Verwendung von zwei dimensionale Semi-denaturierenden Waschmittel Agarose Gelelektrophorese Größe Heterogenität von Amyloid oder Amyloid-wie Fasern zu bestätigen

Zusammenfassung

Hier verwenden wir zweidimensionale Semi-denaturierenden Agarose-Gelelektrophorese bestätigen das Vorhandensein von Amyloid-wie Fasern von heterogenen Größe und die Möglichkeit, die die Größe Heterogenität durch Dissoziation der Amyloid Fasern während des Gels ist ausgeschlossen laufenden Prozess.

Zusammenfassung

Amyloid oder Amyloid-ähnliche Fasern wurden mit vielen menschlichen Krankheiten und sind jetzt wichtig für viele Signalwege entdeckt. Die Fähigkeit, die Bildung dieser Fasern unter verschiedenen experimentellen Bedingungen leicht zu erkennen ist wichtig für das Verständnis ihrer potenzialfunktion. Viele Methoden wurden verwendet, um die Fasern zu erkennen, aber nicht ohne einige Nachteile. Elektronenmikroskopie (EM) oder Färbung mit Kongo-rot oder Thioflavin T oft erfordert z. B. Reinigung der Fasern. Auf der anderen Seite ermöglicht Waschmittel Semi-denaturierenden Agarose-Gelelektrophorese (SDD-Alter) Erkennung der SDS-resistente Amyloid-ähnliche Fasern in zellextrakte ohne Reinigung. Darüber hinaus ermöglicht es den Vergleich der Größenunterschied der Fasern. Noch wichtiger ist, kann verwendet werden, um bestimmte Proteine innerhalb der Fasern durch westliche Beflecken zu identifizieren. Es ist weniger zeitaufwändig und leichter zugänglich, eine größere Zahl von Labs. SDD-Alter Ergebnisse zeigen oft Variablen Grad der Heterogenität. Es stellt sich die Frage ob die Dissoziation der Proteinkomplex während der Elektrophorese in Anwesenheit von SDS Bestandteil der Heterogenität entsteht. Aus diesem Grund haben wir eine zweite Dimension der SDD-alt sein, um festzustellen, ob die Größe Heterogenität in SDD-Alter gesehen wirklich ein Ergebnis der Faser Heterogenität in Vivo und kein Ergebnis einer Verschlechterung oder Dissoziation von einige der Proteine während beschäftigt Elektrophorese. Diese Methode ermöglicht schnelle und qualitative Bestätigung, das Amyloid oder Amyloid-ähnliche Fasern nicht teilweise während des Prozesses der SDD-Alter entkoppelt sind.

Einleitung

Die Bildung von Amyloid Fasern durch Protein misfolding ist seit langem bekannt in pathologischen Erkrankungen wie Morbus Alzheimer, Morbus Parkinson und Huntington-Krankheit¹eine Rolle spielen. In jüngerer Zeit, die Bildung von Amyloid oder Amyloid-ähnliche Fasern nachweislich die Signalwege bei Menschen, auch während der Anti-virale angeborene Immune Antwort² und Necroptosis^3,4, und bei niederen Organismen gehören z. B. Hefe^5,6. Daher ist die Fähigkeit, diese Fasern im Labor erkennen wichtig. Derzeit gibt es drei Arten Amyloid und Amyloid-wie Fasern zu erkennen: die Verwendung von Farbstoffen, EM und SDD-Alter.

Die Verwendung von Farbstoffen, z. B. Kongo-rot oder Thioflavin T, bietet den Vorteil, schnell und leicht nachweisbar mit Mikroskopie oder Spektroskopie⁷. Erkennung von Mikroskopie, im Falle von Kongo-rot, bietet jedoch keine Besonderheit, welche Proteine die Fasern oder die Größe der Fasern bestehen. Ebenso bietet die Verwendung der Spektroskopie, Kongo-rot oder Thioflavin T Bindung an Proteinkomplexe erkennen nur ein positives oder negatives Ergebnis.

EM bietet schlüssige Beweise für die Anwesenheit von Fasern und auch quantitative Informationen über die Faser Länge und Durchmesser⁸. Diese Methode erfordert jedoch sehr strenge Reinigung. Darüber hinaus ist EM eine spezielle Technik, die teure Ausrüstung verwendet.

SDD-AGE wurde zur SDS-resistente Mega Dalton Proteinkomplexe einschließlich amyloide oder Amyloid-wie Fasern zu erkennen. Es bietet viele Vorteile. Erstens, es erfordert nicht die Reinigung der Fasern und ist leicht zu Peform⁹. Zweitens bietet es qualitative Informationen über die Größe der Fasern, einschließlich der relativen Größe und Menge der Faser Heterogenicity. Schließlich, weil westliche Beflecken nach Elektrophorese durchgeführt werden kann, ist es einfach, das Vorhandensein von jedem, das Protein für die ist ein Antikörper erkennen, obwohl anzumerken ist, dass da SDD-Alter Semi-denaturierenden ist, einige Epitope verdeckt die verbleiben können Erkennung erschwert von Antikörpern.

Vor kurzem, Rezeptor Interaktion Proteinkinase 1 (RIPK1) und 3 (RIPK3) gemeldet wurden, Form Amyloid Fasern dienen als Signalisierung Plattformen während der Necroptosis, eine programmierte Form der Nekrose³. Während des Studiums diese Fasern, zeigte unserem Labor, dass ein anderes Necroptosis-assoziierten Protein, gemischte Abstammung Kinase-Domäne-wie (MLKL), auch Amyloid-wie Fasern⁴gebildet. Allerdings erschien bei Betrachtung mit dem SDD-Alter, die Größe der MLKL Fasern unterscheidet sich von der RIPK1 und RIPK3 Fasern, die identisch zueinander (Abbildung 1) erschienen. Das war unerwartet, da es bekannt ist, dass MLKL an RIPK1/RIPK3 bindet bilden die Necroptosis Signalisierung Komplex namens Necrosome¹⁰.

Es gibt mindestens zwei Erklärungen. Zunächst zwei völlig unterschiedliche Amyloid-wie Fasern können während der Necroptosis, ein mit RIPK1/RIPK3 und die andere mit MLKL bilden. Zweitens ist nur eine Art von Amyloid-wie Fasern, die mit RIPK1/RIPK3/MLKL bei Necroptosis, sondern die Vereinigung des MLKL mit anderen Proteinen entstehen kann schwach genug, die es während der SDD-Alter distanziert.

Um dieses Problem anzugehen, schlagen wir eine zweidimensionale (2D) SDD-Alter durchführen. SDD-Alter-Stable Amyloid oder Amyloid-wie Fasern haben das gleiche Migration Muster während der ersten und zweiten Dimension Elektrophorese. Dies wird nach der Proteine auf eine Membran übertragen und ein Western-Blot nachweisbar sein. Stabilere Fasern zeigen eine scharfe Muster mit diagonalen Streifen. Jede Abweichung von diesem würde vorschlagen, dass die Fasern durch die SDS-Elektrophorese verändern.

Protokoll

1. Proben vorbereiten

1. Kultur 2 x 10⁶ Amyloid Herstellung von HT-29 Darmkrebszellen in einer Gewebekultur 10 cm Schale in 10 mL von Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) mit 10 % fötalen Rinderserum und Penicillin-Streptomycin. Zellkulturen über Nacht in einem Inkubator 37 ° C mit 5 % CO₂.
   1. Nachdem die Zellen zu 80 % Konfluenz wachsen, Waschen der Zellen mit 10 mL der Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS). 3 mL Trypsin-Lösung hinzugeben und bei 37 ° C für 3 min inkubieren.
   2. Nachdem die Zellen aus der Schale vollständig dissoziiert sind, fügen Sie 10 mL Kulturmedium und übertragen Sie die Zellen mit einer 10 mL-Pipette auf eine 15 mL konische Rohr. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 1.000 x g für 3 min bei Raumtemperatur. Aspirieren Sie das Medium, Aufschwemmen der Zellen in 5 mL Kulturmedium und zählen Sie die Zellen, die Zelle Zähler. Platte 2 x 10⁶ Zellen in jedem der zwei 10-cm-Gerichte.
   3. Lassen Sie die Zellen haften und über Nacht in einem Inkubator 37 ° C mit 5 % CO₂zu erholen. Wenden Sie Behandlung auf ein Gericht induzieren die Bildung von amyloiden mit 20 ng/mL Tumor-Nekrose-Faktor-Alpha (TNF-α), 100 nM Smac-mimetischen und 20 µM Pan-Caspase Inhibitor Z-VAD-FMK^{11 an}. Die Kombination wird als ASZ abgekürzt. Die andere Schale mit Fahrzeug als ein Steuerelement zu behandeln.
2. Nach der entsprechenden Länge der Zeit in der Regel 6 h Ernte der Zelle lysate.
   1. Kratzen Sie die Zellen aus der Platte mit einem Plastikschaber und verwenden Sie eine 10-mL-Pipette in ein 15 mL konische Rohr übertragen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 1.000 x g für 3 min bei 4 ° C.
   2. Waschen Sie die Zellen 2 mal von resuspending in 10 mL Eis kaltem PBS und Zentrifugieren bei 1.000 x g für 3 min bei 4 ° C. Aspirieren Sie die PBS-Lösung.
      Hinweis: Der Prozess kann hier durch Einfrieren der Zelle Pellet in flüssigem Stickstoff und Lagerung bei ˗80 ° C für bis zu 1 Monat angehalten werden.
   3. Übertragen Sie die Zelle Pellet zu einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch und inkubieren Sie in 0,3 mL Lyse-Puffer für 30 min auf Eis. Zentrifuge bei 20.000 x g für 15 min bei 4 ° C. Der Überstand ist die ganze Zelle lysate.
      Hinweis: Der Prozess kann hier durch die Speicherung der Probe bei-20 ° C bis zu mehreren Monaten angehalten werden.
   4. Messen Sie die Proteinkonzentration von Bradford-Test laut Protokoll des Herstellers. Fügen Sie 4 x SDD-Alter laden Puffer 20 µL 3 µg/µL Probe vorbereiten und in 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.

2. bereiten Sie vor und führen Sie Gele aus

1. Fügen Sie 2 g Agarose, 200 mL 1 X Tris-Acetat-Puffer (TAE) in ein Becherglas und Hitze in der Mikrowelle zu schmelzen die Agarose. Fügen Sie 1 mL 20 % SDS für eine Endkonzentration von 0,1 % SDS. Schwenken Sie vorsichtig mischen. Achten Sie darauf, keine um Luftblasen nach der SDS-Zugabe zu generieren.
2. Gießen Sie die Agarose-Lösung in eine Gel-Platte 15 x 14 cm. Verwenden Sie eine 1-mL-Pipette, um eventuell Luftblasen zu beseitigen. Legen Sie eine 20-Well-Kamm an der Spitze.
3. Erste dimension: Pipette 60 µg ganze Zelle lysate auf der rechten Spur. Führen Sie das Gel bei 60 V für ca. 4 h (bis Farbstoff vorne ca. ¾ durch das Gel ist) mit der TAE mit 0,1 % SDS als der laufenden Puffer.
4. Zweite dimension: Drehen Sie vorsichtig das Gel 90° gegen den Uhrzeigersinn (Abb. 2A). Führen Sie das Gel bei 60 V für ca. 4 h.
   Hinweis: Die laufenden Allgemeinzustand ist 4 V/cm Gel Länge. Es ist wichtig, dass die Betriebsbedingungen für die erste und zweite Abmessungen identisch sind.

(3) Übertragung

1. Verwenden Sie die Kapillare Übertragungsmethode, um die Proteine auf einer Polyvinylidene Difluoride (PVDF) Membran (Abbildung 2B) zu übertragen.
   1. Geben Sie 500 mL Übertragung Puffers, ein ca. 20 cm x 20 cm Container. Machen Sie einen 5 cm hohen Stapel Papier Handtücher neben dem Container. Die Fläche von oben auf den Stapel muss größer als die Gel-Dimensionen sein.
   2. Transfer-Puffer ein 14 cm x 15 cm-Filterpapier einziehen und oben auf dem Stapel Papier Handtuch legen. Achten Sie darauf, um auf dem Papier keine Falten oder Bläschen zu platzieren. Wiederholen Sie mit einem anderen Stück Filterpapier.
   3. Aktivieren eine 14 x 15 cm-PVDF-Membran in Methanol für 30 s Schicht es dann auf dem Filterpapier kümmert sich um eine Walze zu verwenden, um alle Luftblasen zu entfernen. Spülen Sie das Gel mit Transfer-Puffer und Schicht es oben auf der Membran, die Bläschen wieder Ausrollen.
   4. Decken Sie den Rand des am nächsten an den Container des Transfer-Puffer mit Plastikfolie Papierhandtücher. Es ist wichtig, dass die papierene Brücke gebaut im nächsten Schritt nicht in direkten Kontakt mit dem Papier-Handtuch-Stack kommt.
   5. Genießen Sie ein Stück Filterpapier 15 x 35 cm in Transfer-Puffer und legen Sie sie so einseitig die Oberseite des Gels bedeckt und das andere Ende im Container des Transfer-Puffer ist. Wiederholen Sie dies mit einer weiteren Brücke.
   6. Decken Sie den Container mit Plastikfolie und lassen Sie über Nacht bei Raumtemperatur.

4. Western Blot-Erkennung

1. Spülen Sie die Membran mit 50 mL PBS mit 0,05 % Tween-20 (PBST) in einem Container 20 × 20 cm. 20 mL 5 % Milch in PBST hinzugeben. Felsen bei Raumtemperatur für 30 min zu blockieren.
2. Pipette 10 µL Kaninchen-Anti-MLKL-Antikörper in 20 mL 5 % Milch in PBST und füllen in den Behälter. Wippe über Nacht bei 4 ° c inkubieren
3. Waschen Sie die Membran für 5 min. Wiederholen Sie 5 Mal in 20 mL PBST.
4. Pipette 4 µL anti-rabbit-HRP 20 ml 5 % Milch in PBST und füllen in den Behälter. Wippe in 2 h bei Raumtemperatur inkubieren.
5. Waschen Sie die Membran für 5 min. Wiederholen Sie 5 Mal in 20 mL PBST.
6. Verstärkte Chemilumineszenz Substrat (ECL) hinzufügen und Röntgenfilme laut Protokoll des Herstellers setzen.

Ergebnisse

Nach Necroptosis Induktion zeigten RIPK1 und RIPK3 fast identische Amyloid-Mustern (Bahnen 2 und 4, Abbildung 1). Jedoch MLKL Fasern wurden heterogener und schien kleiner als RIPK1/RIPK3 Fasern (Bahn 6, Abbildung 1). Das veranlasste uns, die 2D SDD-Alter-Methode, um die Möglichkeit zu befassen, ob MLKL RIPK1/RIPK3-unabhängige Fasern bildet oder MLKL einfach distanziert sich von den großen RIPK1/RIPK3/MLKL-Fasern während SDD-Alter...

Diskussion

Der wichtigste Aspekt des 2D SDD-Zeitalters ist, dass die Elektrophorese-Bedingungen für die erste und zweite Dimension gleich sind. Die Fähigkeit zu erkennen, eine scharfe diagonale Linie auf 45° (d. h., die keine Dissoziation oder Verschlechterung eingetreten ist) hängt von der Fasern, die Migration in identischer Weise sowohl bei electrophoreses. Mit unterschiedlichen Bedingungen, zum Beispiel indem die Spannung oder die Länge der Laufzeit, werden diese Ergebnisse verdecken. Auch, wie bei traditionellen 1D der Fall is...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Gelelektrophoresegerät	Fisher	HE99XPRO	Appratus für den Gellauf.
agrose	VWR	97062-250	Für Agarosegel.
Papierturm	Fisher	19-120-2484	zum Übertragen von
Filterpapier	VWR	21427-386	zum Übertragen von
PVDF-Membran	Bio-Rad	162-0177	zum Übertragen von
blockierendem Milchpulver	Bio-Rad	1706404XTU	zum Blockieren im Western Blot
MLKL-Antikörper	Genetex	GTX107538	Kaninchen-Anti-MLKL-Antikörper
RIPK1 Antikörper	BD Biosciences	610459	Maus Anti-RIPK1 Antikörper
RIPK3 Antikörper	Geschenk von Dr. Xiaodong Wang		Kaninchen Anti-RIPK3. Siehe Refenenz 11.
anti-Kaninchen-HRP	Sigma	A6154	Sekundärantikörper
ECL	Fisher	WBKLS0500	Western chemilumineszierendes HRP-Substrat
Röntgenfilm	Fisher	F-BX810	für Western Blot Ergebnis
DMEM	Sigma	D6429	für Zellkultur
fötales Rinderserum	Sigma	F4135	für Zellkultur
Penicilin-Streptomycin,	Sigma	P4333	für die Zellkultur
Trypsinlösung	Sigma	T4049	für die Zellkultur
PBS für die Gewebekultur	Sigma	D8662	für die Zellkultur
rekombinantes TNF	hergestellt in unserem Labor		zur Induktion der Nekroptose. Siehe Referenz 11.
smac-mimetisches	Geschenk von Dr. Xiaodong Wang		zur Induktion der Nekroptose. Siehe Referenz 11.
ZVAD-FMK	ApexBio	A1902	zur Induktion von Nekroptose. Siehe Referenz 11.
Zellzähler	Bio-Rad	1450102	Modell TC20; zum Zählen von Zellen
Pierce™ BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225	zur Messung der Proteinkonzentration in Zelllysaten
Cell	Lifter Fisher	07-200-364	zur Entnahme von Zellen aus der Schale
Lysepuffer (1 L)			20 mL 1 M Tris pH 7,4 10 mL Glycerin 30 mL 5 M NaCl 840 mL ddH2O 10 mL Triton-X100 (Protease- und Phosphatinhibitoren) wie gewünscht)
10X TAE (1 L)48,4			g Tris base 11,42 mL Eisessig 20 mL 0,5 M EDTA pH 8 ddH20 bis 1 L
4X SDD-AGE Ladepuffer (50 mL)			5 mL 10X TAE 10 mL Glycerin 4 mL 20% SDS 0,5 mL 10% Bromphenolblau 31 mL ddH2O
TBS-Transferpuffer (1 L)			20 mL 1 M Tris pH 7,4 30 mL 5 M NaCl 950 mL ddH2O
PBST-Waschpuffer (1 L)			100 mL 10xPBS 800 mL ddH2O 1 mL Tween20
10X PBS (10 L)			800 g NaCl 20 g KCl 144 g Na2HPO4· 2H2O 24 g KH2PO4 ddH2O bis 10 L hinzufügen