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Methodenartikel

Protokoll für MicroRNA Transfer an adulten Knochenmark gewonnenen Hämatopoetischen Stammzellen Zelle Engineering kombiniert mit magnetischen Ausrichtung ermöglichen

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DOI:

10.3791/57474

⸱

18. Juni 2018

 ,  ,  ,  , 
1Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Department of Cardiac Surgery, Rostock University Medical Center, 2Department Life, Light and Matter of the Interdisciplinary Faculty, Rostock University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll zeigt ein sicheres und effizientes Verfahren zur CD133 ändern+ Hämatopoetischen Stammzellen. Der vorgestellte nicht-viralen, magnetische Polyplex basierenden Ansatz kann eine Grundlage für die Optimierung der therapeutischen Stammzellen Effekte sowie für die Überwachung der verabreichten Zelle Produkt per Magnet-Resonanz-Tomographie bilden.

Zusammenfassung

Während CD133+ Hämatopoetischen Stammzellen (SCs) erwiesen sich als um hohes Potenzial auf dem Gebiet der regenerativen Medizin zu bieten, ihre geringe Abscheideraten nach Injektion in das verletzte Gewebe sowie die massive beobachtete Sterbeziffern führen zu sehr eingeschränkten therapeutischen Wirkungen. Um diese Einschränkungen zu überwinden, haben wir versucht, ein nicht-viralen basierte Protokoll für geeignete Zelle Engineering vor ihrer Verwaltung zu etablieren. Die Änderung der menschlichen CD133+ mit dem Ausdruck SCs mit magnetischen Polyplexes MicroRNA (MiR) geladen richtete sich in Bezug auf die Aufnahme-Effizienz und Sicherheit sowie das targeting Potential der Zellen. Unter Berufung auf unserem Protokoll, erreichen wir hohe MiR Inanspruchnahme von 80 – 90 %, während die CD133+ Stammzelle Eigenschaften bleiben unberührt. Darüber hinaus bieten diese veränderten Zellen die Möglichkeit der magnetischen Ausrichtung. Wir beschreiben hier ein sicheres und hoch effiziente Verfahren für die Änderung von CD133+ SCs. Wir erwarten, dass dieser Ansatz zu eine Standardtechnologie zur Optimierung der therapeutischen Stammzellen Effekte sowie für die Überwachung des Messguts verabreichten Zelle per Magnetresonanztomographie (MRT) zur Verfügung zu stellen.

Einleitung

CD133+ SCs repräsentieren eine heterogene Zellpopulation Stamm- und Vorläuferzellen mit vielversprechenden Potential für die regenerative Medizin. Ihre myogen hämatopoetischen und endothelialen Differenzierung möglicher1,2,3 ermöglicht die CD133+ Zellen, z. B., Beitrag zur Neovaskularisation Prozesse durch eine Differenzierung in Schiffen und Aktivierung der Pro-angiogenen Signalisierung durch Parakrine Mechanismen4,5,6,7neu bilden.

Trotz ihres hohen Potenzials in mehr als 30 genehmigten klinischen Studien (ClinicalTrails.gov) gezeigt ist ihre therapeutische Ergebnis noch unter kontroverse Diskussion4. In der Tat wird eine klinische Anwendung der SCs durch niedrige Retention in der Orgel von Zinsen und massive erste Zelle Tod5,8,9behindert. Weitere engineering von CD133 könnte helfen, diese Herausforderungen zu meistern+ SCs vor Transplantation.

Eine Voraussetzung für eine effiziente Zelltherapie wäre die Reduktion von den massiven erste Zelltod, das Engraftment therapeutisch relevanten Zellen10zu verbessern. Aktuelle Studien zeigten eine immense Zellverlust von 90-99 % in höchst PERFUNDIERTEN Organen wie Gehirn und Herz während der ersten 1 – 2 Std., unabhängig von der Art der transplantierten Zellen oder Anwendung route11,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21. SC Kennzeichnung mit magnetischen Nanopartikeln (MNPs) ermöglicht eine innovative nicht-invasive Strategie an Zielzellen auf der Website von Interesse22,23,24,25,26 und gleichzeitig ermöglicht die Handy Überwachung mittels MRI27 und magnetic Particle imaging (MPI). Die effizienteste in Vivo Studien Anwendung magnetisierten Zelle gezielt verwendete Zelle Aufbewahrung nach der lokalen Verabreichung bevorzugt Zelle Führung nach intravenöser Injektion23,24,28 . Daher entwickelt unsere Gruppe ein Delivery-System bestehend aus superparamagnetischen Eisenoxid-Nanopartikeln29. Mit dieser Technik, CD133+ SCs und menschlichen nabelader Endothelzellen (Mediumwechsel) effizient ausgerichtet sein könnte, wie durch in-vitro- Versuche30,31.

Eine weitere Hürde für SC-Therapien ist die feindlichen entzündlichen Umgebung des betroffenen Gewebes nach der Transplantation, die auf die erste Zelle Tod32beiträgt. Neben mehreren Vorkonditionierung Studien war die Anwendung der therapeutischen relevanten MiRs getesteten33; Es wurde erfolgreich nachgewiesen, dass Anti-apoptotische MiRs Apoptose in Vitro hemmen und Zelle Engraftment in Vivo33verbessern. Diese kleinen Moleküle, bestehend aus 20 – 25 Nukleotide, spielen eine entscheidende Rolle als posttranskritionelle Modulatoren der Messenger-RNAs (mRNAs) und beeinträchtigen somit Stammzellen Schicksal und Verhalten34. Darüber hinaus die exogene Einführung MiRs vermeiden unerwünschte stabile Integration in die Host-Genom-34.

Aktuelle Versuche zur effizienten Einführung von Nukleinsäuren (NAs) in primäre SCs basieren meist auf rekombinante Viren8,35. Trotz der hohen Transfektion Effizienz stellt rekombinanten Virus Manipulation ein großes Hindernis für eine Bank-zu-Bett-Übersetzung, z.B.unkontrollierbare Genexpression, Pathogenität, Immunogenität und insertional Mutagenese35 ,36. Nicht-viralen-Delivery-Systeme wie Polymer-basierten Konstrukte sind daher kritisch zu entwickeln. Unter denen Polyethylenimine (PEI) stellt eine gültige Lieferfahrzeug bietet Vorteile für MiRs wie NA Kondensation zum Schutz vor Abbau, zelluläre Aufnahme und intrazellulären Freigabe durch Endosomal entgehen37,38. Darüber hinaus zeigte MiR-PEI-komplexe eine hohe Biokompatibilität in klinischen Studien39. Unser Liefersystem besteht also aus einem biotinylierte verzweigten 25 kDa PEI gebunden zu einem Streptavidin beschichteten MNP-Kern30,31,40.

In diesem Manuskript präsentieren wir ein umfassendes Protokoll beschreiben (i) die manuelle Isolierung von CD133+ SC aus menschlichen Knochenmark (BM) Spende mit einer ausführlichen Charakterisierung von SC Produkt- und (Ii) ein effizientes und schonendes Transfektion von einem magnetisch nicht-viralen Polymer-basierten Liefersystem für gentechnische Veränderung von CD133+ SCs mit MiRs. CD133+ SCs sind isoliert und magnetisch aus menschlichen sternale BM Aspiraten mit einer Oberfläche Antikörper-basierten magnetisch aktivierte Zelle Sortieranlage (MACS) angereichert. Danach sind die Zellviabilität sowie die Zelle Reinheit mit Durchflusszytometrie analysiert. Folge MiR/PEI/MNP-komplexe sind vorbereitet und CD133+ SCs sind transfiziert. 18 h nach Transfektion, die Aufnahme-Effizienz und die Auswirkungen der Transfektion auf SC Marker Ausdruck und Zelle überleben werden analysiert. Darüber hinaus erfolgt Bewertung der intrazelluläre Verteilung der Transfektion komplexer Verbindungen mit vierfarbigen Kennzeichnung und strukturierte Beleuchtung Mikroskopie (SIM).

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Protokoll

Sternale menschlichen BM für Zelle isoliert war informierte Spender entnommen, schenkte ihr schriftliche Einverständnis, ihre Proben für die Forschung nach der Deklaration von Helsinki zu verwenden. Die Ethikkommission der Universität Rostock hat die Studie (VO Nr. A 2010 23, im Jahr 2015 verlängert) genehmigt.

1. Zelle-Vorbereitung

Hinweis: Verwenden Sie Heparin Natrium (250 IU/mL BM), Koagulation für BM Prüfung zu verhindern.

  1. CD133+ SC Isolierung
    1. Vorbereitung der erforderlichen Lösungen
      1. Bereiten Sie Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) / Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) stock Lösung (2 mM) durch das Mischen von 996 mL 1 X PBS mit 4 mL EDTA (0,5 M). Kräftig mischen Sie die Lösung und Filtrat mit einem 0,45 µm-Filter. Lagerung bei Raumtemperatur (RT).
      2. Bereiten Sie den MACS-Puffer durch das Mischen von 995 mL 2 mM PBS/EDTA mit 5 g Rinderserumalbumin (BSA). Kräftig mischen Sie die Lösung und Filtrat mit einem 0,45 µm-Filter. Shop bei 4 ° C.
      3. Bereiten Sie Kollagenase B-Stammlösung (40 mg/mL), 500 mg Kollagenase B (von Clostridium Histolyticum) in 12,5 mL PBS verdünnen. Kräftig mischen Sie die Lösung, Aliquote von 350 µL und die Lagerung bei-20 ° C.
      4. Bereiten Sie Deoxyribonuclease (DNAse) ich Lager Lösung (10 mg/mL) durch Verdünnung 100 mg der DNase I (aus bovine Bauchspeicheldrüse) in 10 mL PBS. Kräftig mischen Sie die Lösung, Aliquote von 350 µL und die Lagerung bei-20 ° C.
    2. Enzymatische Verdauung von menschlichen BM
      1. Vorwärmen der menschlichen Lymphozyten Mittel-bis RT und Enzyme (1 Aliquot jeder Kollagenase B und DNAse pro 20 mL BM) Auftauen.
      2. Sammle die BM von Spritzen in ein 50 mL konische Röhrchen und vorsichtig mischen. Entsorgen Sie alle vorhandenen Klumpen.
        Hinweis: Übertragen Sie 200 µL unverdünnte BM in einem 1,5 mL-Tube für nachfolgende durchflusszytometrischen Analyse. Bei 4 ° C bis zur Verwendung aufbewahren.
      3. 10 mL BM in ein neues 50 mL konische Röhrchen überführen, fügen Sie 6 mL PBS/EDTA (2 mM), 20 mL von menschlichen Lymphozyten Medium, 175 µL Collagenase B (40 mg/mL) und 175 µL der DNAse ich (10 mg/mL). Vorsichtig mischen Sie die Lösung und inkubieren Sie für 30 min bei RT in einen Shaker geben. Wiederholen Sie für die verbleibenden BM-Probe.
    3. Dichte-Gradienten-Zentrifugierung
      1. Prime ein 50 mL Dichte Gradienten Zentrifugation Rohr durch die Anwendung 15 mL des menschlichen Lymphozyten Trennung Medium in ein 50 mL-Tube. Zentrifuge bei 1.000 X g für 30 s.
      2. Sorgfältig Schicht 35 mL verdünnten BM auf dem Dichte-Gradienten-Zentrifugierung Kerzenfilter und Zentrifuge bei 445 X g für 35 min bei RT
        Hinweis: Zentrifuge Einstellungen sind niedrige Beschleunigung (3) und keine Bremse (1).
      3. Entfernen Sie vorsichtig den Schlauch aus der Zentrifuge ohne schütteln. Entsorgen Sie sorgfältig ~ 20 mL aus der oberen klare Lösung ohne die trübe Schicht direkt auf den Filter.
      4. Vorsichtig die trübe Schicht (die direkt auf den Filter und enthält die mononukleären Zellen (MNU)) in ein neues 50 mL konische Röhrchen zu übertragen und mit PBS/EDTA zu einem Endvolumen von 50 mL auffüllen.
        Hinweis: Kombinieren Sie alle MNCs aus einer Patientenprobe BM in eine neue Röhre.
      5. Zählen Sie die multinationalen Konzerne durch die Übertragung von 10 µL Zellsuspension 50 mL in einem 1,5 mL-Tube. Fügen Sie 10 µL 3 % Essigsäure mit Methylenblau. Vorsichtig mischen Sie und Auftragen Sie 10 µL in einer Zählkammer. Berechnen Sie die Anzahl der multinationalen Konzerne.
      6. Zentrifuge die MNC Aussetzung bei 300 X g für 10 min. verwerfen den überstand.
        Hinweis: Bei der Zentrifugation, Abkühlen der Zentrifuge von RT bis 4 ° C.
    4. Magnetische Auswahl von CD133+ SCs mit menschlichen CD133 Antikörper verbunden superparamagnetischen Dextran Eisenteilchen
      Hinweis: Während dieses Schrittes arbeiten Sie auf Eis. Shop-Lösungen bis zur Verwendung bei 4 ° C. Speichern Sie MACS Permanentmagnet, Trennsäulen und Vorabscheidung Filter bei 4 ° C.
      1. Wählen Sie die Spaltengröße. Für < 1,2 x 108 MNCs, Nutzung MS Spalten und für > 1,2 x 108 MNCs verwenden LS Spalten (siehe Tabelle der Materialien).
      2. Um magnetische Auswahl 1 x 108 Ergebniszelle Anzahl vorzubereiten, sorgfältig Aufschwemmen MNCs in 300 µL MACS-Puffer (4 ° C). Fügen Sie 100 µL FcR blocking Reagenz (4 ° C) und 100 µL CD133 Antikörper verbunden superparamagnetischen Dextran Eisenpartikel (4 ° C).
      3. Vorsichtig mischen Sie die Zellsuspension und 30 min bei 4 ° c inkubieren Schütteln Sie die Zellsuspension während der Inkubation (2 – 3 X).
      4. Fügen Sie 2 mL MACS-Puffer (4 ° C) pro 1 x 108 insgesamt MNCs. sanft die Zellsuspension und Zentrifuge bei 300 X g für 10 min bei 4 ° c-Mix
      5. MACS Magnet Holder richten Sie ein und zuordnen Sie der MACS Permanentmagnet. Installieren Sie die Spalte MACS zu und wenden Sie die Vorabscheidung Filter an, an der Spitze.
      6. Equilibrate der ersten MACS MS/LS-Spalte und Vorabscheidung Filter mit 0,5 mL (MS) oder 3 mL (LS) MACS-Puffer (4 ° C).
        Hinweis: Lassen Sie niemals die MACS Spalten nach Gleichgewichtherstellung austrocknen.
      7. Den überstand verwerfen und Aufschwemmen der erhaltenen Pellet in 500 µL Puffer MACS (4 ° C) pro 1 x 108 Ergebniszelle Betrag. Die Zellsuspension in der Vorabscheidung Filter anwenden.
      8. Waschen Sie den MACS Spalte und Vorabscheidung Filter dreimal mit jedem Waschgang 0,5 mL (MS) oder 3 mL (LS) MACS-Puffer (4 ° C).
        Hinweis: Während der dritten Waschschritt installieren eine zweite Spalte von MACS in den MACS-Permanent-Magneten und equilibrate der zweiten Spalte der MACS MS/LS mit 0,5 mL (MS) oder 3 mL (LS)-MACS-Puffer (4 ° C).
      9. Entsorgen Sie die Vorabscheidung Filter.
      10. Eluieren Zelle Bruchteil direkt auf die zweite Säule der MACS: 1 mL (MS) oder 5 mL (LS) MACS-Puffer (4 ° C) auf die ersten MACS Säule vom hinzufügen und entfernen die MACS Spalte die MACS-Permanent-Magnet. Sofort die erste MACS Spalte oberhalb der zweiten Spalte des MACS zu übertragen und die Zellsuspension durch die MACS-Säule mit der mitgelieferten Kolben schieben.
      11. Waschen der MACS Spalte dreimal, mit jedem Waschgang 0,5 mL (MS) oder 3 mL (LS) MACS-Puffer (4 ° C).
      12. Eluieren Sie die Zelle-Fraktion aus der Spalte durch Zugabe von 1 mL (MS) oder 5 mL (LS) MACS-Puffer (4 ° C) auf die zweite Säule der MACS und entfernen die MACS-Spalte aus der MACS Permanentmagnet. Sofort die zweite Spalte der MACS über einen 1,5 mL-Tube (MS) oder 15 mL konische Rohr (LS) zu übertragen und die Zellsuspension durch die MACS-Säule mit der mitgelieferten Kolben schieben.
      13. Zentrifuge bei 300 X g für 10 min bei 4 ° C. Sorgfältig überstand verwerfen und erneut das erhaltene Pellet in 100 µL Puffer MACS (4 ° C).
      14. Zählen die CD133+ Zellen: Transfer 6 µL Zellsuspension in einem 1,5 mL-Tube. Fügen Sie 6 µL Trypan blau Lösung (0,4 %). Vorsichtig mischen Sie und Auftragen Sie 10 µL in einer Zählkammer. Berechnen Sie die Anzahl von CD133+ Zellen.
      15. Speichern der CD133+ Zellen auf Eis bis zu säen.
  2. Charakterisierung von frisch isolierte CD133+ SCs
    Hinweis: Die folgende Arbeiten sollten in einem Raum, geschützt von hellem Licht (nur schwache Beleuchtung) durchgeführt werden. Halten Sie Rohre, Puffer und Antikörper auf Eis, sofern nicht anders angegeben.
    1. Vorbereitung des SCs durchflusszytometrischen Analyse
      1. Verwenden Sie zwei Proben (jeweils 10 µL) BM Aliquote und eine Probe des frisch isolierte CD133+ SCs (mindestens, 1 x 10-4 LiPo-Zellen) für die Analyse. Übertragen Sie die Zellen in einem 1,5 mL-Tube. Fügen Sie 10 µL blocking Reagenz FcR und füllen Sie sich mit MACS-Puffer (4 ° C) auf ein Volumen von 33 µL.
      2. Fügen Sie die folgenden Antikörper auf der Innenseite des jeweiligen Rohr (siehe Tabelle 1): Anti-CD34-Fluorescein erfolgt (FITC) (Klon: AC136), Anti-CD133/2-Phycoerythrin (PE) (Klon: 293 (3), Isotype Steuern Maus IgG 2 b-PE, Anti-CD45-Allophycocyanin () APC)-H7 (Klon: 2D 1), und 7-Aminoactinomycin (AAD). Nachdem alle Antikörper hinzugefügt haben, schütteln Sie Antikörper Schattenseite des Rohres. Vorsichtig mischen Sie die Lösung (50 µL Endvolumen) und 10 min bei 4 ° c inkubieren
      3. Fügen Sie 1 mL 1 X Rote Blutzelle (RBC) Lysis Puffer, sanft vermischen Sie die Aussetzung und auf Eis 10 min. Zentrifuge die Aussetzung bei 300 X g für 10 min bei 4 ° c inkubieren
      4. Den überstand verwerfen und Aufschwemmen der erhaltenen Pellet in 100 µL PBS (4 ° C). Speichern Sie auf Eis bis durchflusszytometrischen Analyse.
    2. Durchflusszytometrischen Analyse von CD133 fließen+ SCs
      1. Die Zellviabilität und Reinheit von CD133 prüfen+ SC, verwenden Sie eine angepasste internationale Gesellschaft der Hematotherapy und Graft Engineering (ISHAGE) Flow Cytometry gating Strategie41 (siehe die repräsentative Darstellung in Abbildung 1). Verwenden Sie die folgende Reihenfolge:
        Schritt 1: Auswahl der Zellpopulation (Abbildung 1A)
        Schritt 2: Auswahl der CD45+ Zellen (Abbildung 1 b)
        Schritt 3: Auswahl der lebensfähigen CD45+ Zellen (Abbildung 1)
        Schritt 4: Auswahl der lebensfähigen CD45+/CD34+ Zellen (Abbildung 1)
        Schritt 5: Auswahl der lebensfähigen CD45+/CD34+/CD133+ Zellen (Abbildung 1E)
        Durchflusszytometer ausführen (siehe Tabelle der Materialien) entsprechend den Anweisungen des Herstellers.
      2. Berechnen Sie die Zellviabilität und Reinheit mit den folgenden Gleichungen:

figure-protocol-1   Gleichung 1

figure-protocol-2   Gleichung 2

  1. Zellkultur von frisch isolierte CD133+ SCs
    1. Aliquoten 100 x rekombinanten menschlichen Zytokin in 100 µL-Aliquots ergänzen und speichern bei-20 ° C. Tauwetter ein 100 X aliquoten vor der mittleren Aufbereitung.
    2. Vorbereiten der CD133+ SC Kulturmedium, serumfreien hämatopoetischen Zellen Erweiterung Medium mit rekombinanten menschlichen Zytokin-Ergänzung (letzte 1 X) und 1 % Penicillin/Streptomycin ergänzt.
    3. Samen 5 x 104 frisch isolierte CD133+ SCs zur Transfektion in einer 24-Well-Platte mit 500 µL Kulturmedium. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C, 5 % CO2 und 20 % O2.
      Hinweis: Samen 5 x 104 frisch isolierte CD133+ SCs als Steuerelement für durchflusszytometrischen Analyse.

2. Vorbereitung der Transfektion komplexe

Hinweis: Bei diesem Schritt halten die gesamte Arbeit Raum Ribonuklease (RNAse)-freie RNAse Dekontaminationslösung mit und verwenden Sie nur RNAse-freie Verbrauchsmaterial.

  1. Vorbereitung von miR
    Hinweis: Die folgende Arbeiten sollten in einem Raum, geschützt von hellem Licht (nur schwache Beleuchtung) durchgeführt werden.
    Hinweis: für die MiR-Probe: Verwendung Cyanin 3 Farbstoff mit der Bezeichnung Vorläufer MiR und unbeschriftete Vorläufer MiR.
    1. Um MiR Stammlösung (50 µM) vorzubereiten, verdünnen Sie die gewünschte Menge an MiR in das entsprechende Volumen der Nuklease-freies Wasser (z. B.verdünnte 5 Nmol von MiR in 100 µL Wasser). Vorsichtig mischen Sie die Lösung, aliquoten MiR Lager (5 µL) und speichern unter-20 ° C.
  2. Vorbereitung von PEI
    1. Vorbereiten der PEI nach Standardprotokollen und Erläuterung der PEI Lager Konzentration31,42 .
  3. Vorbereitung der MNP
    1. Bereiten Sie die MNPs nach Standardprotokollen und beachten Sie die MNP Lager Konzentration31,42.
  4. Vorbereitung von MiR/PEI-komplexe
    1. Bereiten Sie 5 % Glukoselösung durch Verdünnung d-(+)-Glukose im Nuklease-freies Wasser. Vorsichtig mischen Sie die Lösung, aliquoten Lager (1,5 mL), und bei 4 ° c Lagern
      Hinweis: Die folgende Arbeiten sollten in einem Raum, geschützt von hellem Licht (nur schwache Beleuchtung) durchgeführt werden.
    2. Verwenden Sie 20 Pmol MiR pro Bohrloch von einer 24-Well-Platte-30. Verdünnen Sie MiR in die 5 % Glukose-Lösung, um eine Endkonzentration von 0,25 Pmol MiR/µL.
    3. Berechnen Sie die Höhe der erforderlichen PEI anhand der MiR Betrag (20 Pmol, Step 2.3.1) und optimale Stickstoff (PEI), Phosphat (von MiR) (N/P) Verhältnis der PEI-Lager-Konzentration (Schritt 2.2.1; hier ein Verhältnis von 7,5 verwendet wurde)30. Verdünnen Sie die PEI in gleicher Höhe von 5 % Glukoselösung verdünnt werden anhand der Gleichung:
      figure-protocol-3
      die ordnet an
      figure-protocol-4    Gleichung 3
      wo PEI Volumen in µL und [PEI] ist in mM und N/P (optimiert für dieses Protokoll) ist 0,75. 0.12 ist ein Umrechnungsfaktor zu MiR.
    4. Fügen Sie die vorverdünnt PEI in vorverdünnt MiR und Wirbel für 30 s.
    5. Inkubieren Sie die MiR/PEI-Komplex für 30 min bei RT
  5. Vorbereitung der MiR/PEI/MNP-komplexe
    Hinweis: Die folgende Arbeiten sollten in einem Raum, geschützt von hellem Licht (nur schwache Beleuchtung) durchgeführt werden.
    1. Während der Inkubation bereiten MiR/PEI-komplexe, die MNPs durch beschallen MNPs für 20 min bei 35 kHz in der Beschallung Wasserbad bei RT um sicherzustellen, dass die Partikel in der Schwebe sind und nicht aggregiert.
    2. Berechnen Sie die Anzahl der erforderlichen MNPs (Eisen 3 µg/mL) basierend auf der MNP-Stammlösung (Schritt 2.3.1).
    3. Fügen Sie den beschallten MNPs in MiR/PEI-komplexe und Vortex für 30 S. Incubate MiR/PEI/MNP-komplexe für 30 min bei RT
  6. Vorbereitung der Transfektion komplexe für vierfarbige Kennzeichnung mit SIM
    Hinweis: Verwenden Sie unbeschriftete Vorläufer MiR.
    1. Beschriften Sie die MiR mit Cyanin 5 Farbstoff eine Cyanin 5 Farbstoff MiR labeling kit (siehe Tabelle der Materialien) nach den Anweisungen des Herstellers. Die letzte MiR Konzentration mit den aufgeführten Spektralphotometer Messen (siehe Tabelle der Materialien) in Übereinstimmung mit der Voreinstellung des Herstellers (Nukleinsäure RNA-40). Teilprobe, die MiR (5 µL) und Speicher bei-80 ° C vor Licht geschützt.
    2. Beschriften Sie die PEI mit einem hellen grün fluoreszieren Farbstoff eine entsprechende Protein-Kennzeichnung kit (siehe Tabelle der Materialien) nach den Anweisungen des Herstellers. Definieren Sie die Endkonzentration PEI unter Verwendung der Ninhydrin--Assay (Schritt 2.2.1). Aliquot der PEI (im Volumen berechnet je nach Gleichung 3) und bei 4 ° C, vor Licht geschützt aufbewahren.
    3. Beschriften Sie die MNPs mit Rhodamin Farbstoff konjugiert, Biotin mit einem Verhältnis von 1:1,000 w/w, Färben Sie, MNP. Der Farbstoff Rhodamin und MNPs zeitgleich mit der Vorbereitung der MiR/PEI-Komplexbildung mischen und die Lösung für 30 Minuten im Dunkeln inkubieren. Beschriftete MNPs nicht direkt verwenden.

3. die Transfektion von CD133+ SCs

Hinweis: Bei diesem Schritt halten die gesamte Arbeit Raum Ribonuklease (RNAse)-freie RNAse Dekontaminationslösung mit und verwenden Sie nur RNAse-freie Verbrauchsmaterial
Hinweis: Die folgende Arbeiten sollten in einem Raum, geschützt von hellem Licht (nur schwache Beleuchtung) durchgeführt werden.

  1. Fügen Sie den vorbereiteten MiRNA/PEI/MNP-Komplex tropfenweise direkt in den entsprechenden Brunnen mit der frisch isolierte CD133+ SCs in Kulturmedium.
  2. Mischen Sie leicht von der Platte hin und her schaukeln. Inkubieren Sie die Zellen für 18 h bei 37 ° C, 5 % CO2 und 20 % O2.

4. Analyse der MiR Transfektion

  1. Prüfung der MiR Aufnahme Effizienz und der Zytotoxizität von Transfection komplexe
    Hinweis: für die MiR-Probe: Cyanin 3 Farbstoff mit der Bezeichnung Vorläufer MiR zur Aufnahme Bewertung und nicht transfizierten CD133 verwenden+ SCs für die Flow Cytometry Kontrolle Tore.
    Hinweis: Die folgende Arbeiten sollten in einem Raum, geschützt von hellem Licht (nur schwache Beleuchtung) durchgeführt werden.
    Hinweis: Halten Sie die Rohre, Puffer und Antikörper auf Eis, sofern nicht anders angegeben.
    1. Vorbereiten der Paraformaldehyd-Stammlösung (PFA, 4 %) durch 4 g PFA in 100 mL PBS verdünnen und Heizlösung bis 80 ° C. Kräftig mischen Sie die Lösung und stellen Sie den pH-Wert auf 7,3. Aliquoten die PFA (1,5 mL) auf Lager und Lagerung bei-20 ° C.
    2. 18 h nach Transfektion sammeln jedes gut in eine separate 1,5 mL tube. Jeder auch einmal mit 500 µL PBS waschen und diese Zellsuspension auf das gleiche Rohr übertragen.
    3. Zentrifuge bei 300 X g für 10 min bei 4 ° C. Den überstand verwerfen und Aufschwemmen der erhaltenen Pellet in 100 µL 4 ° C-MACS-Puffer.
    4. Hinzufügen von 0,5 µL einer Amin Reaktivfarbstoffen unterscheiden zwischen lebenden und toten Zellen, sanft die Aussetzung zu mischen und 10 min bei 4 ° c inkubieren Fügen Sie 1 mL PBS (4 ° C) und Zentrifuge bei 300 X g für 10 min bei 4 ° C.
    5. Den überstand verwerfen, Aufschwemmen der erhaltenen Pellet in 100 µL PBS, 33 µL PFA (4 %) hinzufügen und speichern auf Eis oder bei 4 ° C bis durchflusszytometrischen Analyse.
    6. Ordnen Sie die gating-Strategie entsprechend der repräsentative Darstellung in Abbildung 2. Die Proben laufen auf das Durchflusszytometer (siehe Tabelle der Materialien) entsprechend den Anweisungen des Herstellers.
  2. Charakterisierung von MiR transfiziert CD133+ SCs
    Hinweis: Verwendet unbeschriftete Vorläufer MiR als auch nicht-transfizierten CD133+ SCs für Flow Cytometry Kontrolle Tore.
    1. Sammeln nun jeweils in einer separaten 1,5 mL Tube und Zentrifugieren bei 300 X g für 10 min bei 4 ° C.
    2. Verwenden Sie die gating Strategie, wie unter Punkt 1.2 beschrieben.
  3. Prüfung der intrazelluläre Verteilung der Transfektion komplexe von SIM
    1. Bereiten Sie die komplexe und transfizieren Sie die Zellen zu, wie in Abschnitt 2 und Abschnitt 3 beschrieben.
    2. 18 h nach der Transfektion sammeln jedes gut in eine separate 1,5 mL tube. Jeweils auch einmal mit 500 µL PBS waschen und die Wäsche in den Brunnen jeweiligen Rohr übertragen. Zentrifuge bei 300 X g für 10 min bei 4 ° C.
    3. Den überstand verwerfen Aufschwemmen der erhaltenen Pellet in 1 mL 2 % fetalen bovine Serum (FBS) mit PBS-Puffer, sanft mischen die Aussetzung und Zentrifugieren bei 300 X g für 10 min bei 4 ° C.
    4. Den überstand verwerfen, Aufschwemmen der erhaltenen Pellet in 100 µL PBS und 33 µL PFA (4 %) für 20 min hinzufügen.
    5. Übertragen Sie die Zellsuspension in eine neue 24-Kultur-Platte mit sterilen Glasdeckgläser und Zentrifuge bei 300 X g für 10 min bei 4 ° C.
    6. Den überstand verwerfen und 500 µL PBS hinzufügen. Schütteln Sie die Platte und verwerfen Sie PBS zu.
    7. Die mikroskopische Dias mit wässrigen Eindeckmittel zur Erhaltung der Fluoreszenz und trocknen Sie sie für mindestens 1 h bei RT setzen Sie bereiten Deckgläsern auf.
    8. Bilder mit einem 100 X Öl Immersion Ziel zu erwerben. SIM-Einstellungen: 405, 488, 561 und 633 nm Laser-Linien für Anregung und Z-Stacks mit einer 16-Bit-Tiefe im 3 Winkel, 3 Phasen, mit durchschnittlich 4, Rastern pro Laserlinie: 23 µm – 405, 34 µm – 488, 42 µm – 561, 51 µm – 633.

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Ergebnisse

Die vorgestellte Protokoll beschreibt eine manuelle Isolation und magnetische Anreicherung von menschlichen BM abgeleitet CD133+ SCs mit einer anschließenden Virus unabhängige Zelle engineering-Strategie als eine nicht-invasive Technologie zur in-vitro- Zelle Manipulation und in Vivo monitoring-Tool.

Diese Dreistufen-Isolierung-Technologie ermöglicht eine Trennung der multinationalen Konzerne aus der...

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Diskussion

In den letzten Jahren, CD133+ SCs entstanden als eine viel versprechende Zellpopulation für SC-basierte Therapien wie von mehreren phase I, II und III klinischen Studien43,44,45,46, 47 , 48 , 49 , 50 , 51 ,...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären keinen Interessenskonflikt.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt durch das Bundesministerium für Bildung und Forschung Deutschland (FKZ 0312138A und FKZ 316159), der staatlichen Mecklenburg-Vorpommern mit EU-Strukturfonds (ESF/IVWM-B34-0030/10 und ESF/IVBM-B35-0010/12) und der DFG (DA1296/2-1), die Deutsche Herzstiftung (F/01/12), das BMBF (VIP + 00240) und der FEUCHTEN Foundation. Darüber hinaus werden f.h. und Uhr durch das FORUN-Programm von Rostock University Medical Center (889001) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
7-AADBD Biosciences559925
Essigsäure mit MethylenblauStemcell Technologies70603%
anti-CD133/2-PE (Klon: 293C3)Miltenyi Biotec GmbH130-090-853
anti-CD34-FITC (Klon: AC136)Miltenyi Biotec GmbH130-081-001
anti-CD45-APC-H7 (Klon: 2D1)BD Biosciences
Rhodamin-Farbstoff; Atto 565 Farbstoff, konjugiert mit BiotinATTO-TEC GmbHAD 565-71
BD FACS LSRII DurchflusszytometerBD Biosciences
BD FACSDiva Software 6.1.2BD Biosciences
BSASigma-Aldrich GmbHA7906
CD133 Antikörper-gebundene superparamagnetische Eisen-Dextran-Partikel; CD133 MicroBead KitMiltenyi Biotec GmbH130-097-049
Kollagenase BRoche Diagnostics GmbH11088831001
ZählkammerPaul Marienfeld GmbH & Co. KG
Cyanin 3 Farbstoff markierter Vorläufer miR; Cy3 Farbstoffmarkierte Pre-miR-Negativkontrolle #1AmbionAM17120
Cyanin 5 Farbstoff miR-Markierungskit; Cy5 Farbstoff Markierung IT miRNA MarkierungskitMirus BioMIR 9650
DNAse IRoche Diagnostics GmbH10104159001(100 U/mL)
ELYRA PS.1 LSM 780 konfokales MikroskopCarl Zeiss Jena GmbH
FcR Blockierungsreagenz, humanMiltenyi Biotec GmbH130-059-901
hellgrünes Proteinmarkierungskit; Oregon Green 488 ProteinmarkierungskitThermo Fisher ScientificO10241
wässriges Einbettmedium; FluoroshieldSigma-Aldrich GmbHF6182
Dichtegradienten-Zentrifugationsröhrchen; Leukosep ZentrifugenröhrchenGreiner Bio-One89048-932
MACS Magnethalter; MACS MultiStandMiltenyi Biotec GmbH130-042-303
MACS VorabscheidefilterMiltenyi Biotec GmbH130-041-40730 µ m
MACS Trennsäule (MS / LS)Miltenyi Biotec GmbH130-042-201 / 130-042-401
MACS Permanentmagnet; MACS SeparatorMiltenyi Biotec GmbH130-042-302
Millex-HV PVDF FilterMerckSLHV013SL0,45 μ m
Maus IgG 2b-PEMiltenyi Biotec GmbH130-092-215
Amin-Reaktivfarbstoff; Nah-IR-Lebend/Tot-Fixierbares Flecken-Kit für tote ZellenThermo Fisher ScientificL10119
Lymphozyten-Trennmedium; PancollPan Biotech GmbHP04-60500Dichte: 1.077 g/mL
PBSPan Biotech GmbHP04-53500ohne Ca und Mg
PEISigma-Aldrich GmbH408727verzweigt; 25 kDa
Penicillin/StreptomycinThermo Fisher Scientific15140122100 U/mL, 100 μ g/mL
PFAMerck Schuchardt OHG1040051000
unmarkierter Vorläufer miR; Pre-miR miRNA Vorläufer Negativkontrolle #1AmbionAM17110
Erythrozyten-LysepuffereBioscience00-4333-57
RNAse Dekontaminationslösung; RNaseZapThermo Fisher ScientificAM9780
menschliches Lymphozytenmedium; Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 MediumPan Biotech GmbHP04-16500
rekombinantes humanes Zytokin-Supplement; StemSpan CC100Stemcell Technologies2690
serumfreies hämatopoetisches Zellexpansionsmedium; StemSpan H3000Stemcell Technologies9800
Streptavidin MagneSphere Paramagnetic ParticlesPromega CorporationZ5481
Trypan Blue solutionSigma-Aldrich GmbHT81540,4 %
UltraPure EDTAThermo Fisher Scientific155750200,5 M; pH 8,0
ZEN2011 SoftwareCarl Zeiss Jena GmbH
NanoDrop 1000 SpektralphotometerThermo Fisher Scientific
Sonorex RK 100 SH BeschallungswasserbadBandelin electronicUltraschall Nennleistung: 80 W; Ultraschall-Frequenz: 35 kHz
560178 menschliches

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