriftete MNPs nicht direkt verwenden.

3. die Transfektion von CD133⁺ SCs

Hinweis: Bei diesem Schritt halten die gesamte Arbeit Raum Ribonuklease (RNAse)-freie RNAse Dekontaminationslösung mit und verwenden Sie nur RNAse-freie Verbrauchsmaterial
Hinweis: Die folgende Arbeiten sollten in einem Raum, geschützt von hellem Licht (nur schwache Beleuchtung) durchgeführt werden.

1. Fügen Sie den vorbereiteten MiRNA/PEI/MNP-Komplex tropfenweise direkt in den entsprechenden Brunnen mit der frisch isolierte CD133⁺ SCs in Kulturmedium.
2. Mischen Sie leicht von der Platte hin und her schaukeln. Inkubieren Sie die Zellen für 18 h bei 37 ° C, 5 % CO₂ und 20 % O₂.

4. Analyse der MiR Transfektion

1. Prüfung der MiR Aufnahme Effizienz und der Zytotoxizität von Transfection komplexe
   Hinweis: für die MiR-Probe: Cyanin 3 Farbstoff mit der Bezeichnung Vorläufer MiR zur Aufnahme Bewertung und nicht transfizierten CD133 verwenden⁺ SCs für die Flow Cytometry Kontrolle Tore.
   Hinweis: Die folgende Arbeiten sollten in einem Raum, geschützt von hellem Licht (nur schwache Beleuchtung) durchgeführt werden.
   Hinweis: Halten Sie die Rohre, Puffer und Antikörper auf Eis, sofern nicht anders angegeben.
   1. Vorbereiten der Paraformaldehyd-Stammlösung (PFA, 4 %) durch 4 g PFA in 100 mL PBS verdünnen und Heizlösung bis 80 ° C. Kräftig mischen Sie die Lösung und stellen Sie den pH-Wert auf 7,3. Aliquoten die PFA (1,5 mL) auf Lager und Lagerung bei-20 ° C.
   2. 18 h nach Transfektion sammeln jedes gut in eine separate 1,5 mL tube. Jeder auch einmal mit 500 µL PBS waschen und diese Zellsuspension auf das gleiche Rohr übertragen.
   3. Zentrifuge bei 300 X g für 10 min bei 4 ° C. Den überstand verwerfen und Aufschwemmen der erhaltenen Pellet in 100 µL 4 ° C-MACS-Puffer.
   4. Hinzufügen von 0,5 µL einer Amin Reaktivfarbstoffen unterscheiden zwischen lebenden und toten Zellen, sanft die Aussetzung zu mischen und 10 min bei 4 ° c inkubieren Fügen Sie 1 mL PBS (4 ° C) und Zentrifuge bei 300 X g für 10 min bei 4 ° C.
   5. Den überstand verwerfen, Aufschwemmen der erhaltenen Pellet in 100 µL PBS, 33 µL PFA (4 %) hinzufügen und speichern auf Eis oder bei 4 ° C bis durchflusszytometrischen Analyse.
   6. Ordnen Sie die gating-Strategie entsprechend der repräsentative Darstellung in Abbildung 2. Die Proben laufen auf das Durchflusszytometer (siehe Tabelle der Materialien) entsprechend den Anweisungen des Herstellers.
2. Charakterisierung von MiR transfiziert CD133⁺ SCs
   Hinweis: Verwendet unbeschriftete Vorläufer MiR als auch nicht-transfizierten CD133⁺ SCs für Flow Cytometry Kontrolle Tore.
   1. Sammeln nun jeweils in einer separaten 1,5 mL Tube und Zentrifugieren bei 300 X g für 10 min bei 4 ° C.
   2. Verwenden Sie die gating Strategie, wie unter Punkt 1.2 beschrieben.
3. Prüfung der intrazelluläre Verteilung der Transfektion komplexe von SIM
   1. Bereiten Sie die komplexe und transfizieren Sie die Zellen zu, wie in Abschnitt 2 und Abschnitt 3 beschrieben.
   2. 18 h nach der Transfektion sammeln jedes gut in eine separate 1,5 mL tube. Jeweils auch einmal mit 500 µL PBS waschen und die Wäsche in den Brunnen jeweiligen Rohr übertragen. Zentrifuge bei 300 X g für 10 min bei 4 ° C.
   3. Den überstand verwerfen Aufschwemmen der erhaltenen Pellet in 1 mL 2 % fetalen bovine Serum (FBS) mit PBS-Puffer, sanft mischen die Aussetzung und Zentrifugieren bei 300 X g für 10 min bei 4 ° C.
   4. Den überstand verwerfen, Aufschwemmen der erhaltenen Pellet in 100 µL PBS und 33 µL PFA (4 %) für 20 min hinzufügen.
   5. Übertragen Sie die Zellsuspension in eine neue 24-Kultur-Platte mit sterilen Glasdeckgläser und Zentrifuge bei 300 X g für 10 min bei 4 ° C.
   6. Den überstand verwerfen und 500 µL PBS hinzufügen. Schütteln Sie die Platte und verwerfen Sie PBS zu.
   7. Die mikroskopische Dias mit wässrigen Eindeckmittel zur Erhaltung der Fluoreszenz und trocknen Sie sie für mindestens 1 h bei RT setzen Sie bereiten Deckgläsern auf.
   8. Bilder mit einem 100 X Öl Immersion Ziel zu erwerben. SIM-Einstellungen: 405, 488, 561 und 633 nm Laser-Linien für Anregung und Z-Stacks mit einer 16-Bit-Tiefe im 3 Winkel, 3 Phasen, mit durchschnittlich 4, Rastern pro Laserlinie: 23 µm – 405, 34 µm – 488, 42 µm – 561, 51 µm – 633.

Representative Results

Discussion

In den letzten Jahren, CD133⁺ SCs entstanden als eine viel versprechende Zellpopulation für SC-basierte Therapien wie von mehreren phase I, II und III klinischen Studien^{43,44,45,46, 47 , 48 , 49 , 50 , 51 , 52 , 53 , 54}. hier, stellen wir Ihnen ein detailliertes Protokoll für die standardisierte manuelle Reinigung und Flow durchflusszytometrischen Charakterisierung dieser Zellen aus menschlichen sternale BM. Das beschriebene Mac-basierte Isolation-Verfahren stellt eine sanfte, schnelle und effiziente Strategie ein hochreines, tragfähige hämatopoetischen SC Bruch zu erhalten. Die gute Verträglichkeit in Kombination mit dem schnellen Abbau der Co eingespritzte MACS MicroBeads für Zellsortierung verwendet wurde zuvor von unserer Gruppe^55,56nachgewiesen.

Diese Isolierung-Verfahren wurde entwickelt, mit menschlichen sternale BM als Ausgangsmaterial, und daher das Protokoll derzeit ermöglicht Reinigung des hämatopoetischen SCs für den Gebrauch in der präklinischen Forschung. Wenn CD133⁺ SCs sind isoliert von anderen Geweben (z. B. BM Beckenkamm entnommen) mehrere Schritte des Protokolls wie z. B. Gewebe der enzymatischen Verdauung und Dichte Zentrifugation können Anpassung erforderlich. Für klinische Zelle Anwendung, wurde unsere Gruppe weiter ein GMP-konformen vor-Ort-Fertigungsverfahren verwenden die ein automatisches System um zusätzliche Ansprüche im Namen von klinischen braucht⁵⁷.

Engineering von SCs vor deren Anwendung ist eine neuartige Strategie, SC-Therapie, einschließlich niedrige Zelle Retention und massive Zelltod bestimmte Hindernisse zu überwinden. Das aktuelle Protokoll umfasst Anweisungen zur Herstellung eines viral-freie multifunktionale Transfektion Systems basierend auf verzweigten PEI MNPs und seine effiziente Einführung in die CD133 gebunden⁺ SCs³⁰. Anwendung dieses Systems ermöglicht Zelle genetische Modifikation, magnetisch gesteuerte Zelle Führung und nicht-invasive Zelle Ablaufverfolgung über MRT oder MPI^{30,31,40,42,58 , 59 , 60}.

Wichtig ist, wurden die beschriebenen Transfektion Bedingungen für transiente gentechnische Veränderung von CD133 optimiert⁺ BM abgeleitet SCs³⁰. In früheren Werken wurde dieses Transfektion System für die Lieferung von Plasmid DNA und MiR auch erfolgreich auf andere Zelle Arten^31,40,60angewandt. Diese Experimente haben gezeigt, dass Transfektion Effizienz sowie Zytotoxizität Zelle typabhängig. Die optimale Kompositionen von NAs, PEI und MNPs müssen daher für jede Zelle definiert werden.

Aufgrund des hohen Wirkungsgrads ist PEI eine der am häufigsten verwendeten Polymere für nicht-viralen genetischen Zelle engineering-⁶¹. Die klinische Anwendung^61,62 von PEI ist jedoch wegen seiner allgemeinen Toxizität^61,63bisher sehr begrenzt. Interessanterweise zeigte unserer Gruppe vor kurzem, dass MNPs PEI Toxizität bei der Transfektion System^31,60reduzieren. Zur gleichen Zeit die mögliche Toxizität von Eisenoxid Basis Nanopartikeln verursacht durch die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) ist dosisabhängig und verschiedene Arten von superparamagnetischen Nanopartikeln sind zugelassen für MRI^64,65 . Allerdings muss die Aufmerksamkeit der Toxizität von System in Vitro und in Vivo.

Alles in allem ist das Protokoll sehr komplex, enthält viele wichtige Schritte, die sehr sorgfältig behandelt werden müssen. Zu diesem Zweck haben wir diese Punkte im Abschnitt “Protokoll” mit Noten hervorgehoben. Insbesondere möchten wir darauf hinweisen, wie wichtig eine völlig RNAse-freie Umgebung und jeder Lichteinfall zu vermeiden, beim Umgang mit der angewandten Fluoreszenzfarbstoffen.

Materials

7-AAD	BD Biosciences	559925
Acetic Acid with Methylene Blue	Stemcell Technologies	7060	3%
anti-CD133/2-PE (clone: 293C3)	Miltenyi Biotec GmbH	130-090-853
anti-CD34-FITC (clone: AC136)	Miltenyi Biotec GmbH	130-081-001
anti-CD45-APC-H7 (clone: 2D1)	BD Biosciences	560178
rhodamine dye; Atto 565 dye conjugated to biotin	ATTO-TEC GmbH	AD 565-71
BD FACS LSRII flow cytometer	BD Biosciences
BD FACSDiva Software 6.1.2	BD Biosciences
BSA	Sigma-Aldrich GmbH	A7906
CD133 antibody-linked superparamagnetic iron dextran particles; CD133 MicroBead Kit	Miltenyi Biotec GmbH	130-097-049
collagenase B	Roche Diagnostics GmbH	11088831001
counting chamber	Paul Marienfeld GmbH & Co. KG
Cyanine 3 dye labelled precursor miR; Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control #1	Ambion	AM17120
Cyanine 5 dye miR labelling kit; Cy5 dye Label IT miRNA Labeling Kit	Mirus Bio	MIR 9650
DNAse I	Roche Diagnostics GmbH	10104159001	(100 U/mL)
ELYRA PS.1 LSM 780 confocal microscope	Carl Zeiss Jena GmbH
FcR Blocking Reagent, human	Miltenyi Biotec GmbH	130-059-901
bright green protein labeling kit; Oregon Green 488 Protein Labeling Kit	Thermo Fisher Scientific	O10241
aqueous mounting medium; Fluoroshield	Sigma-Aldrich GmbH	F6182
density gradient centrifugation tube; Leukosep Centrifuge Tube	Greiner Bio-One	89048-932
MACS magnet holder; MACS MultiStand	Miltenyi Biotec GmbH	130-042-303
MACS pre-separation filter	Miltenyi Biotec GmbH	130-041-407	30 µm
MACS separation column (MS / LS)	Miltenyi Biotec GmbH	130-042-201 / 130-042-401
MACS permanent magnet; MACS Separator	Miltenyi Biotec GmbH	130-042-302
Millex-HV PVDF Filter	Merck	SLHV013SL	0.45 μm
mouse IgG 2b-PE	Miltenyi Biotec GmbH	130-092-215
amine reactive dye; Near-IR LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit	Thermo Fisher Scientific	L10119
human lymphocyte separating medium; Pancoll	Pan Biotech GmbH	P04-60500	density: 1.077 g/mL
PBS	Pan Biotech GmbH	P04-53500	without Ca and Mg
PEI	Sigma-Aldrich GmbH	408727	branched; 25 kDa
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122	100 U/mL, 100 μg/mL
PFA	Merck Schuchardt OHG	1040051000
unlabelled precursor miR; Pre-miR miRNA Precursor Negative Control #1	Ambion	AM17110
RBC lysis buffer	eBioscience	00-4333-57
RNAse decontamination solution; RNaseZap	Thermo Fisher Scientific	AM9780
human lymphocyte medium; Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium	Pan Biotech GmbH	P04-16500
recombinant human cytokine supplement; StemSpan CC100	Stemcell Technologies	2690
serum-free haematopoietic cell expansion medium; StemSpan H3000	Stemcell Technologies	9800
Streptavidin MagneSphere Paramagnetic Particles	Promega Corporation	Z5481
Trypan Blue solution	Sigma-Aldrich GmbH	T8154	0.4 %
UltraPure EDTA	Thermo Fisher Scientific	15575020	0.5 M; pH 8.0
ZEN2011 software	Carl Zeiss Jena GmbH
NanoDrop 1000 Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific
Sonorex RK 100 SH sonicating water bath	Bandelin electronic		Ultrasonic nominal output: 80 W; Ultrasonic frequency: 35 kHz