Name: Protokoll für MicroRNA Transfer an adulten Knochenmark gewonnenen Hämatopoetischen Stammzellen Zelle Engineering kombiniert mit magnetischen Ausrichtung ermöglichen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Erfahren Sie die nicht-virale Transfektion von CD133+ hämatopoetischen Stammzellen aus Knochenmark zur Optimierung therapeutischer Effekte. Diese Methode ermöglicht die genetische Modifikation unter Erhalt der Zelleigenschaften.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch das Bundesministerium für Bildung und Forschung Deutschland (FKZ 0312138A und FKZ 316159), der staatlichen Mecklenburg-Vorpommern mit EU-Strukturfonds (ESF/IVWM-B34-0030/10 und ESF/IVBM-B35-0010/12) und der DFG (DA1296/2-1), die Deutsche Herzstiftung (F/01/12), das BMBF (VIP + 00240) und der FEUCHTEN Foundation. Darüber hinaus werden f.h. und Uhr durch das FORUN-Programm von Rostock University Medical Center (889001) unterstützt.

Die Autoren erklären keinen Interessenskonflikt.

In den letzten Jahren, CD133+ SCs entstanden als eine viel versprechende Zellpopulation für SC-basierte Therapien wie von mehreren phase I, II und III klinischen Studien43,44,45,46, 47 , 48 , 49 , 50 , 51 ,...

CD133+ SCs repräsentieren eine heterogene Zellpopulation Stamm- und Vorläuferzellen mit vielversprechenden Potential für die regenerative Medizin. Ihre myogen hämatopoetischen und endothelialen Differenzierung möglicher1,2,3 ermöglicht die CD133+ Zellen, z. B., Beitrag zur Neovaskularisation Prozesse durch eine Differenzierung in Schiffen und Aktivierung der Pro-angiogenen Signalisierung durch Parakrine Mechanismen4,5,6,7neu bilden.
Trotz ihres hohen Potenzials in mehr als 30 genehmigten klinischen Studien (ClinicalTrails.gov) gezeigt ist ihre therapeutische Ergebnis noch unter kontroverse Diskussion4. In der Tat wird eine klinische Anwendung der SCs durch niedrige Retention in der Orgel von Zinsen und massive erste Zelle Tod5,8,9behindert. Weitere engineering von CD133 könnte helfen, diese Herausforderungen zu meistern+ SCs vor Transplantation.
Eine Voraussetzung für eine effiziente Zelltherapie wäre die Reduktion von den massiven erste Zelltod, das Engraftment therapeutisch relevanten Zellen10zu verbessern. Aktuelle Studien zeigten eine immense Zellverlust von 90-99 % in höchst PERFUNDIERTEN Organen wie Gehirn und Herz während der ersten 1 – 2 Std., unabhängig von der Art der transplantierten Zellen oder Anwendung route11,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21. SC Kennzeichnung mit magnetischen Nanopartikeln (MNPs) ermöglicht eine innovative nicht-invasive Strategie an Zielzellen auf der Website von Interesse22,23,24,25,26 und gleichzeitig ermöglicht die Handy Überwachung mittels MRI27 und magnetic Particle imaging (MPI). Die effizienteste in Vivo Studien Anwendung magnetisierten Zelle gezielt verwendete Zelle Aufbewahrung nach der lokalen Verabreichung bevorzugt Zelle Führung nach intravenöser Injektion23,24,28 . Daher entwickelt unsere Gruppe ein Delivery-System bestehend aus superparamagnetischen Eisenoxid-Nanopartikeln29. Mit dieser Technik, CD133+ SCs und menschlichen nabelader Endothelzellen (Mediumwechsel) effizient ausgerichtet sein könnte, wie durch in-vitro- Versuche30,31.
Eine weitere Hürde für SC-Therapien ist die feindlichen entzündlichen Umgebung des betroffenen Gewebes nach der Transplantation, die auf die erste Zelle Tod32beiträgt. Neben mehreren Vorkonditionierung Studien war die Anwendung der therapeutischen relevanten MiRs getesteten33; Es wurde erfolgreich nachgewiesen, dass Anti-apoptotische MiRs Apoptose in Vitro hemmen und Zelle Engraftment in Vivo33verbessern. Diese kleinen Moleküle, bestehend aus 20 – 25 Nukleotide, spielen eine entscheidende Rolle als posttranskritionelle Modulatoren der Messenger-RNAs (mRNAs) und beeinträchtigen somit Stammzellen Schicksal und Verhalten34. Darüber hinaus die exogene Einführung MiRs vermeiden unerwünschte stabile Integration in die Host-Genom-34.
Aktuelle Versuche zur effizienten Einführung von Nukleinsäuren (NAs) in primäre SCs basieren meist auf rekombinante Viren8,35. Trotz der hohen Transfektion Effizienz stellt rekombinanten Virus Manipulation ein großes Hindernis für eine Bank-zu-Bett-Übersetzung, z.B.unkontrollierbare Genexpression, Pathogenität, Immunogenität und insertional Mutagenese35 ,36. Nicht-viralen-Delivery-Systeme wie Polymer-basierten Konstrukte sind daher kritisch zu entwickeln. Unter denen Polyethylenimine (PEI) stellt eine gültige Lieferfahrzeug bietet Vorteile für MiRs wie NA Kondensation zum Schutz vor Abbau, zelluläre Aufnahme und intrazellulären Freigabe durch Endosomal entgehen37,38. Darüber hinaus zeigte MiR-PEI-komplexe eine hohe Biokompatibilität in klinischen Studien39. Unser Liefersystem besteht also aus einem biotinylierte verzweigten 25 kDa PEI gebunden zu einem Streptavidin beschichteten MNP-Kern30,31,40.
In diesem Manuskript präsentieren wir ein umfassendes Protokoll beschreiben (i) die manuelle Isolierung von CD133+ SC aus menschlichen Knochenmark (BM) Spende mit einer ausführlichen Charakterisierung von SC Produkt- und (Ii) ein effizientes und schonendes Transfektion von einem magnetisch nicht-viralen Polymer-basierten Liefersystem für gentechnische Veränderung von CD133+ SCs mit MiRs. CD133+ SCs sind isoliert und magnetisch aus menschlichen sternale BM Aspiraten mit einer Oberfläche Antikörper-basierten magnetisch aktivierte Zelle Sortieranlage (MACS) angereichert. Danach sind die Zellviabilität sowie die Zelle Reinheit mit Durchflusszytometrie analysiert. Folge MiR/PEI/MNP-komplexe sind vorbereitet und CD133+ SCs sind transfiziert. 18 h nach Transfektion, die Aufnahme-Effizienz und die Auswirkungen der Transfektion auf SC Marker Ausdruck und Zelle überleben werden analysiert. Darüber hinaus erfolgt Bewertung der intrazelluläre Verteilung der Transfektion komplexer Verbindungen mit vierfarbigen Kennzeichnung und strukturierte Beleuchtung Mikroskopie (SIM).

<table><tbody><tr><td>7-AAD</td><td>BD Biosciences</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>Essigsäure mit Methylenblau</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7060</td><td>3%</td></tr><tr><td>anti-CD133/2-PE (Klon: 293C3)</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-090-853</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD34-FITC (Klon: AC136)</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-081-001</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD45-APC-H7 (Klon: 2D1)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td>560178</tr><tr><td>Rhodamin-Farbstoff; Atto 565 Farbstoff, konjugiert mit Biotin</td><td>ATTO-TEC GmbH</td><td>AD 565-71</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS LSRII Durchflusszytometer</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva Software 6.1.2</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich GmbH</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>CD133 Antikörper-gebundene superparamagnetische Eisen-Dextran-Partikel; CD133 MicroBead Kit</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-097-049</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase B</td><td>Roche Diagnostics GmbH</td><td>11088831001</td><td></td></tr><tr><td>Zählkammer</td><td>Paul Marienfeld GmbH & Co. KG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cyanin 3 Farbstoff markierter Vorläufer miR; Cy3 Farbstoffmarkierte Pre-miR-Negativkontrolle #1</td><td>Ambion</td><td>AM17120</td><td></td></tr><tr><td>Cyanin 5 Farbstoff miR-Markierungskit; Cy5 Farbstoff Markierung IT miRNA Markierungskit</td><td>Mirus Bio</td><td>MIR 9650</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Roche Diagnostics GmbH</td><td>10104159001</td><td>(100 U/mL)</td></tr><tr><td>ELYRA PS.1 LSM 780 konfokales Mikroskop</td><td>Carl Zeiss Jena GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FcR Blockierungsreagenz, human</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-059-901</td><td></td></tr><tr><td>hellgrünes Proteinmarkierungskit; Oregon Green 488 Proteinmarkierungskit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>O10241</td><td></td></tr><tr><td>wässriges Einbettmedium; Fluoroshield</td><td>Sigma-Aldrich GmbH</td><td>F6182</td><td></td></tr><tr><td>Dichtegradienten-Zentrifugationsröhrchen; Leukosep Zentrifugenröhrchen</td><td>Greiner Bio-One</td><td>89048-932</td><td></td></tr><tr><td>MACS Magnethalter; MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>MACS Vorabscheidefilter</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-041-407</td><td>30 &micro; m</td></tr><tr><td>MACS Trennsäule (MS / LS)</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-042-201 / 130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS Permanentmagnet; MACS Separator</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>Millex-HV PVDF Filter</td><td>Merck</td><td>SLHV013SL</td><td>0,45 &mu; m</td></tr><tr><td>Maus IgG 2b-PE</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-092-215</td><td></td></tr><tr><td>Amin-Reaktivfarbstoff; Nah-IR-Lebend/Tot-Fixierbares Flecken-Kit für tote Zellen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L10119</td><td></td></tr> menschliches <tr><td>Lymphozyten-Trennmedium; Pancoll</td><td>Pan Biotech GmbH</td><td>P04-60500</td><td>Dichte: 1.077 g/mL</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Pan Biotech GmbH</td><td>P04-53500</td><td>ohne Ca und Mg</td></tr><tr><td>PEI</td><td>Sigma-Aldrich GmbH</td><td>408727</td><td>verzweigt; 25 kDa</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>100 U/mL, 100 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Merck Schuchardt OHG</td><td>1040051000</td><td></td></tr><tr><td>unmarkierter Vorläufer miR; Pre-miR miRNA Vorläufer Negativkontrolle #1</td><td>Ambion</td><td>AM17110</td><td></td></tr><tr><td>Erythrozyten-Lysepuffer</td><td>eBioscience</td><td>00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>RNAse Dekontaminationslösung; RNaseZap</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>menschliches Lymphozytenmedium; Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium</td><td>Pan Biotech GmbH</td><td>P04-16500</td><td></td></tr><tr><td>rekombinantes humanes Zytokin-Supplement; StemSpan CC100</td><td>Stemcell Technologies</td><td>2690</td><td></td></tr><tr><td>serumfreies hämatopoetisches Zellexpansionsmedium; StemSpan H3000</td><td>Stemcell Technologies</td><td>9800</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin MagneSphere Paramagnetic Particles</td><td>Promega Corporation</td><td>Z5481</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue solution</td><td>Sigma-Aldrich GmbH</td><td>T8154</td><td>0,4 %</td></tr><tr><td>UltraPure EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575020</td><td>0,5 M; pH 8,0</td></tr><tr><td>ZEN2011 Software</td><td>Carl Zeiss Jena GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 Spektralphotometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonorex RK 100 SH Beschallungswasserbad</td><td>Bandelin electronic</td><td></td><td>Ultraschall Nennleistung: 80 W; Ultraschall-Frequenz: 35 kHz</td></tr></tbody></table>

protokoll für microrna transfer an adulten knochenmark gewonnenen hämatopoetischen stammzellen zelle engineering kombiniert mit magnetischen ausrichtung ermöglichen

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

Während CD133+ Hämatopoetischen Stammzellen (SCs) erwiesen sich als um hohes Potenzial auf dem Gebiet der regenerativen Medizin zu bieten, ihre geringe Abscheideraten nach Injektion in das verletzte Gewebe sowie die massive beobachtete Sterbeziffern führen zu sehr eingeschränkten therapeutischen Wirkungen. Um diese Einschränkungen zu überwinden, haben wir versucht, ein nicht-viralen basierte Protokoll für geeignete Zelle Engineering vor ihrer Verwaltung zu etablieren. Die Änderung der menschlichen CD133+ mit dem Ausdruck SCs mit magnetischen Polyplexes MicroRNA (MiR) geladen richtete sich in Bezug auf die Aufnahme-Effizienz und Sicherheit sowie das targeting Potential der Zellen. Unter Berufung auf unserem Protokoll, erreichen wir hohe MiR Inanspruchnahme von 80 – 90 %, während die CD133+ Stammzelle Eigenschaften bleiben unberührt. Darüber hinaus bieten diese veränderten Zellen die Möglichkeit der magnetischen Ausrichtung. Wir beschreiben hier ein sicheres und hoch effiziente Verfahren für die Änderung von CD133+ SCs. Wir erwarten, dass dieser Ansatz zu eine Standardtechnologie zur Optimierung der therapeutischen Stammzellen Effekte sowie für die Überwachung des Messguts verabreichten Zelle per Magnetresonanztomographie (MRT) zur Verfügung zu stellen.

Die vorgestellte Protokoll beschreibt eine manuelle Isolation und magnetische Anreicherung von menschlichen BM abgeleitet CD133+ SCs mit einer anschließenden Virus unabhängige Zelle engineering-Strategie als eine nicht-invasive Technologie zur in-vitro- Zelle Manipulation und in Vivo monitoring-Tool.
Diese Dreistufen-Isolierung-Technologie ermöglicht eine Trennung der multinationalen Konzerne aus der...

Dieses Protokoll zeigt ein sicheres und effizientes Verfahren zur CD133 ändern+ Hämatopoetischen Stammzellen. Der vorgestellte nicht-viralen, magnetische Polyplex basierenden Ansatz kann eine Grundlage für die Optimierung der therapeutischen Stammzellen Effekte sowie für die Überwachung der verabreichten Zelle Produkt per Magnet-Resonanz-Tomographie bilden.

Protokoll für MicroRNA Transfer an adulten Knochenmark gewonnenen Hämatopoetischen Stammzellen Zelle Engineering kombiniert mit magnetischen Ausrichtung ermöglichen

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

Unser Protokoll kann Schlüsselfragen im Bereich der regenerativen Medizin beantworten, z. B. ob Zellen hinsichtlich ihrer vorteilhaften Eigenschaften verbessert werden können und ob sie auf den interessierenden Ort ausgerichtet werden können. Ein Hauptvorteil unseres Protokolls ist die Tatsache, dass die Zellen mit unserer nicht-viralen Transfektionsmethode vorübergehend gentechnisch verändert werden können, wodurch die Eigenschaften der Zellen erhalten bleiben. Sauters Methode kann Einblicke in die Modifikation von hämatopoetischen Stammzellen geben, die auf andere Zelltypen angewendet werden können, die für die Transplantation verwendet werden, wie z. B. mesenchymale Stammzellen.Zu Beginn des Protokolls wird das Medium des menschlichen Lymphozyten auf Raumtemperatur vorgewärmt und Kollagenase B und DNase aufgetaut. Sammeln Sie das Knochenmark oder BM in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Entsorgen Sie alle vorhandenen Gerinnsel.Entnehmen Sie eine BM-Probe von 200 Mikrolitern für die anschließende durchflusszytometrische Analyse. Lagern Sie die Probe bis zur Verwendung bei vier Grad Celsius. Übertragen Sie als Nächstes zehn Milliliter BM in ein neues konisches 50-Milliliter-Röh

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Kombinatorische 5 fluoreszierenden Proteinen markiert von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen in vivo ermöglicht klonalen Tracking über die konfokale und Zwei-Photonen-Mikroskopie, die einen Einblick in die Knochenmark blutbild Architektur während der Regeneration. Dieses Verfahren ermöglicht nicht-invasive Abbildung von Schicksal spektral kodierten HSPCs abgeleiteten Zellen in intaktem Gewebe für ausgedehnte Zeiträume nach der Transplantation.

In vivo Klonale Verfolgung von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen durch Fünf Fluoreszierende Proteine ​​mit Hilfe der konfokalen und Multiphotonen Mikroskopie Markierte

Gezielte Zellverabreichung ist nützlich in einer Vielzahl von biomedizinischen Anwendungen.  Das Ziel dieses Protokolls ist es, superparamagnetische Eisenoxid-Nanopartikel (SPION) zur Markierung von Zellen zu verwenden und dadurch magnetische Zell-Targeting-Ansätze für ein hohes Maß an Kontrolle über die Zellabgabe und -lokalisierung zu ermöglichen.

Zellmarkierung und Targeting mit superparamagnetische Eisenoxid-Nanopartikel

Chondrogenese aus Stammzellen erfordert Feinabstimmung der Kulturbedingungen. Hier präsentieren wir einen magnetischen Ansatz für Zellen Kondensation, ein wesentlicher Schritt Chondrogenese zu initiieren. Darüber hinaus zeigen wir, dass dynamische Reifung in einem Bioreaktor mechanische Stimulation auf die Zellkonstrukte und verbessert knorpelige extrazelluläre Matrixproduktion gilt.

3D Magnetic Stem Cell Aggregation und Bioreactor Ausreifung für Knorpelregeneration

Dieses Manuskript beschreibt die effiziente, nicht-virale Abgabe von miR-Zellen durch einen PEI / MNP-Vektor und ihre Magnetisierung an Endothelzellen. Somit kann zusätzlich zu genetischer Veränderung, ermöglicht dieser Ansatz für die magnetische Zellführung und MRI Nachweisbarkeit. Die Technik kann verwendet werden, um die Eigenschaften von therapeutischen Zellprodukten zu verbessern.

Vorbereitung und<em&gt; In Vitro</em&gt; Charakterisierung von Magnetized miR-modifizierten Endothelzellen

Dieses Protokoll beschreibt der Transienten Gentechnik zahnmedizinische Stammzellen aus der menschlichen zahnmedizinische Follikel extrahiert. Die angewandte nicht-viralen Modifikation Strategie kann eine Grundlage für die Verbesserung der therapeutischen Stammzellen Produkte geworden.

Isolierung, Charakterisierung und RNA-basierte gentechnische Veränderung von menschlichen Dental follikelstimulierendes Stammzellen

Wir beschreiben die Verwendung von hämatopoetischen Stammzelltransplantation (HSCT) Das maligne Potential der gentechnisch veränderten blutbildenden Zellen zu beurteilen. HSCT ist nützlich für die Bewertung der verschiedenen malignen hämatopoetischen Zellen in Vivo sowie die Generierung einer großen Kohorte von Mäusen mit myelodysplastischen Syndromen (MDS) oder Leukämie um neue Therapien zu bewerten.

Einsatz von hämatopoetischen Stammzelltransplantation zu beurteilen, den Ursprung des myelodysplastischen Syndroms

Ziel dieses Protokolls ist es, nichtmenschlichen Primaten CD34 isolieren+ Zellen aus grundiert Knochenmark, um diese Zellen mit Lentivirale Vektoren gen zu modifizieren und ein Produkt zur Infusion in die autologe Host vorzubereiten. Die Gesamt-Protokoll-Länge ist ca. 48 h.

Vorbereitung und gentechnische Veränderung von Nichtmenschen Primas hämatopoetischen Stammzellen und Vorläuferzellen

Beschrieben werden Protokolle für die hocheffiziente Genombearbeitung von murinen hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPC) durch das CRISPR/Cas9-System zur schnellen Entwicklung von Mausmodellsystemen mit hämatopoetischen systemspezifischen Genmodifikationen.

Lentiviral CRISPR/Cas9-Vermittelte Genombearbeitung zur Untersuchung hämatopoetischer Zellen in Krankheitsmodellen

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein optimiertes hämatopoetisches Stamm- und Vorläuferzell-Kulturverfahren (HSPC) für die robuste Anpflanzung von geneditierten Zellen in vivo.

CRISPR/Cas9-Gen-Editing von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen für gentherapeutische Anwendungen

Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zur Genom-Editierung in aus dem Knochenmark der Maus gewonnenen Makrophagen unter Verwendung von Cas9-sgRNA-Ribonukleoproteinkomplexen, die in vitro zusammengesetzt und durch Elektroporation verabreicht werden.

Hocheffiziente Genzerstörung in primären Makrophagen aus dem Knochenmark unter Verwendung elektroporierter Cas9-sgRNA-Komplexe

Dieses Protokoll beschreibt die intrafemorale Injektion einiger hämatopoetischer oder leukämischer Stammzellen, einschließlich geneditierter Zellen, in murine Xenotransplantatmodelle, die nicht nur eine schnelle und sichere Transplantation von Zellen, sondern auch serielle Analysen des Knochenmarks ermöglichen.

Vereinfachte intrafemorale Injektionen mit lebenden Mäusen ermöglichen eine kontinuierliche Knochenmarkanalyse

Erfahren Sie die nicht-virale Transfektion von CD133+ hämatopoetischen Stammzellen aus Knochenmark zur Optimierung therapeutischer Effekte. Diese Methode ermöglicht die genetische Modifikation unter Erhalt der Zelleigenschaften.

Protokoll für MicroRNA Transfer an adulten Knochenmark gewonnenen Hämatopoetischen Stammzellen Zelle Engineering kombiniert mit magnetischen Ausrichtung ermöglichen (Video) | JoVE Journal

Protokoll für MicroRNA Transfer an adulten Knochenmark gewonnenen Hämatopoetischen Stammzellen Zelle Engineering kombiniert mit magnetischen Ausrichtung ermöglichen

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