Gen gezielt Random Mutagenesis Heterochromatin destabilisieren Proteasom Mutanten in Spalthefe auswählen

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt eine detaillierte Methode für zufällige Mutagenese Zielgen in Spalthefe. Als Beispiel Ziel ist es, rpt4 +, die kodiert eine Untereinheit der 19 s Proteasom und Bildschirm für Mutationen, die Heterochromatin destabilisieren.

Zusammenfassung

Zufällige Mutagenese eines Ziel-Gens wird häufig verwendet, um Mutationen zu identifizieren, die zu den gewünschten Phänotyp führen. Die Methoden, die verwendet werden, um zufällige Mutagenese zu erreichen, fehleranfällige PCR ist eine komfortable und effiziente Strategie für die Erzeugung von einem vielfältigen Pool von Mutanten (i.e., einer mutierten Bibliothek). Fehleranfällige PCR ist die Methode der Wahl, wenn ein Forscher versucht, eine vordefinierten Region, wie der kodierenden Region eines Gens und ohne Auswirkung auf andere genomischen Regionen zu mutieren. Nachdem die mutierte Bibliothek durch fehleranfällige PCR verstärkt wird, muss es in einem geeigneten Plasmid geklont werden. Die Größe der Bibliothek generiert durch fehleranfällige PCR ist von der Leistungsfähigkeit des Klonens Schritt eingeschränkt. Jedoch kann der Klonen Schritt in der Spalthefe Schizosaccharomyces Pombe, durch den Einsatz einer hocheffizienten einstufige Fusion PCR Konstrukte für die Transformation zu generieren ersetzt werden. Mutanten der gewünschten Phänotypen können dann mit entsprechenden Reporter ausgewählt werden. Hier beschreiben wir diese Strategie im Detail, nehmen wir als Beispiel, ein Reporter am Zentromer Heterochromatin eingefügt.

Einleitung

Nach vorne Genetik ist eine klassische Methode, in der Forscher suchen natürlich vorkommende Mutanten, die einen bestimmten Phänotyp anzeigen und genetische Analysen durchführen. In reverse Genetik Mutationen in einem gen des Interesses eingebracht werden und der Phänotyp wird untersucht. Im letzteren Fall wird zufällige Mutagenese eines Ziel-Gens häufig verwendet, um einen Pool von Mutanten zu generieren, die anschließend zum gewünschten Phänotypen, wie z. B. die Temperaturempfindlichkeit ausgewählt oder enzymatische Aktivität verändert. Verschiedene Methoden können verwendet werden, um zufällige Mutagenese, inklusive fehleranfällige PCR¹zu er....

Protokoll

1. Vorbereitung von Medien

1. Bereiten Sie Hefeextrakt mit Ergänzungen (ja), ja ohne Adenin (ja Low Ade), Pombe Glutamate Medium (PMG-¹²) und PMG ohne Adenin (PMG-Ade) durch Mischen der Komponenten, wie in Tabelle 1beschrieben. Ja-Ade (Low Ade) und PMG-Ade Platten haben alle die gleichen Komponenten, aber die Adenin ist von letzterem ausgelassen.
   1. Verwenden Sie die folgenden Salz (50 X) Lager: 52,5 g/L MgCl₂·6H₂O, 2 g/L CaCl₂·2H₂O, 50 g/L KCl, 2 g/L Na₂SO₄ in Wasser destilliertem. Filter mit einem 0,22 µm Porengröße Filter zu sterilisieren und Lager....

Ergebnisse

Die erworbenen Rpt4 Mutanten gemäß die in Abbildung 1 beschriebenen Verfahren können analysiert werden, durch die Beurteilung der Farben der Kolonien. Die Farben der Kolonien sind auf die entsprechenden Teller in abnehmender Anzahl von Zellen in Abbildung 2gesichtet. Die ade6 + Reporter an der Heterochromatin Region eingefügt wird in Wildtyp zum Schweigen gebracht und zeigt rote Kolonien in ja-Ade-Platte. Sobald das Hete.......

Diskussion

Zufällige Mutagenese über fehleranfällige PCR ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Erzeugung von einem vielfältigen Pool von Mutanten in einer bestimmten Region. Diese Technik eignet sich besonders für Studien, die versuchen, die Funktion eines Proteins unter bestimmten Umständen zu beurteilen. Zum Beispiel verwendeten wir hierin fehleranfällige PCR, um die Funktion der 19 s-Proteasom Untereinheit, Rpt4, im Heterochromatin Wartung zu beurteilen. Durch Variation die Region gezielt durch die fehleranfällige PCR und Anpass.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1. Medien
Glukose	Sigma-Aldrich	G8270-10KG
Hefeextrakt	BD Biosciences	212720
L-Leucin	JUNSEI	87070-0310
Adeninsulfat	ACR	16363-0250
Uracil	Sigma-Aldrich	U0750
L-Histidin	Sigma-Aldrich	H8125
KH2PO4	Sigma-Aldrich	1.05108.0050
NaCl	JUNSEI	19015-0350
MgSO4• 7H2	O Sigma-Aldrich	63140
CaCl2	Sigma-Aldrich	12095
Kaliumphthalat	Sigma-Aldrich	P6758-500g
Inositol	Sigma-Aldrich	I7508-50G
Biotin	Sigma-Aldrich	B4501-100MG
Borsäure	Sigma-Aldrich	B6768-1KG
MnSO4	Sigma-Aldrich	M7634-500G
ZnSO4• 7H2O	JUNSEI	83060-031
FeCl2• 4H2O	KANTO	CB8943686
Natriummolybdat-Dihydrat	YAKURI	31621
KI	JUNSEI	80090-0301
CuSO4• 5H2O	YAKURI	09605
D-Myo-Inositol	MP biomedizinische	102052
Pantothenat	YAKURI	26003
Nikotinsäure	Sigma-Aldrich	N4126-500G
(NH4)2SO4	Sigma-Aldrich	A4418-100G
Agarose	Biobasisch,	D0012
G418, Genetik,	LPS	G41805
2. EnzymreaktionenPfuUltra
II Fusion HS DNA Polymerase	Aglient	600380	Für ortsgerichtete Mutagenese
GeneMorphII Random Mutagenese Kit	Aglient	200500	Für fehleranfällige PCR
Phusion High-Fidelity DNA	Polymerase Thermo	Fisher F-530L	Für Fusions-PCR
Ex Taq  DNA-Polymerase	Takara	RR001b	Für die allgemeine PCR
BamH1	New England BioLabs	R0136S
Xho1	New England BioLabs	R0146S
Dpn1	New England BioLabs	R0176S
3. Ausrüstung
Velveteen quadratisch, schwarz	VWR	89033-116	Für Replik
Replica-Beschichtungswerkzeug	VWR	25395-380	Für Replica
MicroPulser Elektroporator	Biorad	1652100	Für die Umwandlung von Spalthefe
Elektroporationsküvetten, 0,2 cm Spalt	Biorad	1652086	Für die Umwandlung von Spalthefe
Thermocycler	Bioer	BYQ6078	Für die Fusions-PCR-Rampenreaktion

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