Einfache und effektive Verwaltung und Visualisierung von Mikropartikeln im Herz-Kreislauf-System von kleinen Fischen mit Niere Injektion

Summary

Dieser Artikel beschreibt die Grundsätze der eine schnelle, minimal-invasive Injektion von fluoreszierenden Mikropartikel in der Circulatory system von kleinen Fischen und in Vivo Visualisierung von Mikropartikeln Fisch im Blut.

Abstract

Die systemische Gabe von Mikro-Größe Partikel in einem lebenden Organismus kann zur Gefäßsystem Visualisierung, Drogen und Impfung, Implantation von transgenen Zellen und kleine optische Sensoren eingesetzt werden. Jedoch intravenöse Mikroinjektionen in kleine Tiere, die meist in biologischen und veterinärmedizinischen Laboratorien verwendet werden, sind sehr schwer und erfordert geschultes Personal. Hier zeigen wir eine robuste und effiziente Methode für die Einführung von Mikropartikeln in das Kreislaufsystem der Erwachsenen Zebrafisch (Danio Rerio) durch Injektion in die Fisch-Niere. Um die eingeführten Mikropartikel in das Gefäßsystem zu visualisieren, schlagen wir eine einfache intravitalen bildgebende Verfahren in Kiemen. Überwachung von Zebrafisch-Blut-pH in Vivo wurde erreicht mit einem injizierten mikroverkapselte Leuchtstofflampen Sonde, SNARF-1, eine der möglichen Anwendungen von der beschriebenen Technik demonstrieren. Dieser Artikel enthält eine ausführliche Beschreibung der Kapselung des pH-sensitiven Farbstoffs und zeigt die Grundsätze der schnelle Injektion und Visualisierung der erhaltenen Mikrokapseln für in Vivo Aufnahme das Fluoreszenzsignal. Die vorgeschlagene Methode der Injektion zeichnet sich durch eine niedrige Sterblichkeitsrate (0-20 %) und hohe Effizienz (70-90 % Erfolg), und es ist leicht, Institut, mit handelsüblichen Geräten. Alle beschriebene Verfahren können auf anderen kleinen Fischarten wie Guppys und Medaka durchgeführt werden.

Introduction

Die Verwaltung der Mikro-Größe Partikel in den tierischen Organismus ist eine wichtige Aufgabe in Bereichen wie Drogen und Impfstoff Lieferung¹, Gefäßsystem Visualisierung², transgenen Zelle Implantation³und winzigen optischen Sensor implantation ^{4 , 5}. der Implantation für Microscale Partikel in das Gefäßsystem von kleinen Labortieren ist jedoch schwierig, vor allem für empfindliche Wasserorganismen. Für populäre Forschung Exemplare wie Zebrafisch, ist es ratsam, die diese Verfahren mit Videoprotokolle geklärt werden.

Protocol

Alle experimentelle Verfahren wurden im Einklang mit der EU-Richtlinie 2010/63/EU für Tierversuche und die Tier Themen Forschung Ausschusses des Instituts für Biologie an Irkutsk Landesuniversität genehmigt worden.

1. Herstellung von Mikrokapseln

Hinweis: Mikrokapseln mit einem Fluoreszenzfarbstoff werden mit einer Schicht für Schicht Versammlung entgegengesetzt geladenen Polyelektrolyten^7,8zubereitet. Alle Verfahren wurden bei Raumtemperatur durchgeführt.

1. Um poröse CaCO₃ Microcores umschließt den Fluoreszenzfarbstoff zu synthetisiere....

Results

Die erzielten Ergebnisse stammen aus einer der drei Hauptkategorien des Protokolls präsentiert: die Bildung von fluoreszierenden Mikropartikel durch Verkapselung von einem Fluoreszenzfarbstoff (Abbildung 1), die Niere Injektion von Mikrokapseln mit weiteren Visualisierung in Gill Kapillaren (Abbildung 2 und 3) und schließlich die in Vivo spektrale Aufnahme SNARF-1 Fluoreszenz zu überwach.......

Discussion

Um die Injektion von Mikropartikeln in der Zebrafisch-Niere zu demonstrieren, haben wir semipermeable Mikrokapseln mit einem indikatorfarbstoff geladen. Das Protokoll enthält Anweisungen für die Herstellung der Mikrokapseln mit der Schicht für Schicht Versammlung von entgegengesetzt geladenen Polyelektrolyten^{7,8,15,16,17 ,18}.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
SNARF-1-dextran, 70000 MW	Thermo Fisher Scientific	D3304	Leuchtstoffsonde. Jeder andere geeignete polymergebundene Fluoreszenzfarbstoff kann als Mikrokapselfüllstoff verwendet werden
Albumin-Fluorescein-Isothiocyanat-Konjugat (FITC-BSA)	SIGMA	A9771	Fluoreszenzsonde
Rhodamin B Isothiocyanat-Dextran (RITC-dextran)	SIGMA	R9379	Fluoreszenzsonde
Calciumchlorid	SIGMA	C1016	CaCO3 Template-Bildung
Natriumcarbonat	SIGMA	S7795	CaCO3 Matrizenbildung
Poly(allylaminhydrochlorid), MW 50000 (PAK)	SIGMA	283215	Kationisches Polymer
Poly(Natrium-4-styrolsulfonat), MW 70000 (PSS)	SIGMA	243051	Anionisches Polymer
Poly-L-lysin [20 kDa] gepfropft mit Polyethylenglykol [5 kDa], g = 3,0 bis 4,5 (PLL-g-PEG)	SuSoS	PLL(20)- g[3.5]-PEG(5)	Endpolymer zur Erhöhung der Biokompatibilität von Mikrokapseln
Natriumchlorid	SIGMA	S8776	Zum Auflösen aufgetragener Polymere
Wasseraufbereitungssystem	Millipore	SIMSV0000	Zur Herstellung von deionisiertem Wasser
Magnetrührer	Stegler		Für die Bildung
von CaCO3 TemplatesEppendorf  Forschung  plus Pipette, 1000 & Mikro; L	Eppendorf		Dosierlösungen
Eppendorf  Forschung  plus Pipette, 10 & Mikro; L	Eppendorf		Dosierlösungen
Pipettenspitzen, Volumenbereich 200 bis 1000 & Mikro; L	F.L. Medical	28093	Dosierlösungen
Pipettenspitzen, Volumenbereich 0,1-10  μ L	Eppendorf	Z640069	Dosierlösungen
Mini-Zentrifuge Microspin 12, High-Speed	BioSan		Für das Zentrifugations-Waschverfahren von Mikrokapseln
Mikrozentrifugenröhrchen, 2 mL	Eppendorf	Z666513	Mikrokapselsynthese und -lagerung
Shaker Intelli-Mischer RM-1L	ELMY Ltd.		Zur Reduzierung der Mikrokapselaggregation
Ultraschallreiniger			Zur Reduzierung der Mikrokapselaggregation
Kopfhörer			Zum Schutz der Ohren vor Ultraschall
Ethylendiamintetraessigsäure	SIGMA	EDS	Zum Auflösen der CaCO3 Schablonen
Mononatriumphosphat	SIGMA	S9638	Herstellung von pH-Puffern
Dinatriumphosphat	SIGMA	S9390	Herstellung von pH-Puffern
Natriumhydroxid	SIGMA	S8045	Zur Einstellung des pH-Werts der EDTA-Lösung und der Puffer
Thermostatkammer			Zum Trocknen von Mikrokapseln auf Glasobjektträger
Hämozytometer-Blutzahlkammer			Zur Untersuchung der Größe, Verteilung und Konzentration der vorbereiteten Mikrokapseln
Fluoreszenzmikroskop Mikmed 2	LOMO		In-vivo-Visualisierung von Mikrokapseln in Fischblut
Satz Fluoreszenzfilter für SNARF-1 (sollte je nach Mikroskopmodell gewählt werden; Beispiel wird mitgeliefert)	Chroma	79010	Visualisierung von Mikrokapseln mit Fluoreszenzsonden
Faserspektrometer QE Pro	Ocean Optics		Kalibrierung von Mikrokapseln unter
Mikroskop Optische Faser QP400-2-VIS NIR, 400 μ m, 2 m	Ocean Optics		Zum Verbinden des Spektrometers mit dem Mikroskopanschluss
Kollimator F280SMA-A	Thorlabs		Zum Verbinden des Spektrometers mit dem Mikroskopanschluss
Objektträger aus Glas	Fisherbrand	12-550-A3	Kalibrierung von Mikrokapseln unter
dem Mikroskop Deckgläser, 22 x 22 mm	Pearl	MS-SLIDCV	Kalibrierung von Mikrokapseln unter dem Mikroskop
Glas-Mikrokapillaren Intra MARK, 10 µ L	Blaubrand	BR708709	Zur Sammlung von Fischblut
Nelkenöl	SIGMA	C8392	Fischanästhesie
Lanzette Nr. 11	Apexmed international B.V.	P00588	Zum Schneiden des Fischschwanzes und zum Lösen der Stahlnadel von der Spitze des Insulin-Autoinjektors
Heparin, 5000 U/mL	Calbiochem	L6510-BC	Zur Behandlung aller Oberflächen, die bei der Blutentnahme von Fischen mit Fischblut in Berührung kommen
Seven 2 Go Pro pH-Meter mit Mikroelektrode	Mettler Toledo		Zur Bestimmung des pH-Werts von Fischblut
Insulin-Pen-Nadeln Micro-Fine Plus, 0,25 x 5 mm	Becton, Dickinson and Company		Für das Injektionsverfahren. Jede dünne Nadel (& Oslash; 0,33 mm oder weniger) ist geeignet
Glaskapillaren, 1 x 75 mm	Hirschmann Laborger & te GmbH & Co	9201075	Für Injektionsverfahren
Gasbrenner			Zum Löten von Stahlnadel an Glaskapillare
Mikroinjektor IM-9B	NARISHIGE		Für die präzise Dosierung von Mikrokapseln Suspension
Petrischale, 60 mm x 15 mm, Polystyrol	SIGMA	P5481	Für Manipulationen mit Fischen unter Narkose
Kunststofflöffel			Für Manipulationen mit Fischen unter Narkose
Feuchter Schwamm			Für Manipulationen mit Fischen unter Narkose
Präparierschere	Thermo Scientific	31212	Zum Entfernen der Kiemenabdeckung vom Fischkopf
Pasteurpipette, 3,5 mL	MARKE	Z331767	Zum Befeuchten von Fischkiemen