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Methodenartikel

Ein alternativer Ansatz zur primären Ereignissen in Neurodegeneration mit Ex Vivo Ratte Gehirnscheiben studieren

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DOI:

10.3791/57507

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11. April 2018

 ,  , 
1Neuro-Bio Ltd, Building F5, Culham Science Centre

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir präsentieren eine Methode, die bieten weitere Einblicke in die frühe Ereignisse zugrunde liegenden Neurodegeneration und basiert auf der etablierten Ex-Vivo -Gehirn-Technik verbindet die Vorteile eines in Vivo und in Vitro Experimente. Darüber hinaus stellt es eine einzigartige Gelegenheit zum direkten Vergleich von behandelten und unbehandelten Gruppe in der gleichen anatomischen Ebene.

Zusammenfassung

Trotz zahlreicher Studien, die versuchen, zuverlässige Tiermodellen zu entwickeln, welche reflektieren die primären zugrunde liegenden Neurodegeneration Prozesse, wurden nur sehr wenige weithin akzeptiert. Hier schlagen wir ein neues Verfahren aus der bekannten ex-Vivo Gehirn Stück Technik, die eine engere in Vivobietet angepasst-wie Szenario als in-vitro- Vorbereitungen für die Untersuchung der frühen Ereignisse auslösen Zelldegeneration, als bei der Alzheimer-Krankheit (AD) beobachtet. Diese Variante besteht aus einfachen und leicht reproduzierbar Schritten, die Erhaltung der anatomischen Cytoarchitecture der ausgewählten Hirnregion und seine lokalen Funktionalität in einem physiologischen Milieu zu ermöglichen. Verschiedene anatomische Bereiche erhalten Sie bei demselben Gehirn, bietet die Möglichkeit, mehrere Experimente mit den fraglichen Behandlungen in einer Website, Dosis und Zeit-abhängigen Weise durchführen. Mögliche Einschränkungen betreffen die Ergebnisse im Zusammenhang mit dieser Methodik beziehen sich auf die Erhaltung des Gewebes, d. h. die Aufrechterhaltung seiner anatomischen Integrität während der Schneiden und Inkubation Schritte und die Schnittdicke die die biochemische und immunhistochemische Analyse beeinflussen. Dieser Ansatz kann für verschiedene Zwecke, wie die Erforschung der molekularer Mechanismen in physiologische oder pathologische Bedingungen, Drogen-Screening oder Dosis-Wirkungs-Assays eingesetzt werden. Dieses Protokoll könnte schließlich auch die Zahl der Tiere in Verhaltensstudien beschäftigt reduzieren. Die Anwendung hier berichtet wurde vor kurzem beschrieben und zum ersten Mal auf ex-Vivo Ratte Gehirnscheiben mit basalen Vorderhirn (BF), eines der zerebralen AD in erster Linie betroffenen Regionen getestet. Insbesondere wurde nachgewiesen, dass die Verwaltung eines giftigen Peptids, abgeleitet aus dem C-Terminus der Acetylcholinesterase (AChE) eine AD-wie Profil, Auslösung, entlang der Antero-posterioren Achse der BF, eine differentielle Expression der veranlassen könnte Proteine verändert n. Chr., wie z. B. den alpha7 Nikotin-Rezeptor (α7-nAChR) phosphoryliert Tau (p-Tau) und Beta-Amyloid (Aβ).

Einleitung

AD ist eine chronische Krankheit gekennzeichnet durch allmähliche Neurodegenerative Beeinträchtigung beeinflussen verschiedene Hirnareale wie entorhinalen Kortex (EG), BF, Hippocampus (HC) und Riechkolben (OB)1,2,3, 4,5. Im Spätstadium der Entwicklung AD führen zu einem progressive kognitive Rückgang, so dass diese Erkrankung die häufigste Form der Demenz, entfallen etwa 70 % von allen Fällen6. Trotz umfangreicher Versuche zu verstehen, der Anfangsphase verursacht AD ist nicht derzeit eine definierte experimentelle Indikation Aufklärung sie. Darüber hinaus ist die populärste Theorie - "Amyloid-Hypothese" - zunehmend in Frage gestellt, da es nicht bietet ein vollständiges Profil in der Erklärung der AD Pathobiologie, noch eine pharmazeutische Ziel, die wirksame7,8 bewährt hat ,9.

Eine alternative Theorie, die zunehmend Beachtung deutet darauf hin, dass die anfängliche Mechanismen bei der Neurodegeneration zu einem neuronalen Cluster vor allem anfällig in AD3,10,11 zusammenhängen , 12 , 13 , 14. dieser heterogenen zellulären Hub umfasste innerhalb der BF, Mittelhirn und Hirnstamm, Projekte auf mehrere Regionen, wie z. B. die EG, HC und OB15,16. Trotz ihrer Vielfalt in neuronale Morphologie und Neurotransmitter-Synthese teilt diesen Kern der Zellen ein gemeinsames Merkmal im Ausdruck AChE, die auch ein nicht-enzymatische Funktion17,18haben kann. Diese nicht-klassischen Rolle als Roman Signaltechnik Molekül Kalzium (Ca2 +) fließen in Neuronen vermittelt die trophische oder toxische Ereignissen in Bezug auf Ca2 + Dosis, Verfügbarkeit und neuronale Alter17,18 unterzogen werden können , 19.

Während Neurodegeneration die beobachteten zelluläre Verlust daher möglicherweise mit diesem nicht-enzymatische Funktion17,18,20, was auf ein 30mer Peptid (T30) gespalten aus dem C-Terminus AChE zurückzuführen ist 20. im Einklang mit früheren Ergebnissen, geweitermacht Zellkultur und optische Bildgebung18,21 Vorbereitungen, wir unter Beweis gestellt, durch einen neuartigen Ansatz basierend auf ex Vivo Ratte Gehirnscheiben mit BF Strukturen, die induzierte T30 ein AD-ähnlichen Profil22. Insbesondere bietet diese neue Methodik ein physiologischer Szenario als Zellkultur, da es viele der Merkmale von einem intaktem Gewebe von anatomischen bis hin zu Schaltung Konservierung, wenn auch nur für ein Zeitfenster von Stunden unterhält. Wir angewendet dieses Protokoll zur Erkundung der Ereignisse in den frühen Phasen der Neurodegeneration, Überwachung der akuten Reaktion auf T30-Antrag.

Trotz der großen Körper der Literatur auf Gehirn Scheiben zu untersuchen molekulare Signalwege in neuronale Schäden impliziert oder Neurogenese23,24, dieses Protokoll bietet zum ersten Mal eine direktere und Sensitive ausgelesen im Vergleich für die gemeinsame Nutzung von organotypischen Scheiben. Jedoch wie der Fall für organotypischen Gehirn Abschnitte ist, kann dieser akuten Slice-Verfahren auch für verschiedene Zwecke, wie die Auswertung der neuroprotektive oder neurotoxische Moleküle, Entdeckung der primären molekulare Veränderungen in einem bestimmten Prozess angenommen werden, immunhistochemische Analysen und pharmakologischen Tests für zentrale Nervensystem im Zusammenhang mit Krankheiten.

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Protokoll

Unter anerkannten Protokolle wurden alle Tierversuche durchgeführt.

Hinweis: In diesem Abschnitt die Reihenfolge der wichtigsten Phasen durchgeführt während der Versuchsdurchführung und der vorgeschlagenen zeitlichen Abstand erfolgt (Abbildung 1). Darüber hinaus wird eine schrittweise Beschreibung des Protokolls ergänzt durch ein Bedienfeld "illustrative", mit kritischen Aktionen von Gehirnentfernung bis hin zu Gewebe Homogenisierung nach der Inkubationszeit (Abbildung 2). Die Details bezüglich der Materialien und die Anweisungen, um das Gerät und die nachfolgende Phase für die WB-Analyse zu bauen sind zuvor beschriebenen22.

(1) chirurgische Werkzeuge, Vibratome Einstellungen und Vorbereitung der Behandlung

Hinweis: Führen Sie die folgenden Schritte vor dem Start der Versuchsdurchführung:

  1. Bereiten Sie zwei unterschiedlichen künstliche Liquor Flüssigkeiten (aCSFs), verwendet für das Schneiden von Gehirn und die andere für die inkubationsschritt29wie zuvor beschrieben. Kurz, die Arbeiten-Konzentrationen (in Mmol) von zwei aCSFs sind für die "schneiden" ACFS: 120 NaCl, 5 KCl, 20 Nahco33, 2,4 CaCl2, 2 MgSO4, 1.2 KH2PO4und 10 Glukose; 6.7 HEPES Salz und 3,3 HEPES Säure; pH-Wert: 7,1. Während für die "Aufnahme" ACFS: 124 NaCl, 3.7 KCl, 26 Nahco33, 2 CaCl2, 1.3 MgSO4, 1,3 KH2PO4und 10 Glukose; pH-Wert: 7,1.
  2. Die Lösungen gut mischen und dann auf Eis gelegt und slicing ACFS um es Kälte beim Entfernen des Gehirns und das anschließende Schneiden mit Sauerstoff. Halten Sie Sie bei Raumtemperatur (RT) und Versorgungsmaterial Sauerstoff Aufnahme ACFS.
  3. Legen Sie die Instrumente unter der Dissektion Haube für die Enthauptung und Gehirn entfernen, d. h., Guillotine, chirurgischen Präparation Kit (Schere, Pinzette, Messer) und Spachtel.
  4. Richten Sie die Vibratome Parameter, indem er die Scheibendicke (300 µm in dieser Zubereitung) und die Häufigkeit von 7 und die Geschwindigkeit, mit 6. Legen Sie die Vibratome Kammer an der entsprechenden Stelle und mit Eis umgeben.
  5. Öffnen Sie das Carbogen (95 % O2, 5 % CO2) Ventil um das "Aufschneiden" (ACFS) während das Gehirn Schneiden mit Sauerstoff. Wählen Sie die minimale Durchflussmenge um 2 mL/min.
  6. Nehmen Sie zwei 15-mL-Röhren, die Bedingungen zu testen. Fügen Sie in eine Röhre 10 mL der "Aufnahme" ACFS allein (Kontrollgruppe) und in der anderen 10 mL der "Aufnahme" ACFS angereichert mit T30 in einer Konzentration von 2 µM (behandelten Gruppe). Vortex sowohl Rohre und halten sie auf dem Eis bis zu ihrer Verwendung in der Setup-Vorbereitungsphase (Abschnitt 3).

(2) Anästhesie, Gehirn-Extraktion und schneiden

Hinweis: In dieser Studie wurden 9 Wildtyp P14 männliche Wistar-Ratten verwendet. Gehirn-Extraktion und anschließende schneiden dar einen wichtigen Bestandteil des Protokolls, da sie schnell (innerhalb von 10 min) erfolgen sollte, um zu verhindern oder zumindest verlangsamen Gewebe Degeneration Prozesse.

  1. Fügen Sie 1,5 mL 100 % w/w von Isofluran auf einer baumwollschicht in die Induktion Kammer hinzu, legen Sie das Tier innen und schließen Sie den Deckel. Warten Sie, bis das Tier tief betäubt ist, bestätigt das Fehlen der Pedal-Reflex, und dann enthaupten Sie das Tier mit der Guillotine zu.
  2. Halten Sie den Kopf des Tieres in einen Topf mit eiskaltem schneiden ACFS im Gehirn Entfernung Schritt (Abbildung 2A -C).
  3. Einschneiden der Haut über den Schädel mit einem chirurgischen Klinge, dann schneiden Sie den Schädel mit einer Schere nach der Mittellinie aus dem hinteren Teil und fahren Sie körpertiefe bis zum Erreichen des Knochens über der OBs (Abbildung 2A).
  4. Ziehen Sie seitlich die beiden Seiten des Schädels mit einer Zange um Zugriff auf das Gehirn (Abb. 2 b) erhalten. Legen Sie einen Spachtel ventral zum Gehirn, schöpfen Sie sanft es aus, und halten Sie es im eiskalten "schneiden" ACFS für ca. 5 min (Abbildung 2) hydratisiert.
  5. Entsorgen Sie das Gehirn auf Filterpapier und schneiden Sie das Kleinhirn mit einer Klinge (Abb. 2D). Kleben Sie das Gehirn vertikal auf der Vibratome CD und legen Sie sie in der speziellen Kammer, füllen Sie ihn mit eiskalten "schneiden" ACFS und liefern Sie Sauerstoff (Abb. 2E).
  6. Passen Sie es schneiden, und fahren Sie mit dem Gehirn-Schnitt (Abb. 2F). Sammeln Sie die Abschnitte mit der Region von Interesse, wie die medialen Scheidewand (MS), Diagonale Band von Broca (DBB) und Substantia Innominata (SI), wie zuvor beschrieben22. Von oben nach unten enthalten die drei Scheiben die rostral (R), Mittelstufe (I) und kaudalen (C) Teil der BF (Abbildung 2).
  7. Teilen Sie entlang der Mittellinie jeder Abschnitt mit einer kleinen Schere, erhalten zwei spiegelnde Hemislices (Abb. 2 H), einzeln als Kontrolle und behandelten Zustand bei der gleichen anatomischen Ebene verwendet.
  8. Halten Sie die Hemisections in der Vibratome Kammer für 5-10 min, dann mit einer Glaspipette in einem sprudelnden Topf mit Aufnahme ACFS überführen. Halten Sie bei RT für ca. 30 min zu erholen.
  9. Füllen Sie in der Zwischenzeit drei Glasfläschchen mit 3 mL Aufnahme ACFS allein (zuvor im Schritt 1.6 für die Kontrollgruppe bereit) und drei Fläschchen mit 3 mL ACFS angereichert mit T30 (zuvor im Schritt 1.6 bereit) für die behandelten Gruppe.

3. Setup Vorbereitung

  1. Die Hemisections in ihre entsprechenden Glasfläschchen (Abbildung 2I) zu übertragen, um drei aufeinander folgende Hemislices (einschließlich der rostral, zwischen- und kaudalen BF-Region) für die Kontrollgruppe (grüner Rahmen, Abbildung 2J) haben und deren passenden Partnern bei der behandelten Gruppe (roter Rahmen, Abbildung 2J).
  2. Übertragen Sie das Hirngewebe mit zwei verschiedenen Pinseln, eine für die Steuerung Hemislices und eine weitere für die behandelten Gegenstücke, um eine Kontamination zwischen Bedingungen zu verhindern.
  3. Jede Glasflasche mit dem entsprechenden Deckel, präsentieren die Sauerstoff Nadel (21G) (Abb. 2J) zu versiegeln. Verbinden Sie das Hauptrohr des Apparates mit Carbogen Quelle (Abbildung 2 K). Sauerstoff für die Hemislices während der Inkubationszeit mit einer minimalen Flussrate von 2 mL/min zu liefern, um jede Bewegung des Hirngewebes und mechanische Beschädigungen während des Versuchs zu vermeiden. Starten Sie die 5 h Inkubation. Führen Sie die Schritte 3.1-3.3 innerhalb von 5 Minuten.
    Hinweis: Prüfen Sie häufig (alle 15-20 min) ob der Sauerstoff in die Fläschchen versorgt wird und seinen Fluss nicht das Gewebe von unten bewegt.

4. Probe Homogenisierung

  1. Nach der Inkubation stoppen Sie der Sauerstoffzufuhr zu und entfernen Sie den Deckel aus dem Fläschchen. Übertragen Sie die Hemislices, mit der richtigen Bürsten, in 1,5 mL Röhrchen mit 250 µL Lyse Puffer, Aufrechterhaltung der Rohre auf dem Eis (Abbildung 2 L). Machen die Lyse Puffern, mischen PBS 1 X mit Phosphatase und Protease-Hemmer Cocktails sowohl 1: 100 verdünnt und Homogenisieren des Gewebes mit verschiedenen Stößel, Kontamination zwischen den Proben zu verhindern. Füllen Sie diese Aktionen innerhalb von 10-15 min.
  2. Zentrifugieren Sie das Gehirn lysate bei 1.000 x g für 5 min bei 4 ° C. Transfer des Überstands in neue Schläuche und halten die Proben bei-80 ° C.

5. Lesen der Proteinkonzentration und Western-Blot Analyse

  1. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration jeder Probe zu und anschließend bereiten Sie die Aliquote der Western-Blot Analyse als zuvor beschriebenen22 vor.
  2. Führen Sie statistische Analyse, um die Bewertung der Auswirkungen der Behandlung auf Protein-Expression.

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Ergebnisse

Die hier vorgestellten Protokoll zeigt an, dass die Verwaltung eines giftigen Peptids, T30, in eine Website-abhängigen Weise die Expression von α7-nAChR, p moduliert-Tau und Aβ in BF-haltigen Abschnitten (Abb. 3A). Der Nikotin-Rezeptor zeigt eine deutliche Steigerung in der rostral behandelt Hemislice im Vergleich zu seiner Kontrolle Gegenstück (Scheibe 1, p = 0.0310) (Abb. 3 b), während die mittlere Scheibe Änderungen z...

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Diskussion

Der wichtigste Aspekt dieses Protokolls, basiert auf der bewährten ex Vivo -Gehirn-Technik ermöglicht zwei spiegelnde Hemislices, gewonnen aus der gleichen anatomischen Ebene, Überwachung ihrer Reaktion nach der Anwendung eines bestimmten synchron zu testen Zustand (Steuern oder behandelt); Dies bietet daher eine experimentellere Paradigma so streng kontrolliert wie möglich. Die Möglichkeit der Bewertung in einer Zeit, Dosis und ortsspezifische Weise verschiedene Neurochemikalien, die im Zusammenhang mit neurona...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären konkurrierende finanzielle Interessen. Susan A. Greenfield ist der Gründer und Präsident der Neuro-Bio-Limited, ein privat geführtes Unternehmen und hält Anteile an der Gesellschaft. Emanuele Brai und Antonella Cogoni sind Mitarbeiter von Neuro-Bio Ltd.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von Neuro-Bio Ltd. finanziert. Wir möchten Dr. Giovanni Ferrati und Dr. Sergio Rotondo (Neuro-Bio) Danke für ihre Kommentare und Ratschläge auf dem Manuskript.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Natriumchlorid (NaCl)Sigma-Aldrich, DeutschlandS7653Reagenz für die aCSF-Zubereitung
Kaliumchlorid (KCl)Sigma-Aldrich, DeutschlandP9333Reagenz für die aCSF-Zubereitung
Natriumbicarbonat (NaHCO3)Sigma-Aldrich, DeutschlandS5761Reagenz für die aCSF-Zubereitung
Magnesiumsulfat-Heptahydrat (MgSO4 (7H2O))Sigma-Aldrich, Deutschland63138Reagenz für die Liquoraufbereitung
Kaliumphosphat einbasisch (KH2PO4)Sigma-Aldrich, DeutschlandP5655Reagenz für die Liquoraufbereitung
HepessalzSigma-Aldrich, DeutschlandH7006Reagenz für die Liquoraufbereitung
HepessäureSigma-Aldrich, DeutschlandH3375Reagenz für die Liquoraufbereitung
Glucose Sigma-Aldrich, DeutschlandG7528Reagenz für die aCSF-Aufbereitung
Calciumchlorid-DehydratSigma-Aldrich, Deutschland223506Reagenz für die aCSF-Präparation
T30-PeptidGenosphere Biotechnologies, FrankreichAChE-abgeleitetes Peptid getestet
Chirurgisches PräpariersetWorld Precision Instruments, USAArtikel #: MOUSEKITSchritt zur Entfernung des Gehirns
Chirurgische KlingenSwann-Morton, UKBS 2982Schritt zur Entfernung des Gehirns
FilterpapierFisher Scientific, USA11566873Vorbereitung des Gehirns zum Schneiden
KleberVorbereitung des Gehirns zum Schneiden
VibratomeLeica, DeutschlandVT1000 S
SchneidebürstenHandhabung von Gewebe
SauerstoffkanisterSchnitt- und Inkubationsphase
1x Phosphatpuffer Kochsalzlösung (PBS)Fisher Scientific, USABP2438-4Homogenisierungsschritt
PhosphatasehemmerFisher Scientific, USA1284-1650Homogenisierungsschritt
ProteaseinhibitorenRoche complete PIC, USA4693116001Homogenisierungsschritt
PestlesStarlab, UKI1415-5390Homogenisierungsschritt
Mikrozentrifuge
Pierce 660 nm ProteinassayThermo Scientific, USA22660Proteinkonzentration

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