Split-BioID — Proteomic Analyse der kontextspezifischen Proteinkomplexe in ihrer natürlichen zellulären Umgebung

Summary

Wir bieten eine schrittweise Protokoll für Split-BioID, ein Protein-Fragmente-Ergänzung-Assay basiert auf der Nähe-labeling Technik BioID. Auf das Zusammenspiel der zwei bestimmte Proteine aktiviert, ermöglicht es die Proteomik-Analyse der Kontext-abhängige Proteinkomplexe in ihrer natürlichen zellulären Umgebung. Die Methode ist einfach, kostengünstig und erfordert nur standard Laborgeräten.

Abstract

Ergänzend zur bestehenden Affinitätsreinigung (AP) nähert sich zur Identifizierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPI), Enzyme wurden eingeführt, die es ermöglichen die Nähe-abhängige Kennzeichnung der Proteine in lebenden Zellen. Ein solches Enzym, BirA * (verwendet in der BioID Ansatz), vermittelt die biotinylierungen der Proteine in einem Umkreis von ca. 10 nm. Daher können als zu einem Protein des Interesses verschmolzen und in Zellen exprimiert, die Kennzeichnung der proximalen Proteine in ihrer natürlichen Umgebung. Im Gegensatz zu AP, das stützt sich auf die Reinigung des montierten Proteinkomplexe, erkennt BioID Proteine, die gekennzeichnet worden sind, in den Zellen unabhängig davon, ob sie noch mit dem Protein von Interesse interagieren Wenn sie isoliert sind. Da es Biotinylates proximalen Proteine, man kann außerdem kapitalisieren die außergewöhnliche Affinität von Streptavidin für Biotin um sie sehr effizient zu isolieren. Während BioID besser als AP für identifizierende Transient oder schwachen Wechselwirkungen führt, bieten beide AP und BioID Mass Spectrometry Ansätze einen Überblick über alle möglichen Interaktionen, die ein gegebenes Protein haben kann. Jedoch bieten sie keine Informationen über den Kontext der einzelnen identifizierten PPI. In der Tat sind die meisten Proteine in der Regel Bestandteil mehrere komplexe, entsprechend unterschiedliche Reifung Schritte oder verschiedenen Funktionseinheiten. Um diese gemeinsamen Begrenzung beider Methoden zu lösen, haben wir einen PROTEINFRAGMENTE Ergänzung Assay basiert auf dem BirA * Enzym entwickelt. In diesem Test können zwei inaktive Fragmente von BirA * wieder zusammenbauen, in ein aktives Enzym, wenn in der Nähe von zwei interagierenden Proteine gebracht, die sie verschmolzen sind. Der daraus resultierende Split-BioID Test ermöglicht die Kennzeichnung der Proteine, die um ein paar der interagierenden Proteine zu montieren. Sofern diese beiden nur in einem bestimmten Kontext interagieren, ermöglicht Split-BioID dann die Analyse der spezifischen Kontext-abhängige Funktionseinheiten in ihrer natürlichen zellulären Umgebung. Hier bieten wir eine Schritt für Schritt-Protokoll zu testen und ein paar von interagierenden Proteine Split-BioID zuweisen.

Introduction

Da die zelluläre Funktionen von Proteinen, die dynamisch, makromolekulare Komplexe durchgeführt werden zusammenbauen, ist die Identifizierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPI) eine große Bemühung in der biomedizinischen Forschung. In der Tat PPI sind oft bei Krankheit dereguliert und mögliche Ziele für Therapeutik¹vertreten. Die am weitesten verbreitete Methode für die Identifizierung von PPI die Affinität Reinigung (AP) Ansatz in dem ist, nach Lyse der Zelle, ein Protein des Interesses wird speziell auf eine Matrix gereinigt und damit verbundenen Proteine werden anschließend durch Massenspektrometrie identifiziert (MS). AP-MS eine leistungsstarke Ansatz ist, wird in der Regel nicht ausgeführt auf schwerlösliche Proteinkomplexe, sehr flüchtigen Interaktionen oder PPI, die eine intakte subzelluläre Struktur erfordern. Darüber hinaus kann die Interpretation der Daten durch die dynamische Natur der PPI-Netzwerke, kompliziert werden, da ein einziges Protein oft mehrere verschiedene Proteinkomplexe gehört.

Nähe-Kennzeichnung Techniken wie BioID² oder APEX2^3,4 wurden vor kurzem entwickelt, um einige der Einschränkungen der AP-MS Ansätze zu beheben. In BioID katalysiert das Enzym BirA * (entspricht eine G115R Variante des Enzyms Wildtyp E. Coli ) die Bildung von labiler Biotinyl-AMP (Bio-AMP), die mit primären Aminen reagieren kann. Im Gegensatz zu der Wildtyp-Enzym, das Bio-AMP in seinem aktiven Zentrum behält, löst BirA * Bio-AMP, so dass ihre Verbreitung auf die benachbarte Umgebung. Daher können beim verschmolzen zu einem Protein des Interesses und in Zellen exprimiert, proximalen Proteine biotinylierte innerhalb einer Schätzung von 10 nm⁵sein. Diese gekennzeichnet proximalen Proteine werden dann durch Streptavidin Pulldown isoliert und identifiziert durch MS. Im Gegensatz zu AP-MS erfordert BioID Ausdruck ein Fusionsprotein. Es kann also nur an Proteine angewendet werden deren Funktion durch die Kennzeichnung nicht behindert wird. Darüber hinaus die Kennzeichnung ist langsam, in der Regel 6 – 24 h^2,6, machen die Erkennung von kurzlebigen Proteine herausfordernd. Jedoch im Vergleich zu AP-MS, BioID-MS bietet mehrere Vorteile: Erstens sein nehmen die Interaktionen in ihrer natürlichen zellulären Umgebung; zweite, beschriftete Proteine anstatt montierten Anlagen sind isoliert nach Lyse der Zelle; Drittens können Streptavidin Pulldowns mit Geruchsstoffen Puffer und harte Wäsche Bedingungen. Daher ist die Methode mehr empfindlich, um vorübergehende oder schwachen Wechselwirkungen⁷ oder Interaktionen, die auf ein bestimmtes auftreten und schwer zu isolieren, subzelluläre Struktur⁸.

Die meisten Proteine sind jedoch in der Regel Teil des größeren komplexen, die umgestalten können, laut zelluläre Signale oder die Funktion, die ausgeführt werden muss. Ein einziges Protein gehört daher in der Regel mehrere komplexe, entsprechend unterschiedlichen Funktionseinheiten, an denen unterschiedliche und/oder überlappende PPI. Beide Ansätze geben einen Überblick über alle Vereine, die ein gegebenes Protein haben kann, doch sie scheitern an den Kontext der einzelnen PPI. Um die Auflösung des letzteren zu erhöhen, haben wir einen PROTEINFRAGMENTE Ergänzung Assay (PCA) entwickelt, in welche zwei inaktive Fragmente von BirA * (NBirA *, die die katalytische Domäne enthält, und CBirA *, die wie die Re-Aktivierung-Domäne angezeigt werden können) können wieder in ein aktives Enzym, wenn in der Nähe von zwei brachte Interaktion Proteine⁹. Die daraus resultierende Split-BioID Assay Nähe-abhängige biotinylierungen konzentriert sich auf Proteine, die um ein paar der interagierenden Proteine versammeln und somit ermöglicht die Identifikation von Kontext abhängige Protein Baugruppen. Wir demonstriert vor kurzem die herausragende Auflösung macht der Split-BioID durch Lösen von zwei verschiedene Proteinkomplexe der MiRNA-vermittelten gen-silencing Weg⁹beteiligt.

Insgesamt kann in einem einheitlichen und einfachen Assay Split-BioID entdecken und speziell definierten funktionalen Einheiten, in denen ein gegebenen Proteins beteiligt, sofern eine zusätzliche interagierenden Proteins des entsprechenden Proteins komplexe bekannt ist, PPI zuweisen.

Protocol

Hinweis: Eine Übersicht über die Methode ist in Abbildung 1gezeigt.

1. Planung der Klon-Strategie

1. Wählen Sie zwei vermeintlich interagierenden Proteine getestet werden.
   Hinweis: Jeder der beiden Proteine werden zu einem Split-BioID Fragment abgesichert werden: entweder NBirA * oder CBirA *. Als Negativkontrolle, CBirA * Fusionsproteine mit NBirA * verschmolzen, das grün fluoreszierende Protein getestet werden (NBirA *-GLP). Als zusätzliche Kontrolle können die NBirA * Fusionen allein, ohne cognate CBirA * Fusion oder in Kombination mit einem CBirA * verschmolzen zu einem unabhängigen Protein getestet werden. Es ist ratsam, nicht CBirA * benutzen-GFP als Negativkontrolle als es konnte gezeigt werden, konsequent zu wichtigen Hintergrund kombiniert alle NBirA * Fusion Protein⁹führen. Die Ursache für diese Beobachtung möglicherweise die Expression von CBirA *-GFP, viel höher als jede andere CBirA * Fusionsproteine wir bisher verwendet haben, die zu erheblichen Neuzuordnung mit dem NBirA * Fragment führen können.
2. Sobald zwei Proteine ausgewählt sind, Überprüfen der Literatur zu finden, ob beide bereits erfolgreich in funktionelle Studien (z. B. als ein GLP-Tags Fusionsprotein) markiert haben.
   1. Wenn solche Studien vorhanden sind, beachten Sie die Position des Tags (bei N - oder C-Terminus) und verwenden Sie die gleiche Ausrichtung um die Proteine des Interesses mit der Split-BioID Fragmente zu markieren.
   2. Existiert keine solche Studie Plan Konstrukte für beide Proteine kodierenden markiert an der N - und C-Terminus und planen eine Probe zum Testen der Funktionalität von Fusionsproteinen (z. B. ein Rettungs-Experiment in eine Zelllinie erschöpft für das WT-Protein).
      Hinweis: Wenn zwei Fusionsproteine mit den Plasmiden in Abbildung 2 beschrieben, die langen, flexiblen Linker verschlüsseln Paarung, spielt die Ausrichtung von Fusionsproteinen (BirA * Fragmente verschmolzen flussaufwärts oder flussabwärts interessierender Proteine) in der Regel keine Rolle . In der Tat mit FRB und FKBP als Modell Proteine, es zeigte sich, dass alle vier möglichen Iterationen (beide Fragmente in der N-Termini, sowohl auf die C-Termini, an der N-Terminus und die andere dem C-Terminus, und vice versa) ergeben vergleichbare biotinylierungen⁹.
3. Design-Primer, ORFs der beiden Proteine des Interesses für das Klonen in der Split-BioID Plasmide zu verstärken. Achten Sie darauf, dass die Übersetzung Rahmen die BirA * Fragmente identisch sind. Verwenden Sie die Plasmide in Abbildung 2beschrieben, die Restriktionsenzyme PmeI und PacI, um der CBirA * Fusion und die Enzyme ClaI und MluI für die NBirA * Fusion zu konstruieren.
   Hinweis: Die Plasmide in Abbildung 2 dargestellten tragen eine Bi-direktionale Tet-responsive Element flankiert von F3/FRT Rekombination Websites. Dies ermöglicht den regulierten Co Ausdruck in etwa auf dem Niveau der beiden Schmelzverfahren Proteine aus der gleichen Plasmid-¹⁰und die Möglichkeit, schnell zu stabilen Zelllinien durch Rekombination-vermittelten Kassette Austausch (RMCE) konstruieren. In diese Plasmide hat NBirA * einen Myc-Tag CBirA * einen FLAG-Tag. ORFs können selbstverständlich auch auf individuelle Plasmide mit konstitutiven Promotern geklont werden.
   Entscheidender Schritt: Wenn Sie zwei interagierenden Proteine zu testen, es wird empfohlen, NBirA * verschmolzen zu Protein 1 kombiniert mit CBirA * verschmolzen zu Protein 2 vergleichen, und NBirA * verschmolzen Protein 2 kombiniert mit CBirA * mit Protein 1 verschmolzen. In der Tat ist es häufig zu beobachten, dass eine Iteration besser als die andere funktioniert.

2. Klonen ORFs der Gene von Interesse in der Split-BioID Plasmid

Hinweis: In diesem Beispiel gelten zwei Proteinen, die am N-Terminus gekennzeichnet werden kann. Vier Voraussetzungen werden geprüft und im Vergleich zu nicht-transfizierten Zellen (Tabelle 1).

1. Verwenden Sie Polymerase-Kettenreaktion (PCR) verstärken die ORFs der beiden Proteine mit den entsprechenden Primer getestet werden. Design-Primer, die ClaI und MluI Restriktionsschnittstellen für die NBirA * Fusionsproteine und die Standorte für die CBirA * Fusionsproteine PacI und PmeI einzuführen.
   Hinweis: Die PCR kann mit keinem kommerziellen erfolgen bevorzugt Korrekturlesen, DNA-Polymerase. Folgen Sie das Standardprotokoll aus dem Handbuch und Anpassung an die Schmelztemperatur der Primer und die Länge des ORF nach den Herstellerrichtlinien verstärkt werden.
2. Die ersten ORF subclone
   1. Plasmid (etwa 2 μg) und PCR verstärkt ORF1 (bis zu NBirA * fusioniert werden) mit ClaI und MluI zu verdauen. Führen Sie Verdauung Reaktionen mit 1 μl jedes Enzym, gemischt mit das entsprechende Volumen der DNA und Reaktion-Puffer in einem Gesamtvolumen von 20 μl in eine 1,5 mL Tube für 1 h bei 37 ° C.
   2. Führen Sie beide Verdauung Proben auf einem 1 % Agarose-TAE DNA-Gel. Verbrauchssteuern Sie die Bänder entsprechend verdaute Plasmid und ORF1 mit einem sauberen Skalpell und Übertragung auf 1,5 mL Röhrchen.
   3. Beide Bands mit einem standard DNA Extraktion Kit zu reinigen.
   4. Verbinden verdaute Plasmid und ORF1 mit standard Reagenzien.
      1. Wenn mit der Ligatur Kit entnehmen Sie bitte Tabelle von Materialien, verbinden 100 ng DNA enthalten drei bis fünf Mal molaren Überschuss einfügen über Plasmid in einem Gesamtvolumen von 4,5 μl. 5 μL der 2 x T4 Ligase Puffer und 0,5 μl T4 DNA-Ligase aus dem Ligatur-Kit hinzufügen. Führen Sie die Ligatur Reaktion in einem 1,5 mL-Röhrchen für 10 min bei Raumtemperatur (RT).
   5. DH-5α E. Coli zuständigen Standardzellen (zubereitet nach Inoue Methode¹¹) verwandeln.
      1. Mix 3 μL der Ligatur Reaktion mit 50 μl kompetente Zellen in einem 1,5 mL tube auf Eis und inkubieren Sie für 30 min. Transfer der Zellen eine Hitze blockieren auf 42 ° C für 30-45 s und inkubieren Sie dann wieder auf Eis für 2 min. Fügen Sie 250 μl vorgewärmten (37 ° c) Lysogeny Brühe (LB) Medium und Platte 100 μL der Zellen auf einer vorgewärmten (37 ° C) Ampicillin-haltigen LB-Agar-Platte. Die Zellen über Nacht bei 37 ° c inkubieren
   6. Am nächsten Tag wählen Sie vier bis sechs Kolonien und inkubieren sie bei 37 ° C, 180 u/min, Übernachtung in 3 mL LB-Medium mit 100 μg⋅mL^-1 Ampicillin in einer 15 mL Tube.
   7. Isolieren Sie die Plasmiden aus den entnommenen Kolonien mit einem standard-DNA MiniPrep Kit.
   8. Überprüfen Sie die Richtigkeit der Plasmide von Sanger-Sequenzierung mit der Kassette 2 rückwärts-Primer (Tabelle 2).
3. Nachdem ein Plasmid mit dem ersten ORF identifiziert wurde, subclone zweite ORF in diesem Plasmid folgen die gleichen Schritte wie Schritt 2.2 aber mit PmeI und PacI Enzyme.
4. Reihenfolge der daraus resultierenden Plasmide mit Kassette 1 rückwärts-Primer (Tabelle 2).

3. Prüfung der Fusionsproteine

Hinweis: Die folgenden Anweisungen gelten für dual induzierbaren Ausdruck Plasmide (Abbildung 2) und HeLa-11ht Zellen, eine subclonal HeLa-CCL2-Zelllinie, stabil mit dem Ausdruck der reversen Transkription Tetracyclin-gesteuerte Aktivator RtTA-M2 und mit einer Lokus für RMCE¹². Das Wachstumsmedium für diese Zellen ist Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) mit 10 % Tetracyclin-freie fetalen bovine Serum (FBS). Wenn Sie eine andere Zelle Art zu verwenden, müssen genaue Aussaat Bedingungen und Wachstumsmedium angepasst werden.

1. Transiente Transfektion
   1. Samenzellen in einer Konzentration von 1 x 10⁵ Zellen in 2 mL pro Bohrloch eine sechs-Well-Platte am Vortag Transfektion und die Zellen über Nacht bei 37 ° C, 5 % CO₂ in eine Zelle Kultur Inkubator inkubieren.
   2. Am Tag der Transfektion Medium jedes gut entfernen und ersetzen mit 2 mL frisches Medium.
   3. Bereiten Sie die vier Transfektion Reaktionen gemäß Tabelle 1. Fügen Sie für jedes gut zu transfizieren 6 µg Polyethylenimine 3 µg Plasmid DNA in einem 1,5 mL steriles Röhrchen und Füllung 500 µL mit DMEM Medium ohne Serum hinzu.
   4. Inkubieren Sie jede Transfektion Mischung für mindestens 5 min bei Raumtemperatur, vor dem Hinzufügen von Drop weisen in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 ° C, 5 % CO₂.
2. Induktion und Nähe-Kennzeichnung
   1. Am Tag nach der Transfektion, das Medium zu entfernen und ersetzen durch Medium mit Biotin bei 50 µM, biotinylierungen zu stimulieren und Doxycyclin bei 200 Ng⋅mL⁻¹ induzieren die Expression der Fusionsproteine ergänzt. Inkubieren Sie die Zellen für mindestens 20 Stunden bei 37 ° C, 5 % CO₂.
      1. Um eine Stammlösung von Biotin zu machen, auflösen Biotin bei 50 Mg⋅mL^-1 (entspricht ca. 200 mM) in 2 M Ammonium Hydroxid. Sobald es vollständig aufgelöst ist, verdünnen Sie es bis 50 mM in 500 mM Hepes, pH 7,4, dann einstellen des pH-Werts 7,4 mit HCl. Aliquot und die daraus resultierende 1.000 x Stammlösung bei-20 ° C. Doxycyclin bei 10 Mg⋅mL^-1 in 70 % igem Ethanol und Shop in einem Schraubdeckel reaktionscup bei-20 ° C im Dunkeln zu lösen.
3. Zelle lysate Vorbereitung
   1. Waschen Sie die Zellen einmal mit 1 mL kalt (4 ° C) Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS).
   2. Fügen Sie in jede Vertiefung 100 µL der Lyse Puffer (50 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 0,5 % NP-40, 0,5 mM DTT und Protease-Inhibitoren hinzu).
   3. Ernten Sie die Zellen mit einer Zelle Schrotter und Übertragung auf 1,5 mL Röhrchen.
   4. Zentrifugieren Sie die Proben bei 14.000 X g für 10 min bei 4 ° C, Zelle Ablagerungen zu entfernen.
   5. Übertragen Sie die Überstände an frischen Rohre und auf Eis.
   6. Protein-Mengen mit einem Bradford-Test zu bestimmen.
4. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) und Western blotting
   1. Bereiten Sie eine SDS-Polyacrylamid-Gel.
   2. Für jede geräumt lysate, bereiten eine Seite Probe 30 µg (mindestens 15 µg) Protein in insgesamt 30 µL SDS-laden-Puffer. Dann laden Sie gleiche Mengen von jeder Probe (20 µL/Well) auf die SDS-Polyacrylamid-Gel und fahren Sie mit Elektrophorese.
   3. Übertragen Sie nach der Elektrophorese die fraktionierte Proteine auf eine geringe Fluoreszenz PVDF-Blot Membran Standardprotokolls.
      Hinweis: Für die Analyse von Protein-biotinylierungen, eine 10 min Transferzeit mit dem "hohen MW" Programm von einem schnellen transfer halbtrocken, die Western Blot-Gerät in der Regel gut funktioniert.
   4. Blockieren Sie nach der Übertragung die Membran in 5 % Trockenmilch mit PBS-Puffer für 30 min bei RT
   5. Inkubieren Sie die Membran für 30 – 60 min bei RT mit fluoreszierenden Streptavidin conjugate verdünnt 1: 15.000 mit PBS-Puffer mit 2 % BSA und 0,1 % Tween-20.
   6. Waschen Sie die Membran dreimal, jeweils für 10 min. mit PBS mit 0,1 % Tween-20 und dann einmal mehr mit PBS.
   7. Scannen Sie die Membran auf einem Fluoreszenz-Scanner-imaging-System.
      Hinweis: eine typische Western-Blot ist in Abbildung 3gezeigt. Das oben beschriebene Verfahren beschreibt eine Leuchtstoff-basierte Erkennung aber eine Lumineszenz-basierte Erkennung mit HRP-gekoppelte Streptavidin funktioniert genauso gut.

(4) Split-BioID für Proteomics Studien

Kritische Anmerkung: Für die endgültige massenspektrometrische Analyse, alles, was die folgenden Schritte sind in Keratin-freien Bedingungen durchgeführt werden sollte alle Materialien und Reagenzien wie Keratin-frei wie möglich sein.

1. Transiente Transfektion
   1. Am Vortag Transfection Samen drei bis vier 10 cm Platten für jede Bedingung in einer Konzentration von 8 x 10⁵ Zellen in 10 mL pro Platte, und die Zellen über Nacht bei 37 ° C, 5 % CO₂ in eine Zelle Kultur Inkubator inkubieren.
   2. Am nächsten Tag bereiten Sie einen master Transfektion Mix für jede Transfektion Bedingung: für drei Platten pro Zustand, 36 µg Polyethylenimine und 18 µg Plasmid DNA aufgelöst in 900 µL serumfreien DMEM. Inkubieren Sie jeder master-Mix für mindestens 5 min bei RT
   3. In der Zwischenzeit ersetzen Sie das Medium der einzelnen Gerichte mit frischen Medium, und fügen Sie 300 µL der Transfektion Mischungen Tropfen Weise auf jede Platte.
   4. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 ° C, 5 % CO₂.
2. Induktion und Nähe-Kennzeichnung
   1. Übertragen Sie am Tag nach der Transfektion, die Zellen auf 15 cm Gerichte. Für jedes Gericht das Medium zu entfernen, Waschen der Zellen mit 7 mL PBS, 1,5 mL Trypsin-EDTA-Lösung hinzufügen und inkubieren Sie für 5 min bei RT. Fügen Sie 3,5 mL Wachstumsmedium Aufschwemmen der Zellen und die Zellsuspension auf eine 15 cm Schüssel gefüllt mit 20 mL Wachstumsmedium übertragen mit Biotin bei 50 µM, biotinylierungen zu stimulieren und Doxycyclin bei 200 Ng⋅mL⁻¹ (Endkonzentrationen) induzieren die Expression der Fusionsproteine ergänzt.
   2. Inkubieren Sie die Zellen für mindestens 20 Stunden bei 37 ° C, 5 % CO₂.
3. Ernte und Lagerung der Zellen
   1. Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS, dann jede Platte 1,5 mL PBS hinzu und ernten Sie die Zellen mit ein Nahkämpfer.
   2. Die geernteten Zellen entspricht einer Bedingung zu einer 15 mL Tube übertragen und Ernte sie durch Zentrifugation bei 1.200 X g, 5 min, 4 ° C.
   3. Entfernen Sie die Überstände und Snap Pellets Einfrieren in flüssigem Stickstoff, dann bei 80 ° C bis zu Weiterverarbeitung.
      Hinweis: Alternativ Zellen können auch losgelöst von Trypsinization, geerntet im Wachstumsmedium, übertragen eine 15 mL-Tube und vor dem Einfrieren dreimal mit PBS gewaschen.
4. Vorbereitung der Zelle lysates
   1. Aufschwemmen der Zelle Pellets in 1 mL Lyse-Puffer (50 mM Tris pH 7.4, 500 mM NaCl, 0,4 % SDS, 5 mM EDTA, 1 mM DVB-t, 1 x komplette Protease-Hemmer) bei RT Pass die Zellen 10-20 mal (fünf bis zehn Schläge) durch eine 25 G Nadel.
   2. Beschallen Sie die Proben mit einem Sonifikation Gerät.
      Hinweis: Mit dem Sonifikation Gerät gemäß Tabelle der Materialien, das folgende Programm kann verwendet werden: vier Zyklen mit hoher Intensität, 30 s pro Zyklus in einem kalten (4 ° C) Wasserbad. Ein anderes Sonifikation-Gerät eignet sich aber Parameter müssen entsprechend angepasst werden.
   3. Fügen Sie Triton x-100, die wiederhergestellten sonorisiert lysate, eine Endkonzentration von 2 % zu erreichen (in der Regel fügen 100 μL 20 % Triton x-100 bis 900 μl sonorisiert Zelle lysate), und dann 2,3 mL 50 mM Tris, pH = 7,4 pro 1 mL lysate, die NaCl-Konzentration bis zu 150 mM vor b einzustellen Inding zu Streptavidin-gekoppelten Perlen.
      Kritische Anmerkung: Höheren Salzkonzentrationen führen oft zu viel weniger effizient Bindung an die Perlen.
   4. Die bereinigte Lysates in 1,5 mL Tuben zu verteilen (ca. 1,1 mL in drei Tuben) und Zentrifugieren sie auf 16.000 x g, 10 min, 4 ° C.
   5. Die Überstände zu übertragen (ca. 3,2 mL) 15 mL-Tube zu halten 50 – 100 μL als INPUT-Material.
   6. Messen Sie die Konzentration von jeder Probe mit einem Bradford-Test und Gegenwert von 3 bis 3,5 mg Protein-Inhalt für die Streptavidin-Pulldown.
5. Streptavidin-pulldown
   Hinweis: Eine Übersicht über das Pulldown-Verfahren ist in Abbildung 4gezeigt. Es ist fast identisch mit dem ursprünglichen Protokoll von Roux und Kollegen²veröffentlicht. Zum ersten Mal der Pulldown erfolgt, Proben Durchströmung und Wash 1 – 4 können beiseite für Western-Blot Analyse um sicherzustellen das Verfahren funktionierte einwandfrei (Abbildung 5).
   1. Übertragen Sie für jede Bedingung 200 μL der Streptavidin-gekoppelten magnetischen Beads Aussetzung zu einer 1,5 mL-Tube. Legen Sie die Rohre auf einem magnetischen Gestell, warten, bis die Perlen an der Seite der Rohre kleben (ca. 1 min) und entfernen Sie den Puffer speichern.
   2. Waschen Sie die Perlen durch sanft mischen mit 1 mL Gleichgewichtherstellung Puffer (50 mM Tris pH 7 – 4, 150 mM NaCl, 0,05 % Triton x-100 und 1 mM DVB-t).
   3. Versenden Sie die äquilibriert Perlen in gleicher Betrag in die notwendige Anzahl von Rohren (in der Regel zu Beginn mit 3 – 3,5 mg Protein Inhalt, Lysaten aus jede Bedingung in zwei bis vier 1,5 mL Röhrchen versendet werden können) und Platz zurück auf die magnetische Gitter.
   4. Entfernen des Gleichgewichtherstellung Puffers und jeden Satz von Perlen mit gleichen Mengen der entsprechenden Zelle Lysates aus Schritt 4.4.7 Aufschwemmen. Inkubation über Nacht bei 4 ° C auf einem rotierenden Rad.
   5. Am nächsten Tag legen Sie die 1,5 mL Röhrchen auf einem magnetischen Gestell, warten Sie, bis die Perlen halten Sie sich an der Seite der Rohre und die Überstände auf eine 15 mL-Tube mit der Bezeichnung als fließen durch übertragen.
      Hinweis: ab sofort sind alle Schritte bei Raumtemperatur durchgeführt, sofern nicht anders angegeben.
   6. Aufschwemmen der Perlen in jedem Röhrchen mit 200 μl Waschpuffer 1 (2 % SDS im Wasser), und jeder Satz resuspendierte Perlen eine Bedingung in 1,5 mL Röhrchen entsprechend kombinieren.
   7. Waschen Sie die Perlen zweimal für 8 min auf eine Drehung Rad mit 1 mL Waschpuffer 1.
   8. Waschen Sie die Perlen zweimal für 8 min auf eine Drehung Rad mit 1 mL Waschpuffer 2 (50 mM HEPES pH 7.4, 1 mM EDTA, 500 mM NaCl, 1 % Triton X-100 und 0,1 % Na-Deoxycholate).
   9. Waschen Sie die Perlen zweimal für 8 min auf eine Drehung Rad mit 1 mL Waschpuffer 3 (10 mM Tris pH 8, 250 mM LICI, 1 mM EDTA, 0,5 % NP-40 und 0,5 % Na-Deoxycholate).
   10. Waschen Sie die Perlen zweimal für 8 min auf eine Drehung Rad mit 1 mL Waschpuffer 4 (50 mM Tris pH 7.4, 50 mM NaCl, 0,1 % NP-40).
   11. Um sicherzustellen, dass die Waschpuffer vollständig entfernt wird, nachdem die letzte Schritt zu waschen, entfernen die meisten des Überstands und dann spin-down der Proben. Legte sie zurück auf die magnetische Rack, warten Sie, bis die Perlen halten Sie sich an der Seite der Röhren und entfernen Sie dann die verbleibenden Puffer.
   12. Fügen Sie 30 μl der Elution Puffer (10 mM Tris pH 7.4, SDS 2 %, 5 % β-Mercaptoethanol und 2 mM Biotin) zu den Perlen. Bei 98 ° C für 15 min inkubieren Sie, dann entfernen Sie sofort die Perlen auf einem magnetischen Gestell.
   13. Übertragen Sie die eluierten Probe auf eine frische Rohr und speichern bei-20 ° C bis zu Weiterverarbeitung.
6. SDS-PAGE und Western blotting
   Hinweis: Vor der Massenspektrometrie Analyse empfiehlt es zu beurteilen, den Erfolg der biotinylierungen und Pulldown von SDS-PAGE und Western-Blot. Wenn keine biotinylierungen Muster zu beobachten ist, dass man bedenkt, dass kann entweder Dox oder Biotin wurde nicht hinzugefügt, um das Medium oder, dass eines der beiden Stammlösungen gefährdet ist.
   1. Bereiten Sie für jede eingabesample eine Seite Probe durch gleiche Mengen von Protein-Probe mit dem entsprechenden Volumen von 3 X SDS-Loading Buffer in insgesamt 28 μL mischen vor. Bereiten Sie Seite Proben durch das Mischen von 5 µL jeder Elution Probe mit 2,5 µL 3 X SDS-Loading Puffer vor.
   2. Laden Sie die Proben auf einem SDS-Polyacrylamid-Gel (25 µL/Well für Eingänge, 7 µL/Well für Elution Proben). Fahren Sie mit Elektrophorese und Western Blot-wie in Kapitel 3.4 beschrieben.
   3. Wenn den Pulldown zum ersten Mal durchführen, Seite Proben vorbereiten für jeden Schritt des Pulldown (Input, Durchströmung, Wash 1 – 4, Elution) durch das Mischen von 20 µL jeder Probe (Input, Durchströmung, Wash 1 – 4) mit 10 µL 3 x SDS-Loading Puffer oder 5 µL (Elution) mit 2,5 µL 3 x S DS-Loading buffer und gehen Schritt 4.6.4 (Abbildung 5).
7. SDS-PAGE für MS-Analyse
   Hinweis: Zur Minimierung von möglichen Keratin Kontamination können vorgefertigte Gele und kommerziellen Probenpuffer Laden verwendet werden.
   1. 18,75 μL jeder Elution Probe 6,25 μL des 4 X Probenpuffer hinzu und laufen Sie die Proben auf einem 4 – 20 % Fertigteile SDS-Gel, bis sie 2 – 3 cm in das Gel Wandern.
   2. Färben Sie das Gel mit kolloidalem Coomassie brillant Blue G250 Färbung¹³ in einer Petrischale 15 cm.
   3. Verwenden Sie eine saubere Skalpell Verbrauchsteuern die ganze Gassen für jede Probe, ausgenommen die Streptavidin-Band (mit ca. 17 kDa, Abbildung 6), und die ausgeschnittenen Bands auf 1,5 mL Röhrchen übertragen.
   4. Senden Sie diese Proben zu einer Proteomics-Anlage zur weiteren Analyse.
      Hinweis: Typisch MS Ergebnisse sehen Sie in der Referenz 9 (Abbildung 3 und Abbildung 7und zusätzliche Tabellen). Die ganze Datensätze stehen auf der PRIDE-Repository (Zbl-Nummer PXD005005).

Results

Um zu veranschaulichen, wie diese Methode funktioniert, die open Reading Frames (ORFs) der Proteine Ago2, waren TNRC6C und Dicer (alle Beteiligten in der MiRNA-vermittelten gen-silencing Weg) in Split-BioID Plasmiden geklont. Ago2 ist bekannt, in einem MiRNA-induzierte stummschaltungs-Komplex (MiRISC), die Übersetzung unterdrückt mit TNRC6C interagieren und Zerfall des Ziels mRNAs¹⁴zu stimulieren. Vor dem montieren der MiRISC, Ago2 interagieren mit Dicer, das Enzym, das produziert Reifen MiRNAs, in einem Komplex, in dem es mit einem MiRNA¹⁵geladen werden kann. Daher wurde Split-BioID Ago2/Dicer Paar oder das Ago2/TNRC6C paar angewendet. Für jedes Paar von geprüften Proteinen war Ago2 entweder mit NBirA * oder CBirA * über unsere Split-BioID Plasmide (Abbildung 2) verschmolzen und Dicer und TNRC6C zu den entsprechenden cognate BirA * fragment. Darüber hinaus war jedes Protein mit CBirA * verschmolzen und gepaart mit einer NBirA *-GFP Fusion als Negativkontrolle. Dies führt zu testen vier Iterationen für jedes Paar von getesteten Protein (Tabelle 1).

Um zu testen ob Split-BioID auf das Zusammenspiel der beiden getesteten Proteine aktiviert ist, folgten wir das Schema in Abbildung 1dargestellt. Die Plasmide wurden vorübergehend in einer Tet-System kompatibel HeLa Zelllinie transfiziert. Der Ausdruck der Fusionsproteine mit Doxycyclin (Dox) induziert wurde und biotinylierungen wurde angeregt, indem das Wachstumsmedium überschüssiges Biotin hinzufügen. Nach einer Inkubationszeit von 20 h mit Dox und Biotin wurden Zellen lysiert und analysiert durch westliche Beflecken mit konjugierten Streptavidin biotinylierte Proteine erkennen. In Säugetierzellen zwei großen Bands werden in der Regel von der konjugierten Streptavidin im untransfected Beispiel (Abbildung 3, Sterne) erkannt und endogen biotinylierte Proteine (höchstwahrscheinlich mitochondriale Carboxylases) entsprechen. Diese beiden Bands sind vorhanden in allen Proben und können bequem als interne Belastung Steuerelemente verwendet werden, also die Erkennung eines Housekeeping Proteins, das Laden der gleichen Protein-Mengen zu kontrollieren ist überflüssig. Typisch für ein BioID/Split-BioID Experiment, sind die zusätzlichen großen Bands, die beobachtet werden können die Fusionsproteine, die selbst-biotinylierte bekam. Auch wenn kein anderer biotinylierte Protein zu sehen ist, zeigt biotinylierungen die Fusionsproteine bereits in diesem Stadium zu erkennen, dass die beiden getesteten Proteine in den Zellen interagiert. Im Experiment auf Abbildung 3dargestellt, es ist klar, dass ein NBirA *-Ago2 Fusionsproteins gepaart mit CBirA * Fusionen, TNRC6C oder Dicer ist effizienter als die gegenüberliegenden Kombinationen in der CBirA *-Ago2 paart sich zu NBirA * Fusionen der beiden anderen Proteine (Abbildung 3, obere Leiste vergleichen die Intensitäten der Fahrspuren 2-3 Bahnen 6-7). Darüber hinaus war die Aktivierung spezifisch, da keiner der Fusionen CBirA * NBirA * aktivieren konnte-GFP Kontrolle Schmelzverfahren Protein zu spürbaren Niveaus (Abbildung 3, vergleichen Bahnen 1, 4-5 auf Bahn 8, die untransfected Zellen entspricht). Da in unserem Plasmide NBirA * verfügt über ein Myc-Tag und CBirA * verfügt über ein FLAG-Tag (Abbildung 2), können die Ausdruck Ebenen der einzelnen Schmelzverfahren Protein mit Antikörpern gegen diese zwei Tags (Abbildung 3, Bodenplatte) analysiert werden.

Interaktion-induzierte biotinylierungen beobachtet wird, das Experiment kann hochskaliert werden, als die biotinylierte Proteine isoliert auf Streptavidin-gekoppelten Perlen wie in Ziffer 4 des Protokolls (Abbildung 4) angegeben. Wenn Sie die Isolierung zum ersten Mal durchführen, können alle Schritte der Reinigung durch Western Blot (Abbildung 5) analysiert werden. In der Regel sollte Bindung an die Perlen fast quantitative und praktisch kein Leck durch in den Waschungen beachtet werden. Vor der Verarbeitung der Proben für die Massenspektrometrie, empfehlen wir die Ausführung ein Western-Blot damit induzierte biotinylierungen arbeitete als erwartet und die Fusionsproteine zum Ausdruck gebracht wurden. Das Fehlen des Ausdrucks die Fusionsproteine ist aufgrund schlechter Transfektion Effizienz oder fehlerhafte Dox Induktion. Wenn die Fusionsproteine zum Ausdruck gebracht wurden, aber keine biotinylierungen beobachtet, überprüfen Sie, wenn überschüssiges Biotin (50 μM) tatsächlich auf das Medium hinzugefügt wurde und dass die Lager Biotin noch aktiv ist. Wenn der eluierten Material auf einem Coomassie gefärbt Protein Gel (Abbildung 6), in der Regel analysiert wurde, die stärkste Band zu beachten läuft bei etwa 17 kDa und Monomeren Streptavidin entspricht. Bands, die entsprechend der endogenen biotinylierte Proteine und die Fusionsproteine können auch beobachtet werden. Wir schneiden in der Regel Bereich der Probe Spur über dem Streptavidin-Band bis zu den Laden gut (Abbildung 6). Die ausgeschnittene Band kann in eine 1,5 mL-Tube gespeichert und an eine Massenspektrometrie-Anlage gesendet. Alternativ können gebundene Proteine auch an den Streptavidin-gekoppelten Perlen Trypsin verdaut und eluiert verdauten Peptide bilden die Spalte. Wir nutzen regelmäßig die MaxQuant Software¹⁶ (mit meist Standardparameter und Lysin biotinylierungen als eine mögliche Post-translationale Modifikation hinzufügen, finden Sie unter Referenz 9 für weitere Einzelheiten und typische MS-Ergebnisse), die MS-raw-Daten zu analysieren und die Perseus Suite¹⁷ für die anschließende statistische Analyse, beide sind freie Software. Beispiele sind in der Regel in drei biologische Wiederholungen ausgeführt. Verwendung von markierungsfreie Quantifizierung können speziell angereicherte Proteine über Kontrolle Bedingungen identifiziert werden. Um zu Filtern für endogen biotinylierte Proteine und Proteine, die nicht ausdrücklich durch das Enzym BirA * gekennzeichnet sind, betrachten wir nur Proteine, die deutlich über Hits aus sechs Datensätze generiert mit sechs unabhängigen Proteinen angereichert sind. Darüber hinaus berücksichtigen wir nur Hits, die über ein Split-BioID Dataset angereichert sind, wurden durch NBirA * NBirA * Fusionsproteine ersetzt-GFP. Andere Daten-Analyse-Strategien sind vor allem mit stabilen Isotopen Etikettierung mit Aminosäuren in der Zellkultur (SILAC) für quantitative Proteomik¹⁸vorgeschlagen worden. Darüber hinaus wurden verschiedene Strategien für die direkte Isolierung biotinylierte Peptide mit einer Streptavidin-Variante mit geschwächten Affinität zu Biotin¹⁸, spezielle Elution Bedingungen mit organischen Lösungsmitteln¹⁹ oder Biotin-spezifische beschrieben Antikörper-^20,-²¹. Während nicht unbedingt führt zur Entdeckung von mehr Proteine, die Identifizierung von biotinylierungen Websites hinzufügen mehr Vertrauen hinsichtlich der Spezifität der Hits und ist nützlich, wenn Adressierung der Topologie einer Interaktion.

Abbildung 1: Überblick über das Split-BioID Verfahren. Eiweiß 1 interagiert mit Protein 2 im Rahmen der komplexen A oder Protein 3 als Teil der komplexen B. Um speziell die Zusammensetzung der Komplex A Sonde, kann Proteine 1 und 2 Split-BioID zugewiesen werden. Das Foto des Massenspektrometers ist unter einer Creative Commons Attribution-Share gleichermaßen 3.0 Unported Lizenz und wurde von https://commons.wikimedia.org mit Dateinamen von ThermoScientificOrbitrapElite.JPG heruntergeladen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2: Split-BioID Plasmide Expressionskassetten. Wir bieten vier Plasmide um alle Kombinationen von NBirA * und CBirA * Fusionsproteine testen zu können. Die Plasmide und komplette Karten sind erhältlich bei addgene.org unter den angegebenen Nummern. Die Plasmide haben einen Tet-responsive Element (7 X TetO) und müssen in einer Zelllinie verwendet werden, die mit dem Tet-Ausdruck-System kompatibel ist. Beachten Sie auch, dass in allen Plasmiden ORFs FKBP und FRB zu NBirA verschmolzen * und CBirA * bzw. Fragmente. Diese beiden Proteine interagieren nur in Anwesenheit von Rapamycin und daher können Plasmide verwendet werden, um das System schnell in das Vorhandensein oder Fehlen von diesem chemischen⁹zu testen. Die angegebenen Restriktionsschnittstellen sind einzigartig. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3: typische Western-Blot für ein Split-BioID Experiment. Obere Leiste: Erkennung von biotinylierte Proteine mit Gewebekulturen beschrifteten Streptavidin. Untere Leiste: Erkennung von Fusionsproteinen mit Anti-Myc und Anti-FLAG Antikörper. Zwei Paare der Proteine wurden getestet: Ago2/TNRC6C und Ago2/Dicer. In Gassen, 2 & 3 war das CBirA * Fragment Ago2 angefügt. In Gassen 6 & 7 war das NBirA * Fragment Ago2 angefügt. Kein signifikantes Signal wurde beobachtet, wenn jede der drei Proteine mit NBirA * kombiniert wurden-GLP (Bahnen 1, 4-5). Die Sterne zeigen die Bänder entsprechend endogen biotinylierte Proteine, die als interne laden Kontrollen dienen können. Diese Zahl ist aus Abbildung 5 b von Schopp Et Al. adaptiert ⁹ unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International-Lizenz. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 4: Überblick über die Streptavidin-Pulldown-Verfahren. Wichtige Schritte für die Isolierung von biotinylierte Proteine für Massenspektrometrie Analyse werden dargestellt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 5: typische Western-Blot für ein Streptavidin-Pulldown-Experiment. Gleiche Volumina der angegebenen Samples auf ein SDS-Polyacrylamid-Gel geladen wurden. Nach Western blotting, wurden mit HRP-gekoppelte Streptavidin biotinylierte Proteine entdeckt. Bands, die entsprechenden NBirA *-TNRC6C und CBirA *-Ago2 angegeben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 6: typische Coomassie gefärbt Protein Gel für Massenspektrometrie Analyse. Die eluierten Probe von Streptavidin-gekoppelten Perlen war auf einem vorgefertigten Protein Gel geladen und ausgeführt, bis die Probe Migrieren von 2-3 cm. Die großen Band gesehen bei etwa 17 kDa ist Streptavidin. Direkt oberhalb der Band ist ausgeschnitten und an einer Massenspektrometrie-Anlage gesendet. Bands, die entsprechenden NBirA *-TNRC6C und CBirA *-Ago2 angegeben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Transfektion Probe	Zustand geprüft
1	NBirA *-protein1 / CBirA *-protein2
2	CBirA *-protein1 / NBirA *-protein2
3	NBirA *-GLP / CBirA *-protein1
4	NBirA *-GLP / CBirA *-protein2
5	keine Transfektion

Tabelle 1: In der Regel getestet Bedingungen beim Split-BioID anwenden auf zwei Proteine.

Sequenzierung Grundierung	Sequenz
Kassette 1 rückwärts-Primer (CBirA * Fusion)	TATACTTTCTAGAGAATAGGAAC
Kassette 2 rückwärts-Primer (NBirA * Fusion)	GTGGTTTGTCCAAACTCATC

Tabelle 2: Sequenzierung Primer für die Split-BioID Plasmide.

Discussion

Das skizzierte Verfahren beschreibt, wie Gene von Interesse in der Split-BioID Klonen Plasmide, wie Interaktion-induzierte biotinylierungen getestet und biotinylierte Proteine für Massenspektrometrie Analyse isolieren. Wir beschreiben hier die Prozedur beruht auf Transiente Transfektion. Während der Ausdruck die Fusionsproteine um den Betrag der Dox hinzugefügt, um das Medium angepasst werden kann, kann Transiente Transfektion zu inhomogenen Proteinexpression mit einigen Zellen führen, die grob die Fusionsproteine im Vergleich zu den endogenen overexpress Pendants. Dies kann zu Verzerrungen des entsprechenden Interactomes und PPI, die nicht treu die Interaktionen widerspiegeln, die die körpereigene Proteine beinhalten. Es empfiehlt sich also in der Regel zu stabilen Zelllinien zu konstruieren, nach Split-BioID mit dem transient System etabliert hat. Plasmide sind kompatibel mit dem Flp-vermittelten Rekombinationssystem und legen beide Gene von Interesse im Rahmen der Verordnung des gleichen Tet-responsive Elements. Bei Bedarf und bei Verwendung mit kompatiblen Säugerzellen, ermöglichen sie die einfache Erstellung von stabil induzierbaren Zelllinien. Zum Beispiel verwenden wir die HeLa-EM2-11-Linie, die drückt den RtTA Tetracyclin-aktivierte Transkription Aktivator und eine einzigartige Aktionsleisten genomischen Locus aus dem Tetracyclin-vermittelten Genexpression streng regulierte¹²sein kann. Mit dieser Zelllinie und Flp-vermittelten Rekombination, stabilen Zelllinien, die nur eine Kopie des Transgens enthalten innerhalb von zwei bis drei Wochen erhalten. Alternativ könnte man auch aktuelle Genom Schnitttechniken verwenden, einzuführen die BirA * Fragmente in den nativen genomic Loci der Gene von Interesse.

Wie in jedem Assay, das Tagging ein Protein angewiesen ist, muss man prüfen, ob die resultierende Fusionsproteine funktionsfähig sind. Verfügbare Daten in die interessierenden Proteine (z. B. mit GFP für bildgebenden Verfahren) markiert wurden und funktional getestet eignen sich zu entscheiden, ob die BirA * Fragmente werden sollte geklont stromaufwärts oder stromabwärts die Gene von Interesse. Wenn keine solchen Daten verfügbar sind, sollte man N-Terminal Testen oder C-Terminal Tag Proteine in eine funktionelle Assay. Beispielsweise kann die Aktivität der Schmelzverfahren Proteine in einer Zelllinie getestet werden, in denen das körpereigene Protein herausgetrennten und wurde im Vergleich zu Wildtyp. Wenn die Proteine des Interesses beide N und C-terminalen Tags vertragen, sollten beide getestet werden. In der Tat kann die Ausrichtung des Fusionsproteins in BioID Experimente, die Effizienz der Kennzeichnung²²beeinflussen. Darüber hinaus haben wir beobachtet, dass wenn ein paar Proteine Split-BioID zuweisen, welche der beiden Proteine, entweder die NBirA angehängt wird * oder CBirA * fragment auch Einfluss die Effizienz der Beschriftung⁹. In den Split-BioID Plasmiden die 16 Aminosäuren lange Glycin/Serin Reich Linker Kopplung der interessierenden Proteine an die BirA * Fragmente wurden weitere PCA²³ entnommen und für uns tätig sind, damit alle interagierenden Proteine haben wir bisher getestet. Allerdings sollte man bedenken, dass einige Protein-Paare mit kürzeren oder längeren Linker besser funktionieren könnte. Der letzte Hinweis wurde ein weiterer Test von Bollen Gruppe²⁴beschrieben. In diesem Assay BirA * an einem anderen Standort (E140/Q141) als bei uns (E256/G257) gliedert. Wir haben beide Split-BioID Aromen Side-by-Side getestet und festgestellt, dass E256/G257, beschrieben in diesem Protokoll zu stärkeren Re-Aktivierung führt, wenn Sie an zwei interagierenden Proteine gekoppelt⁹.

Ein allgemeiner Nachteil dieser Methode ist die langsame Geschwindigkeit der Beschriftung. 6 bis 24 h Inkubationszeit mit Biotin ist normalerweise notwendig, spürbare biotinylierungen⁶, die Nutzung dieser Technik zur Untersuchung dynamischer Umbau von Proteinkomplexen ausschließt zu erhalten. Während dieser Assay teilweise diesem Vorbehalt befasst, da es nur aktiviert wird, wenn zwei Proteine interagieren, die langsame Geschwindigkeit der Kennzeichnung schließt seine Verwendung für das Studium als Reaktion auf sehr dynamische Prozesse oder kurzlebige Proteine zu analysieren. Veränderter Peroxidase bekanntermaßen APEX2 fördern effiziente Kennzeichnung der proximalen Proteine innerhalb von 1 min-³. Ein Partnerschafts-und Kooperationsabkommen basierend auf APEX2 könnte so die Grenzen der Kennzeichnung langsame BioID abgeleitet Assays einzugehen. Eine Proof of Principle Studie beschrieben so ein Split-APEX2 Assay²⁵. Obwohl ein Homodimerizing Protein biotinylierte erfolgreich war, bleibt ob der Test auch verwendet werden kann, zu kennzeichnen und identifizieren Proteine, die zusammenbauen, um ein paar der interagierenden Proteine jedoch um nachgewiesen werden. Vor kurzem wurde gerichtete Evolution zur Erstellung TurboID und MiniTurbo, zwei Varianten der BirA * mit verstärkten Aktivität, die viel kürzer Kennzeichnung Zeitfenster, bis zu 10 min²⁶zu ermöglichen. Anpassung der Split-BioID für diese neuen Varianten wird die Verwendung dieser Technik, um ein breiteres Anwendungsfeld weiter ausbauen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Essigsäure (glazial)	VWR	20104.298	Zur Herstellung von TAE-Puffer
Agarose Sigma		A9539	Einnahme von TAE-Agarose-Gelen für die DNA-Analyse und -Extraktion
Ammoniaklösung 25% NH3	Bernd Kraft	6012	Zum Auflösen von Biotin
Ampicillin	Sigma	A9518	Zur Selektion transformierter Bakterien
Bioruptor plus Sonifikationsgerät	Diagenode	B01020001	Andere Sonifikationsgeräte sind auch in Ordnung
Biotin	Sigma	B4639	Zur Zugabe zum Wachstumsmedium zur Stimulierung einer effizienten Biotinylierung
Rinderserumalbuminfraktion V	Carl Roth	8076	Wird in Western-Blot-Puffern und einem Proteinstandard in Bradford-Assays verwendet
Bradford Ultra Reagenz	Expedeon	BFU05L	Jede andere Methode/jedes andere Kit zur Proteinbestimmung ist in Ordnung, dieses spezielle Reagenz ist toleranter gegenüber Detergenzien als andere Bradford-Reagenzien
Zellschaber	TPP	99002	Jedes andere Modell ist auch in Ordnung
ClaI	New England Biolabs	R0197	Restriktionsenzym zum Klonieren in die Split-BioID-Plasmide (NBirA*-Fusion)
DMEM-Medium	Sigma	D6046	Wenn Sie eine andere Zelllinie verwenden, verwenden Sie das entsprechende optimale Wachstumsmedium
DNA-Miniprep-Kit	Sigma	PLN350	Jedes andere Kit ist auch in Ordnung
Doxycyclin	Applichem	A2951	Dox ist lichtempfindlich
DTT	Applichem	A2948	Stellen Sie 1M Stammlösung her, lagern Sie bei -20 ° C und verwenden Sie immer frisches
DyLight 680-konjugiertes Streptavidin	Thermo scientific	21848	zur Verwendung mit einem LiCor Western-Blot-Scangerät
Dynabeads MyOne Streptavidin C1	Invitrogen	65002	Die C1-Kügelchen sind nicht BSA-beschichtet, was für nachgelagerte MS-Anwendungen vorzuziehen ist (kein Durchtreten von BSA in der endgültigen Elution)
EDTA	Applichem	A5097	Stellen Sie eine 500 mM Stamm her, stellen Sie den pH-Wert auf 8 ein, während Sie das EDTA-Pulver auflösen
Ethanol	Sigma	32205	Stellen Sie eine 70%ige Stammlösung her, in der Doxycyclin bei 10 mg.mL-1
Fastgene Gel/PCR DNA-Extraktionskit	Nippon Genetics	FG-91302	Jedes andere Kit ist auch in Ordnung
HCl 37%	Merck	1.00317.1000	Zur Einstellung des pH-Werts der Biotin-Stammlösung
HEPES	Carl Roth	6763	Stellen Sie eine 500 mM Stammlösung her, stellen Sie den pH-Wert auf 7,4
ein Immobilon-FL PVDF-Membran, 0,45  &Mikro; m	Millipore	IPFL00010	Diese Membran zeigt eine minimale Autofluoreszenz, wenn sie mit einem LiCor Western Blot-Scangerät
LiCl	Grü ssing GmbH	12083	Make a 5M stock
solution Odyssey CLx imaging system	LI-COR	N/A	Zum Scannen der Western-Blot-Membran, die mit einem fluorophor-markierten Antikörper dekoriert
ist Lineares Polyethylenimin (PEI)	Polysciences	23966-2	Jedes andere Transfektionsreagenz ist ebenfalls fein
Milchpulver	Carl Roth	T145	Zum Blockieren von Western-Blot-Membranen
MluI-HF	New England Biolabs	R3198	Restriktionsenzym für die Klonierung in die Split-BioID-Plasmide (NBirA*-Fusion)
Na-Desoxycholat	Sigma	30970	Herstellung einer 10%igen (w/v) Stammlösung
NaCl	Sigma	31434	Herstellung einer 5M Stammlösung
NP-40 (Nonidet P40 Ersatz)	Sigma	74385	Herstellung einer 20%igen (v/v) Stammlösung
PacI	New England Biolabs	R0547	Restriktionsenzym zum Klonieren in die Split-BioID-Plasmide (CBirA*-Fusion)
Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS)	Sigma	806552	Zum Waschen von Zellen vor dem Verschrotten
PmeI	New England Biolabs	R0560	Restriktionsenzym zum Klonieren in die Split-BioID-Plasmide (CBirA*-Fusion)
Proteasehemmer-Cocktail	Roche	4693132001	Dem Lysepuffer zugesetzt, um Protein zu verhindern Abbau
pSF3-Flag-CBir-FRB_Myc-NBir-FKBP	Addgen	90003	Split-BioID Plasmid, vermittelt die Co-Expression von NBirA*-FKBP und CBirA*-FRB, FKBP und FRB können durch zwei weitere ORFs ersetzt werden
pSF3-Flag-CBir-FRB_FKBP-Myc-Nbir	Addgen	90004	Split-BioID Plasmid, vermittelt die Co-Expression von FKBP-NBirA* und CBirA*-FRB, FKBP und FRB können durch zwei weitere ORFs ersetzt werden
pSF3-Flag-FRB-Cbir_ Myc-NBir-FKBP	Addgen	90008	Split-BioID Plasmid, vermittelt die Co-Expression von NBirA*-FKBP und FRB-CBirA*, FKBP und FRB können durch zwei andere ORFs ersetzt werden
pSF3-Flag-FRB-Cbir_FKBP-Myc-Nbir	Addgene	90009	Split-BioID Plasmid, vermittelt die Co-Expression von FKBP-NBirA* und FRB-CBirA*, FKBP und FRB können durch zwei weitere ORFs ersetzt werden
Q5 High-Fidelity PCR Kit	New England Biolabs	E0555S	Zur Amplifikation der ORF-Kodierung für die zu testenden Proteine. Jede andere thermostabile DNA-Polymerase ist in Ordnung.
Schnelles Ligatur-Kit	New England Biolabs	M2200S	Für die Ligation von DNA-Fragmenten in die Split-BioID-Plasmide ist jedes andere DNA-Ligatursystem in Ordnung.
RunBlue 4-20% SDS-Fertiggele	Expedeon	BCG42012	Zur Verwendung bei der Probenentnahme für die MS-Analyse
RunBlue LDS Probenpuffer	Expedeon	NXB31010	Laufpuffer für die RunBlue Fertiggele
SDS	Sigma	5030	Kommt als 20%ige Stammlösung
tetfreies Serum	Biowest	S181T	verwenden wir tetfreies Serum, um die basale Expression der Fusionsproteine zu minimieren
Trans-Blot Turbo Transfersystem	Bio-Rad	1704150	Hochgeschwindigkeits-Western-Blotting-Transfersystem, jedes andere Transfersystem ist auch in Ordnung
Tris	Carl Roth	4855	Herstellung von 1M Stammlösungen mit adäquatem pH (7,4 und 8)
Triton X-100	Applichem	A4975	Herstellung einer 20%igen (v/v) Stammlösung
Tween-20	Carl Roth	9127	Bei der Verwendung in Western-Blot-Puffern führt Tween 20 zu einer hohen Hintergrundfluoreszenz und sollte im Blockierungs- und letzten Waschschritt weggelassen werden