Protokoll für MicroRNA Transfer an adulten Knochenmark gewonnenen Hämatopoetischen Stammzellen Zelle Engineering kombiniert mit magnetischen Ausrichtung ermöglichen

Unser Protokoll kann Schlüsselfragen im Bereich der regenerativen Medizin beantworten, z. B. ob Zellen hinsichtlich ihrer vorteilhaften Eigenschaften verbessert werden können und ob sie auf den interessierenden Ort ausgerichtet werden können. Ein Hauptvorteil unseres Protokolls ist die Tatsache, dass die Zellen mit unserer nicht-viralen Transfektionsmethode vorübergehend gentechnisch verändert werden können, wodurch die Eigenschaften der Zellen erhalten bleiben. Sauters Methode kann Einblicke in die Modifikation von hämatopoetischen Stammzellen geben, die auf andere Zelltypen angewendet werden können, die für die Transplantation verwendet werden, wie z. B. mesenchymale Stammzellen.

Zu Beginn des Protokolls wird das Medium des menschlichen Lymphozyten auf Raumtemperatur vorgewärmt und Kollagenase B und DNase aufgetaut. Sammeln Sie das Knochenmark oder BM in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Entsorgen Sie alle vorhandenen Gerinnsel.

Entnehmen Sie eine BM-Probe von 200 Mikrolitern für die anschließende durchflusszytometrische Analyse. Lagern Sie die Probe bis zur Verwendung bei vier Grad Celsius. Übertragen Sie als Nächstes zehn Milliliter BM in ein neues konisches 50-Milliliter-Röhrchen und fügen Sie sechs Milliliter PBS EDTA, 20 Milliliter humanes Lymphozytenmedium, 175 Mikroliter Kollagenase B und 175 Mikroliter DNase hinzu.

Mischen Sie die Lösung vorsichtig und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einem Schüttler. Ein Gradientenzentrifugationsröhrchen mit einer Dichte von 50 Millilitern wird vorgeglüht, indem 15 Milliliter humanes Lymphozytentrennmedium in das 50-Milliliter-Röhrchen gegeben und 30 Sekunden lang bei 1.000 G zentrifugiert werden. Schichten Sie vorsichtig 35 Milliliter verdünntes BM auf den Filter des Dichtegradientenzentrifugationsröhrchens und zentrifugieren Sie das Röhrchen 35 Minuten lang bei 445-fachem G.

Nehmen Sie das Röhrchen vorsichtig aus der Zentrifuge, ohne es zu schütteln. Entsorgen Sie vorsichtig maximal 20 Milliliter aus der oberen klaren Lösung, ohne die trübe Schicht direkt auf dem Filter zu berühren. Übertragen Sie die trübe Schicht, die die mononukleären Zellen (MNCs) enthält, vorsichtig in ein neues konisches 50-Milliliter-Röhrchen und füllen Sie es mit PBS EDTA bis zu einem endgültigen Volumen von 50 Millilitern.

Zählen Sie die multinationalen Unternehmen, indem Sie 10 Mikroliter der 50-Milliliter-Zellsuspension in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen überführen. Fügen Sie 10 Mikroliter 3%ige Essigsäure mit Methylenblau hinzu. Mischen Sie den Inhalt vorsichtig und geben Sie 10 Mikroliter in eine Zählkammer.

Berechnen Sie die Anzahl der MNCs. Zentrifugieren Sie die MNC-Suspension 10 Minuten lang bei 300 mal G. Entsorgen Sie den Überstand.

Um eine magnetische Selektion für eins mal 10 bis zur achten Gesamtzellzahl vorzubereiten, suspendieren Sie die MNCs vorsichtig in 300 Mikrolitern MACS-Puffer. Fügen Sie 100 Mikroliter FCR-Blockierungsreagenz und 100 Mikroliter CD133-Antikörper-gebundene superparamagnetische Eisen-Dextran-Partikel hinzu. Mischen Sie dann die Zellsuspension vorsichtig und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius.

Schütteln Sie die Zellsuspension während der Inkubation zwei- bis dreimal vorsichtig. Fügen Sie nach der Inkubation zwei Milliliter MACS-Puffer pro mal 10 Zellen hinzu. Mischen Sie die Zellsuspension vorsichtig und zentrifugieren Sie die Mischung bei 300 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius.

Richten Sie den MACS-Magnethalter ein und befestigen Sie den MACS-Permanentmagneten. Installieren Sie die MACS-Säule und wenden Sie den Vortrennfilter darauf an. Äquilibrieren Sie die erste MACS-Säule und den Vorabscheidefilter mit MACS-Puffer.

Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet wieder in 500 Mikrolitern MACS-Puffer. Tragen Sie die Zellsuspension auf den Vortrennfilter auf. Waschen Sie die MACS-Säule und den Vorabscheidefilter dreimal und entsorgen Sie den Vorabscheidefilter.

Eluieren Sie die Zellfraktion direkt auf die zweite MACS-Säule. Übertragen Sie sofort die erste MACS-Säule über die zweite MACS-Säule und schieben Sie die Zellsuspension mit dem mitgelieferten Kolben durch die MACS-Säule. Waschen Sie die MACS-Säule 3 Mal mit MACS-Puffer.

Eluieren Sie die Zellfraktion aus der Säule, indem Sie MACS-Puffer auf die zweite MACS-Säule geben und die MACS-Säule aus dem MACS-Permanentmagneten entfernen. Übertragen Sie sofort die zweite MACS-Säule über ein Röhrchen und schieben Sie die Suspension der Zelllösung durch die MACS-Säule. Zentrifugieren Sie das Röhrchen.

Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig und suspendieren Sie das Pellet wieder in 100 Mikrolitern MACS-Puffer. Entnehmen Sie eine Probe von einer mal 10 Zellen zu den vierten Zellen für die anschließende durchflusszytometrische Analyse. Die verbleibenden Zellen werden wieder in Kulturmedium suspendiert und fünfmal 10 Zellen in einer 24-Well-Platte für die Transfektion in die vierte Zelle eingepflanzt.

Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius, 5 % CO2 und 20 % O2. Für die Analyse werden zwei 10-Mikroliter-Proben von BM-Aliquoten und eine Probe frisch isolierter CD133-positiver SCs verwendet. Übertragen Sie die Zellen in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen.

Fügen Sie 10 Mikroliter FcR-Blockierungsreagenz hinzu und füllen Sie das Röhrchen mit MACS-Puffer auf ein Volumen von 33 Mikrolitern. Geben Sie die Antikörper auf die Innenseite des Röhrchens. Nachdem alle Antikörper hinzugefügt wurden, schütteln Sie die Antikörperseite des Röhrchens nach unten.

Mischen Sie die Lösung, die ein Endvolumen von 50 Mikrolitern hat, vorsichtig und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang bei vier Grad Celsius. Fügen Sie einen Milliliter eines X roten Blutkörperchens oder einen Erythrozyten-Lysepuffer hinzu. Mischen Sie die Suspension vorsichtig und inkubieren Sie die Lösung 10 Minuten lang auf Eis.

Dann zentrifugieren Sie die Suspension. Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie das erhaltene Pellet in 100 Mikrolitern PBS erneut. Bewertung der Reinheit und Lebensfähigkeit von Zellen durch durchflusszytometrische Messungen.

Verwenden Sie 20 Picomole MIR pro Vertiefung einer 24-Well-Platte. Verdünnen Sie MIR in der 5%igen Glukoselösung auf eine Endkonzentration von 0,25%Pikosolen MIR pro Mikroliter. Verdünnen Sie das PEI in einer gleichen Menge 5%iger Glukoselösung.

Geben Sie anschließend das vorverdünnte PEI in das vorverdünnte MIR und wirbeln Sie es 30 Sekunden lang. Während Sie die MIR-PEI-Komplexe 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren, beschallen Sie die magnetischen Nanopartikel oder MNPs für 20 Minuten bei 35 Kilohertz in einem Raumtemperatur-Ultraschallwasserbad. Stellen Sie sicher, dass sich die Partikel in Suspension befinden und nicht aggregieren.

Geben Sie die beschallten MNPs in die MIR-PEI-Komplexe und wirbeln Sie die Lösung 30 Sekunden lang ein. Inkubieren Sie die MIR PEI MNP-Komplexe 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Geben Sie den MIRNA PEI MNP-Komplex tropfenweise direkt in die entsprechende Vertiefung, die die frisch isolierten CD133-positiven subkutanen Stoffe in Kulturmedium enthält.

Vorsichtig mischen, indem Sie den Teller hin und her wiegen. Inkubieren Sie die Zellen. 18 Stunden nach der Transfektion den Inhalt jeder Vertiefung in einem separaten 1,5-Milliliter-Röhrchen sammeln.

Waschen Sie jede Vertiefung einmal mit 500 Mikrolitern PBS und geben Sie diese Zellsuspension in dasselbe Röhrchen. Dann zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Nach dem Schleudern den Überstand entsorgen und das Pellet in 100 Mikrolitern MACS-Puffer wieder suspendieren.

Fügen Sie 0,5 Mikroliter eines aminreaktiven Farbstoffs hinzu, um zwischen lebenden und toten Zellen zu unterscheiden. Mischen Sie die Suspension vorsichtig und inkubieren Sie die Zellen 10 Minuten lang bei vier Grad Celsius. Fügen Sie einen Milliliter PBS hinzu und zentrifugieren Sie die Zellen erneut bei 300 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius.

Entsorgen Sie den Überstand, suspendieren Sie das erhaltene Pellet wieder in 100 Mikrolitern PBS, fügen Sie 33 Mikroliter 4%iges PFA hinzu und mischen Sie kräftig. Bewertung der MIR-Aufnahmeeffizienz und der transfektionsvermittelten Zytotoxizität durch durchflusszytometrische Messungen. In Anlehnung an die im Protokoll beschriebene Methode wurde durch die Durchflusszytometrie festgestellt, dass die magnetisch angereicherte CD133-positive Zellfraktion eine Lebensfähigkeit und Reinheit von mehr als 80 % ergab. Die hier beschriebene Transfektionsmethode ermöglicht eine hochwirksame Einführung von MIR in diese frisch isolierten humanen CD133-positiven SCs.

Mit einer Aufnahmeeffizienz von ca. 80% lebensfähiger Zellen. Darüber hinaus sind 18 Stunden nach der Transfektion im Vergleich zu Kontrollzellen keine signifikanten zytotoxischen Wirkungen nachweisbar. Darüber hinaus kann eine ausreichende Abgabe und übliche Verteilung der Transfektionskomplexverbindungen im Zytoplasma von Zellen mit Hilfe der strukturierten Beleuchtungsmikroskopie (SIM) beobachtet werden.

Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden, wie z.B. die in vivo Applikation von modifizierten Stammzellen, durchgeführt werden. Dies wird es ermöglichen, das tatsächliche Überleben und die Auswirkungen unter dynamischen Bedingungen zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Transfektion auf Basis von Polymeren und magnetischen Nanopartikeln anwenden können, um microRNA effizient in frisch hämatopoetische Stammzellen einzuführen.