Hier präsentieren wir Ihnen die präklinische Vorführung von krebsbekämpfende Cumarine mit 3D Culture und Zebrafisch.
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Methodenartikel
Präklinische Bewertung der Bioaktivität der Anti-Krebs Cumarin OT48 Sphäroide, Kolonie Bildung Assays und Zebrafisch Xenotransplantate
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
In Vitro und in Vivo prä-klinischen Screening von neuartiger Therapeutika sind ein wesentliches Instrument in der Drogeentdeckung Krebs. Obwohl menschliche Krebszelllinien therapeutischen Verbindungen in 2D (dreidimensionale) Monoschicht Zellkulturen Rechnung zu tragen, wurden 3D Culture Systeme entwickelt, um die Wirksamkeit von Medikamenten in mehr physiologisch relevanten Modelle zu verstehen. In den letzten Jahren verzeichneten ein Paradigmenwechsel in der präklinischen Forschung, die Potenz der neuen Moleküle in 3D Culture Systeme, genauer imitiert den Tumor Mikroumgebung zu validieren. Diese Systeme den Krankheitszustand zu charakterisieren, in gewissem Sinne mehr physiologisch relevanten und helfen, besser mechanistische Einblicke und Verständnis der pharmakologischen Potenz eines bestimmten Moleküls. Darüber hinaus ist mit dem aktuellen Trend in Vivo Krebs Modelle zu verbessern, Zebrafisch entstanden, als ein wichtiges fest gefügten Modell zu bewerten in Vivo Tumorbildung und Studie die Wirkung von therapeutischen Wirkstoffen. Hier untersuchten wir die therapeutische Wirksamkeit des Hydroxycoumarin OT48 allein oder in Kombination mit BH3-Mimetika in Lunge-Krebs-Zell-Linie A549 mithilfe von drei verschiedenen 3D Culture-Systeme einschließlich der Kolonie Bildung Assays (CFA), Sphäroid Bildung Assay (SFA) und in Vivo Zebrafisch Xenotransplantate.
Einleitung
Krebs wird durch zelluläre Mutationen verursacht und folglich biochemischen Signalwege gestört werden, unkontrollierte Zellteilung und Widerstand zum Zelltod auszulösen. Tumoren stören mit physiologischen Funktionen von Verdauungs, Nervensystem, Herz-Kreislauf-Systems und anschließend benachbarte Gewebe1. Trotz umfangreicher Forschungsbemühungen bleibt Krebs die häufigste lebensbedrohliche Krankheit in der Welt2. Präzisions-Medizin wurde als Grundlage für zukünftige Krebstherapie anerkannt. Neue Wirkstoffe werden routinemäßig getestet in Kombination mit vorhandenen Drogen, klinische Outcome zu verbessern.
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Protokoll
(1) Kolonie Bildung Assays
- Kultur A549 Zellen in einer Konzentration von 20.000 Zellen/cm2 in 15 mL RPMI1640 Zelle Kulturmedium ergänzt mit 10 % FBS (fetale Rinderserum) und 1 % Antibiotika in einem 75 cm2 Kolben in eine CO2 Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2.
- Am Tag des Experiments bestimmen Sie die Zellkonzentration mithilfe eines Hemocytometer. Sammeln Sie 50.000 Zellen durch Zentrifugation bei 400 X g für 7 min in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch und auszusetzen Sie Zellen in 100 µL 1 X sterile PBS (Phosphat gepufferte Kochsalzlösung) in 1,5 mL Röhrchen wieder.
- 1,1 mL halbfeste M....
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Ergebnisse
In Abbildung 2Lungenkrebs Zelllinie, die A549 in MCBM Form Kolonien nach der Behandlung mit OT48 allein oder in Kombination mit BH3 mimetischen A1210477 in den angegebenen Konzentrationen ausgesät wurde. Die Ergebnisse zeigten, dass die Kombination Anzahl, Größe und Fläche der Kolonien nach 10 Tagen Inkubation deutlich reduziert.
In Abbildung 3A549 Zellen wurden mit OT4.......
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Diskussion
Die Preise der Kolonie Formation mit MCBM erhalten richtet sich nach dem Zelltyp. Für nicht-anhaftende Zellen, wird die Anzahl der Kolonien in der Regel viel höher mit adhärenten Zellen verglichen. Wir beobachteten, dass A549 Zellen nach 10 Tagen 30 bis 40 Kolonien gegründet. Zuvor haben wir für verschiedene Leukämiezellen berichtet, dass die Anzahl der Kolonien zwischen 200 bis 2509ist. Unsere Ergebnisse zeigten, dass OT48 allein keine signifikante Abnahme der Anzahl der Kolonien allein herstellt.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Forschung an der SNU wird unterstützt durch die National Research Foundation (NRF) von MEST Korea für Tumor Mikroumgebung Global Core Research Center (GCRC) Zuschuss, [Grant-Nummer 2011-0030001]; von der Seoul National University Research Grant und Gehirn Korea (BK21) PLUS Programm.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Erforderliche Materialien für Assays zur Koloniebildung | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | 37 C° |
| RPMI 1640 | Lonza | 30096 | 4 C° |
| FBS | Biowest | S1520-500-20 | C° |
| Penicillin-Streptomycin | Lonza | 17-602E-20 | C° |
| Zellkulturflasche T75 | SPL | 70075 | RT |
| PBS-Lösung | Hyclone | SH30256.02 | RT |
| 1,5 ml Röhrchen | Extragene | Tube-170-C | RT |
| 15 ml Röhrchen | Hyundai Micro | H20015 | RT |
| 12 Well Platte | SPL | 30012 | RT |
| MethoCult | StemCell technologies | 4230-20 | C° |
| Thiazolylblaues Tetrazoliumbromid (MTT-Pulver) | Sigma | M5622 | 4 C° |
| LAS4000 | GE Healthcare Technologies | RT | |
| strong>Erforderliche Materialien für den Sphäroidbildungsassay | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | 37 C° |
| RPMI 1640 | Lonza | 30096 | 4 C° |
| FBS | Biowest | S1520-500-20 | C° |
| Penicillin-Streptomycin | Lonza | 17-602E-20 | C° |
| Zellkulturkolben T75 | SPL | 70075 | RT |
| PBS-Lösung | Hyclone | SH30256.02 | |
| RT Trypsin-EDTA | Gibco | 25-300-054 | 4 C° |
| Corning Costar Ultra Low Attachemnt 96 Well Platte | Corning | 3474 | RT |
| Mikroskopie | Nikon | Eclipse TS100 | RT |
| strong>Erforderliche Materialien für Zebrafisch-Xenotransplantate> | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | 37 C° |
| RPMI 1640 | Lonza | 30096 | 4 C° |
| FBS | Biowest | S1520-500-20 | C° |
| Penicillin-Streptomycin | Lonza | 17-602E-20 | C° |
| Zellkulturflasche T25 | SPL | 70025 | RT |
| Zellkulturflasche T75 | SPL | 70075 | RT |
| Zellkulturflasche T175 | SPL | 71175 | RT |
| 1,5 ml Röhrchen | Extragene | Tube-170-C | RT |
| 24-Well-Platte | SPL | 30024 | RT |
| Petrischale | SPL | 10100 | RT |
| PBS-Lösung | Hyklon | SH30256.02 | RT |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25-300-054 | 4 C° |
| Natriumchlorid | Sigma-Aldrich | 71382 | RT |
| Kaliumchlorid (KCL) | Sigma-Aldrich | P9541 | RT |
| Magnesiumsulfat-Heptahydrat (MgSO4.7H2O) | Sigma-Aldrich | M2773 | RT |
| Calciumnitrat-Tetrahydrat (Ca(NO3)2) | Sigma-Aldrich | C1396 | RT |
| HEPES-Lösung | Sigma-Aldrich | H0887 | RT |
| Ethyl-3-aminobenzoat-Methansulfonat (Tricain) | Sigma-Aldrich | E10521 | RT |
| Phenolrotlösung | Sigma-Aldrich | P0290 | RT |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | RT |
| 1-Phenyl-2-thioharnstoff (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | RT |
| CM-Dil-Farbstoff | Invitrogen | C7001-20 | C° |
| Glaskapillare | World Precision Instruments | TW 100F-4 | RT |
| Mikropipettenabzieher | Shutter Instrument, USA | P-97 | RT |
| Mikroinjektor | World Precision Instruments | PV820 | RT |
| Spritze | KOVAX | 1ml | RT |
| Micro Loader | Eppendorf | 5242956003 | RT |
| Glasobjektträger | Marienfeld | HSU-1000612 | RT |
| Fluoreszenzmikroskopie | Leica | DE/DM 5000B | RT |
Referenzen
- Giancotti, F. G. Deregulation of cell signaling in cancer. FEBS Letters. 588 (16), 2558-2570 (2014).
- Knowlton, S., Onal, S., Yu, C. H., Zhao, J. J., Tasoglu, S. Bioprinting for cancer research. Trends in Biotechnology. 33 (9), 504-513 (2015).
- Santo, V. E., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
