Desthiobiotin Kennzeichnung von einer synthetischen 25-Nukleotid RNA Oligo, enthält ein Motiv Adenin-HTML-Elements (sind), kann spezifische Bindung der cytosolischen sind-bindendes Protein.
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Methodenartikel
Desthiobiotin-Streptavidin-Affinität vermittelt Reinigung von RNA-wechselwirkenden Proteinen in Mesotheliomzellen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die in-vitro- RNA-Pulldown wird noch weitgehend verwendet in den ersten Schritten der Protokolle, die auf die Identifizierung von RNA-bindende Proteine, die spezifisch RNA-Strukturen und Motive zu erkennen. In diesem Protokoll RNA-Pulldown kommerziell synthetisierte RNA-Sonden sind beschriftet mit einer modifizierten Form von Biotin, Desthiobiotin, an das 3' Ende der RNA-Strang, die reversibel bindet an Streptavidin und ermöglicht somit Elution von Proteinen unter mehr physiologische Bedingungen. RNA-Desthiobiotin wird durch die Interaktion mit Streptavidin auf magnetische Beads immobilisiert die pull-down-Proteine, die spezifisch mit der RNA des Interesses interagieren dienen. Nicht denaturiert und aktive Proteine aus der cytosolische Fraktion von mesotheliomzellen dienen als Quelle von Proteinen. Die hier beschriebene Methode kann angewendet werden, um die Interaktion zwischen bekannten RNA-bindende Proteine und eine 25-Nukleotid (nt) lange RNA-Sonde mit einer Sequenz von Interesse zu erkennen. Dies ist nützlich, um die funktionelle Charakterisierung der stabilisieren oder destabilisieren Elementen in RNA-Moleküle mit einem Reporter-Vektor-Assay erreicht abzuschließen.
Einleitung
Genexpression und die letzte Stufe des genprodukts können streng reguliert werden, durch Einwirkung auf die Stabilität der mRNA und mRNA Übersetzung Satz1. Diese Posttranskriptionale Regulationsmechanismen sind durch die Wechselwirkungen von nicht-kodierende RNA und/oder RNA-bindende Proteine (RBPs) mit gezielten mRNA ausgeübt. Es ist in der Regel 3' untranslatierten Region der mRNA (3' UTR - gehören zu den nicht-kodierenden Teil des Genoms2), die spezifische Cisenthält-regulatorischen Elementen (CRE), die von Transerkannt werden-wirkenden Faktoren wie MiRNA oder RBPs 3. der am b....
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Protokoll
1. Vorbereitung der cytosolischen und nukleare Proteinfraktion
- Platte 4 x 106 ACC-MESO-4 Zellen in einem T150 Zelle Kultur Kolben angebaut in RPMI - 1640 Medium mit 10 % FBS, 1 X Penicillin/Streptomycin (100 X) und 2 mM L-Glutamin (200 mM) ergänzt. Wenn Zellen einen Zusammenfluss von 80-90 % (~5-5.5 X 106 Zellen) erreicht haben, fahren Sie mit Proteingewinnung von Kernenergie und cytosolische Fraktion.
Hinweis: ACC-MESO-4-Zell-Linie wurde aus dem RIKEN BioResource Zentrum11erhalten. - Aspirieren Medium, Waschen der Zellen durch Zugabe von 15 mL 1 X PBS, kippen Sie die Platte vorsichtig ein paar Mal und....
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Ergebnisse
In diesem Experiment wurde ein 25-nt lange Fragment des Calretinin 3' UTR beherbergen sind Motiv (CALB2 3' UTR (sind) 25-nt) verwendet, zu testen, ob es speziell für das Human-Antigen R (HuR) Protein, einem bekannten mRNA-Stabilisator bindet. Um zu testen, die Spezifität des Elements sind, eine 25-nt-RNA wurde Sonde CALB2 3' UTR (MtARE), enthält eine sind-Motiv-Mutation, die bisher gezeigt wurde, um den Stabilisierungseffekt des Motivs sind abzuschaffen, gebrauchte6
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Diskussion
3' wo gehören die nicht-kodierenden Genom3, und alle nicht-kodierende RNAs können mit Proteinen interagieren, um ihre Funktion7ausüben. Wenn das Säugetier-Genom wurde festgestellt, dass durchdringend transkribiert werden und einen Großteil der lange Forensisches RNAs16 produziert, neue Beweise gezeigt, dass diese lange Forensisches RNAs in der Genexpression regulieren, wie sie interagieren funktionieren Chromatin-Umbau komplexe17
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von der Swiss National Science Foundation Sinergia Grant CRSII3 147697, die Stiftung Für Angewandte Krebsforschung und Zürich Krebsliga unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| NE-PER Extraktionskit für Kerne und Zytoplasma | Thermo Fisher Scientific | 78833 | |
| Pierce Proteasehemmer Tabletten, EDTA-frei | Thermo Fisher Scientific | A32965 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Pierce Magnetisches RNA-Protein-Pulldown-Kit | Thermo Fisher Scientific | 20164 | Enthält magnetische Beads und daher muss das Kit bei 4 & Grad gelagert werden. C |
| Pierce RNA 3' End-Desthiobiotinylierungs-Kit | Thermo Fisher Scientific | 20163 | Das Kit ist Teil des "Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit" und muss bei -20 & Grad gelagert werden. C im Gegensatz zum Pull-Down-Kit (4 > C). |
| DynaMag-2, magnetisches Stativ | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| Anti - HuR (MOUSE) monoklonaler Antikörper | Thermo Fisher Scientific-Der | Antikörper ist im Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit enthalten - 1:1000 in 5% BSA 1x TTBS - Kaninchen Anti-Maus Sekundärantikörper 1:10.000 in 5% BSA 1x TTBS | |
| Anti - α - Tubulin (MOUSE) monoklonaler Antikörper | Santa Cruz | 8035 | 1:1000 in 5% BSA 1x TTBS - Kaninchen Anti-Maus Sekundärantikörper 1:10.000 in 5% BSA 1x TTBS |
| Anti - PARP (RABBIT) Polyklonaler Antikörper | Cell Signaling | 9542 | 1:1000 in 5% BSA 1x TTBS - Kaninchen Anti-Kaninchen Sekundärantikörper 1:10.000 in 5% BSA 1x TTBS |
| Anti - Mesothelin (MOUSE) Monoklonaler Antikörper | Rockland | 200-301-A87 | |
| Sekundärer Anti-Kaninchen-Antikörper | Cell Signaling | 7074 | |
| Sekundärer Kaninchen-Anti-Maus-Antikörper | Sigma-Aldrich | A-9044 | |
| RPMI - 1640 | medium Sigma-Aldrich | R8758 | |
| FBS - filtrierter Rinderserum-Pan | Biotech | P40-37500 | |
| Penicillin - Streptomycin (100x) | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| L-Glutamin-Lösung (200 mM) | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| 0,25 % Trypsin-EDTA (1x) | Gibco von Life Technologies | 25200-056 | |
| Mini-PROTEAN 3 Zellen | Bio-Rad | 1653301 | |
| Mini Protean System Glasplatten | Bio-Rad | 1653308 | |
| Mini-PROTEAN Spacer Platten mit 1,5 mm integriertem Spacer | Bio-Rad | 1653312 | |
| Mini-PROTEAN Comb, 10-well, 1,5 mm, 66 & micro; L | Bio-Rad | 1653365 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting Modules | Bio-Rad | 1658050 | |
| RNaseZap RNase Dekontaminationslösung | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
| Rotiphorese Gel 30 - wässrige 30%ige Acrylamid und Bisacrylamid Stammlösung im Verhältnis 37,5:1 | Roth | 3029 | |
| 20% SDS | PanReac AppliChem | A3942 | |
| PVDF-Transfermembran | Perkin Elmer | NEF1002 | müssen aktiviert werden, indem 1 Minute lang in reinem Methanol inkubiert und anschließend 2 Minuten lang in Wasser gewaschen wird. |
| Trans-Blot SD halbtrockene Transferzelle | Bio-Rad | 1703940 | |
| Clarity Western ECL Substrat | Bio-Rad | 1705061 | |
| FusionFX Digital Imager | Vilber-RNA-Oligosynthese | ||
| Mycrosynth AG, Schweiz | - | die Syntheseskala - 0,04 µ mol - HPLC gereinigtes | |
| Rinderserumalbumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Salzsäure (HCl) 6 M | PanReac AppliChem | 182883.1211 | |
| Ultra Pure 1 M Tris, pH 7,5 | Thermo Fisher Scientific | 15567027 | |
| Glycerin | Thermo Fisher Scientific | 17904 | 50 % sterile Aliquote für die Lagerung bei -20°; C |
| Pierce Streptavidin magnetische Kügelchen | Thermo Fisher Scientific | 88817 | Bitte beachten Sie, dass diese magnetischen Kügelchen einen durchschnittlichen Durchmesser von 1 & Mikro haben; m (Bereich von 0,5 - 1,5 &Mikro; m). Darüber hinaus werden Dynabeads-M280 Streptavidin, bei denen es sich um Kügelchen mit einer homogenen Größe von 2,8 und Mikro handelt. m, werden auch beim RNA-Pulldown verwendet, aber beachten Sie, dass dies den Reinigungsprozess beeinträchtigen kann. |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Ammoniumpersulfat | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Coomassie G-250 | Applichem | A3480 | |
| Aluminiumsulfat-(14-18)-hydrat | Sigma-Aldrich | 368458 | |
| ortho-Phosphorsäure | Applichem | A0637 |
Referenzen
- Glisovic, T., Bachorik, J. L., Yong, J., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins and post-transcriptional gene regulation. FEBS Letters. 582 (14), 1977-1986 (2008).
- Mayr, C. Evolution and biological roles of alternative 3'UTRs. Trends in Cell Biology. 26 (3), 227-237 ....
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Nachdrucke und Genehmigungen
