Verwendung von zwei dimensionale Semi-denaturierenden Waschmittel Agarose Gelelektrophorese Größe Heterogenität von Amyloid oder Amyloid-wie Fasern zu bestätigen

Zusammenfassung

Hier verwenden wir zweidimensionale Semi-denaturierenden Agarose-Gelelektrophorese bestätigen das Vorhandensein von Amyloid-wie Fasern von heterogenen Größe und die Möglichkeit, die die Größe Heterogenität durch Dissoziation der Amyloid Fasern während des Gels ist ausgeschlossen laufenden Prozess.

Zusammenfassung

Amyloid oder Amyloid-ähnliche Fasern wurden mit vielen menschlichen Krankheiten und sind jetzt wichtig für viele Signalwege entdeckt. Die Fähigkeit, die Bildung dieser Fasern unter verschiedenen experimentellen Bedingungen leicht zu erkennen ist wichtig für das Verständnis ihrer potenzialfunktion. Viele Methoden wurden verwendet, um die Fasern zu erkennen, aber nicht ohne einige Nachteile. Elektronenmikroskopie (EM) oder Färbung mit Kongo-rot oder Thioflavin T oft erfordert z. B. Reinigung der Fasern. Auf der anderen Seite ermöglicht Waschmittel Semi-denaturierenden Agarose-Gelelektrophorese (SDD-Alter) Erkennung der SDS-resistente Amyloid-ähnliche Fasern in zellextrakte ohne Reinigung. Darüber hinaus ermöglicht es den Vergleich der Größenunterschied der Fasern. Noch wichtiger ist, kann verwendet werden, um bestimmte Proteine innerhalb der Fasern durch westliche Beflecken zu identifizieren. Es ist weniger zeitaufwändig und leichter zugänglich, eine größere Zahl von Labs. SDD-Alter Ergebnisse zeigen oft Variablen Grad der Heterogenität. Es stellt sich die Frage ob die Dissoziation der Proteinkomplex während der Elektrophorese in Anwesenheit von SDS Bestandteil der Heterogenität entsteht. Aus diesem Grund haben wir eine zweite Dimension der SDD-alt sein, um festzustellen, ob die Größe Heterogenität in SDD-Alter gesehen wirklich ein Ergebnis der Faser Heterogenität in Vivo und kein Ergebnis einer Verschlechterung oder Dissoziation von einige der Proteine während beschäftigt Elektrophorese. Diese Methode ermöglicht schnelle und qualitative Bestätigung, das Amyloid oder Amyloid-ähnliche Fasern nicht teilweise während des Prozesses der SDD-Alter entkoppelt sind.

Einleitung

Die Bildung von Amyloid Fasern durch Protein misfolding ist seit langem bekannt in pathologischen Erkrankungen wie Morbus Alzheimer, Morbus Parkinson und Huntington-Krankheit¹eine Rolle spielen. In jüngerer Zeit, die Bildung von Amyloid oder Amyloid-ähnliche Fasern nachweislich die Signalwege bei Menschen, auch während der Anti-virale angeborene Immune Antwort² und Necroptosis^3,4, und bei niederen Organismen gehören z. B. Hefe^5,6. Daher ist die Fähigkeit, diese Fasern im Labor erkennen wichtig. Derzeit gi....

Protokoll

1. Proben vorbereiten

1. Kultur 2 x 10⁶ Amyloid Herstellung von HT-29 Darmkrebszellen in einer Gewebekultur 10 cm Schale in 10 mL von Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) mit 10 % fötalen Rinderserum und Penicillin-Streptomycin. Zellkulturen über Nacht in einem Inkubator 37 ° C mit 5 % CO₂.
   1. Nachdem die Zellen zu 80 % Konfluenz wachsen, Waschen der Zellen mit 10 mL der Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS). 3 mL Trypsin-Lösung hinzugeben und bei 37 ° C für 3 min inkubieren.
   2. Nachdem die Zellen aus der Schale vollständig dissoziiert sind, fügen Sie 10 mL Kulturmedium und übertragen Sie die Zellen mit einer 10 mL-Pipett....

Ergebnisse

Nach Necroptosis Induktion zeigten RIPK1 und RIPK3 fast identische Amyloid-Mustern (Bahnen 2 und 4, Abbildung 1). Jedoch MLKL Fasern wurden heterogener und schien kleiner als RIPK1/RIPK3 Fasern (Bahn 6, Abbildung 1). Das veranlasste uns, die 2D SDD-Alter-Methode, um die Möglichkeit zu befassen, ob MLKL RIPK1/RIPK3-unabhängige Fasern bildet oder MLKL einfach distanziert sich von den großen RIPK1/RIPK3/MLKL-Fasern während SDD-Alter.......

Diskussion

Der wichtigste Aspekt des 2D SDD-Zeitalters ist, dass die Elektrophorese-Bedingungen für die erste und zweite Dimension gleich sind. Die Fähigkeit zu erkennen, eine scharfe diagonale Linie auf 45° (d. h., die keine Dissoziation oder Verschlechterung eingetreten ist) hängt von der Fasern, die Migration in identischer Weise sowohl bei electrophoreses. Mit unterschiedlichen Bedingungen, zum Beispiel indem die Spannung oder die Länge der Laufzeit, werden diese Ergebnisse verdecken. Auch, wie bei traditionellen 1D der Fall is.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Gelelektrophoresegerät	Fisher	HE99XPRO	Appratus für den Gellauf.
agrose	VWR	97062-250	Für Agarosegel.
Papierturm	Fisher	19-120-2484	zum Übertragen von
Filterpapier	VWR	21427-386	zum Übertragen von
PVDF-Membran	Bio-Rad	162-0177	zum Übertragen von
blockierendem Milchpulver	Bio-Rad	1706404XTU	zum Blockieren im Western Blot
MLKL-Antikörper	Genetex	GTX107538	Kaninchen-Anti-MLKL-Antikörper
RIPK1 Antikörper	BD Biosciences	610459	Maus Anti-RIPK1 Antikörper
RIPK3 Antikörper	Geschenk von Dr. Xiaodong Wang		Kaninchen Anti-RIPK3. Siehe Refenenz 11.
anti-Kaninchen-HRP	Sigma	A6154	Sekundärantikörper
ECL	Fisher	WBKLS0500	Western chemilumineszierendes HRP-Substrat
Röntgenfilm	Fisher	F-BX810	für Western Blot Ergebnis
DMEM	Sigma	D6429	für Zellkultur
fötales Rinderserum	Sigma	F4135	für Zellkultur
Penicilin-Streptomycin,	Sigma	P4333	für die Zellkultur
Trypsinlösung	Sigma	T4049	für die Zellkultur
PBS für die Gewebekultur	Sigma	D8662	für die Zellkultur
rekombinantes TNF	hergestellt in unserem Labor		zur Induktion der Nekroptose. Siehe Referenz 11.
smac-mimetisches	Geschenk von Dr. Xiaodong Wang		zur Induktion der Nekroptose. Siehe Referenz 11.
ZVAD-FMK	ApexBio	A1902	zur Induktion von Nekroptose. Siehe Referenz 11.
Zellzähler	Bio-Rad	1450102	Modell TC20; zum Zählen von Zellen
Pierce™ BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225	zur Messung der Proteinkonzentration in Zelllysaten
Cell	Lifter Fisher	07-200-364	zur Entnahme von Zellen aus der Schale
Lysepuffer (1 L)			20 mL 1 M Tris pH 7,4 10 mL Glycerin 30 mL 5 M NaCl 840 mL ddH2O 10 mL Triton-X100 (Protease- und Phosphatinhibitoren) wie gewünscht)
10X TAE (1 L)48,4			g Tris base 11,42 mL Eisessig 20 mL 0,5 M EDTA pH 8 ddH20 bis 1 L
4X SDD-AGE Ladepuffer (50 mL)			5 mL 10X TAE 10 mL Glycerin 4 mL 20% SDS 0,5 mL 10% Bromphenolblau 31 mL ddH2O
TBS-Transferpuffer (1 L)			20 mL 1 M Tris pH 7,4 30 mL 5 M NaCl 950 mL ddH2O
PBST-Waschpuffer (1 L)			100 mL 10xPBS 800 mL ddH2O 1 mL Tween20
10X PBS (10 L)			800 g NaCl 20 g KCl 144 g Na2HPO4· 2H2O 24 g KH2PO4 ddH2O bis 10 L hinzufügen

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