Methodenartikel

Eine schnelle und Facile Pipeline für die Erzeugung von Genomic Punkt Mutanten in C. Elegans verwenden CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

7.3K Ansichten

⸱

DOI:

10.3791/57518

⸱

30. April 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, University of Michigan

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir eine Methode, um das Genom von C. Elegans Ingenieur CRISPR-Cas9 Ribonucleoproteins und Homologie abhängigen Reparatur Vorlagen.

Zusammenfassung

Die gruppierten regelmäßig eingestreuten palindromischen Wiederholungen (CRISPR) - CRISPR - assoziierten Protein 9 (Cas9) prokaryotische adaptive Immunabwehr als ein mächtiges Werkzeug für präzise eukaryotische Genom Engineering kooptiert worden hat. Hier präsentieren wir Ihnen eine schnelle und einfache Methode mit Chimären einzelne Guide RNAs (SgRNA) und CRISPR-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs) für die effiziente und präzise Generation von genomischen Punktmutationen in C. Elegans. Wir beschreiben eine Pipeline für SgRNA Zielauswahl, unter der Regie von Homologie (HDR) Vorlage Reparaturverfahren CRISPR-Cas9-RNP Komplexbildner und Lieferung und eine Genotypisierung-Strategie, die die robuste und schnelle Identifizierung von richtig bearbeiteten Tiere ermöglicht. Unser Ansatz ermöglicht die einfache Erzeugung und Identifizierung des gewünschten genomische Punkt mutierte Tiere nicht nur, sondern erleichtert auch den Nachweis von anderen komplexen Indel Allele in ca. 4-5 Tage mit hohem Wirkungsgrad und einer reduzierten Screening Arbeitsauslastung.

Einleitung

Jüngsten technologischen Fortschritte haben radikal umgewandelt und beschleunigt die Fähigkeit, genau Ingenieur Genome. Insbesondere wurde das CRISPR-Cas9-System, das stützt sich auf die RNA-geführte Endonuklease Cas9 induzieren eine Doppelstrang-Pause (DSB) in der Nähe der Zielsequenz von Interesse, weitgehend verwendet, um genau das Genom der Mehrheit der verwendeten Modellorganismen Ingenieur Biomedizinische Forschung1,2,3,4. Bezeichnenderweise hat die Verwendung von CRISPR-Cas9 freigeschaltet Genom-Bearbeitung auch bei schwierigen Arten wie C. Elegans5. Unabhängig von der Spezies, Generierung von Punktmutationen mit dem Redaktionssystem CRISPR-Cas9 Basis-Genom stützt sich auf drei Kernkomponenten: (1) Cas9 Endonuklease, 2) einen einzigen Führer RNA (SgRNA), die Cas9 Endonuklease einer Zielsequenz und (3) ein Benutzer entwickelt, leitet unter der Regie von Homologie Reparatur (HDR) Vorlage mit dem gewünschten edit(s) von Interesse2.

Es gibt mehrere Methoden, die verwendet werden können, die gezielt SgRNA und Cas9 einzuführen Nuklease in Zellen einschließlich Plasmid, RNA und viral-basierte Lieferung Methoden6. Vor kurzem hat Direktlieferung von Pre-komplexiert SgRNA-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs) als ein leistungsfähiges und effizientes Werkzeug im CRISPR-Cas9-basierte Genom Bearbeitung7entstanden. Die direkte Zustellung von Pre-komplexiert CRISPR-Cas9-RNPs hat einige deutliche Vorteile, nämlich: (1) RNPs umgehen die Notwendigkeit einer zellulären Transkription und Übersetzung, 2) RNPs sind schnell gelöscht, Spezifität erhöhen durch Verringerung der zur Verfügung stehende Zeit für Ziel Spaltung und 3) RNPs enthalten keine fremden DNA/RNA-Elemente, die die Einführung von Gebietsfremden Sequenzen in das wirtsgenom durch zufällige Integration umgeht. Zusammen bieten diese Attribute wahrscheinlich eine kurzlebige Platzen der zielgerichtet CRISPR Bearbeitung bei gleichzeitiger Minimierung der Ziel-Effekte.

Ein einfaches und effizientes Protokoll für die Einführung von standortspezifischer genomischer Veränderungen in C. Elegansbeschrieben. Dieses Protokoll enthält targeting SgRNA und einzelne gestrandeten Oligonukleotid (SsODN)-HDR-Template-Design, SgRNA-Cas9 RNP Komplexbildner und Lieferung und eine Genotypisierung Strategie für die eindeutige Kennzeichnung der richtig bearbeiteten Tiere. Mit dieser Strategie, nicht nur die gewünschten Site-spezifische Änderungen zurückgewonnen werden, aber andere unspezifische Indel Mutationen können auch wiederhergestellt werden. So, unsere Strategie erlaubt die Generation der ein Allel Serie mit einer einheitlichen Strategie, wo Mono-Allele, Bi-Allel und Indel Mutanten in der F-1 Generation erzeugt werden können.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

Alle Tierpflege und experimentelle Verfahren befolgt die Leitlinie vom National Institutes of Health und institutionelle Tier Pflege und Nutzung Committee (IACUC) an der University of Michigan. Verwenden Sie RNase-freie Lösungen und Tipps im gesamten Protokoll pipette. Reinigen Sie der Arbeitsbereich, Pipetten, Schläuche und Zentrifuge mit RNase Dekontaminationslösung nach den Herstellerrichtlinien (siehe Materialtabelle).

1. SgRNA Zielauswahl

  1. Mit einem Webbrowser, öffnen Sie die Webseite: http://crispor.tefor.net8
    1. Eingabe von ~ 60 Basenpaaren (bp) Sequenz flankieren die gewünschte Bearbeitung von Interesse (d.h. 30 bp 5' und 3' des gewünschten bearbeiten).
    2. Wählen Sie das Caenorhabditis Elegans Genom aus dem Pulldown-Menü.
    3. Wählen Sie die Protospacer angrenzenden Motiv (20 bp-NGG - SpCas9, SpCas9-HF1, eSPCas9 1.1) aus dem Pulldown-Menü.
    4. Klicken Sie auf Absenden. Wählen Sie auf der Ergebnisseite der oberste Rang Zielsequenz am nächsten an die Bearbeitung von Interesse. Wenn kein geeignetes Ziel Standorte innerhalb der flankierenden 60 bp Eingabesequenz vorhanden sind, erweitern Sie die Reihenfolge der Abfrage bis zu 100 bp (d.h. 50 bp beiderseits des gewünschten bearbeiten).
  2. Aus einer verfügbaren Quellen, z. B. Synthego, erhalten eine 20-Mer Ziel SgRNA mit den folgenden Spezifikationen: 3 Nmol; keine Änderungen.
  3. Nach Erhalt, Zentrifugieren lyophilisierten SgRNA mit Schlauch an > 12.000 x g für 1 min bei Raumtemperatur. Das Rohr 60 µL Nuklease-freie TE hinzu, und auszusetzen Sie sanft wieder nach oben und unten 15 - 20 Mal mit einer P200 Pipette pipettieren. Die Endkonzentration beträgt 50 µM.

(2) Homologie gerichtete Reparatur-Template-Design

  1. Entwerfen einer SsODN HDR Vorlage enthält: (1) die Mutation von Interesse, (2) ein einzigartiges in-Frame Beschränkung Endonuklease Website, (3) eine Stille Mutation von einem oder beiden der Gs innerhalb der NGG PAM-Sequenz, und (4) 50 bp 5' und 3' Homologie Arme flankieren die erste und letzte Mutation. (Abbildung 1) 9 , 10.
    1. Wenn Mutation der NGG PAM-Sequenz nicht möglich ist, stellen Sie ca. 5-6 Stille Mutationen innerhalb der SgRNA Anerkennung Zielsequenz, SgRNA-vermittelte Spaltung der SsODN HDR Vorlage zu verhindern.
  2. Aus einer verfügbaren Quellen, z. B. Idtdna, erhalten eine "Ultramer DNA-Oligonukleotid" mit den folgenden Parametern: Skala: 4 Nmol; Formulierung: Keine; Reinigung: Standard Entsalzung.
  3. Nach Erhalt, Zentrifugieren lyophilisierten SsODN mit Schlauch an > 12.000 x g für 1 min bei Raumtemperatur. Auszusetzen Sie vorsichtig wieder SsODN, eine Endkonzentration von 100 µM Nuklease-freie DdH2O durch nach oben und unten 15 - 20 Mal mit einer P200 Pipette pipettieren.

3. Design Genotypisierung Primer

  1. Entwerfen Sie eine Grundierung, die voraussichtlich eine ~ 400-700 bp PCR Amplifikate11generieren flankieren die Genom-Modifikation.
  2. Optimieren Sie PCR Radfahren Bedingungen, ein Einzel- und spezifischen Amplifikate11zu produzieren.

4. Injektion Mischung vorbereiten

  1. Zentrifugieren Sie Tabelle 1 Reagenzien mit maximaler Geschwindigkeit für 2 min bei 4 ° C.
  2. Fügen Sie in der aufgeführten Reihenfolge Tabelle 1 Reagenzien zu einem Nuklease-freie PCR-Schlauch hinzu.
  3. Mischen von pipettieren sanft nach oben und unten 10 mal mit einer Pipette P20.
  4. Inkubieren Sie Injektion-Mix für 10 min bei Raumtemperatur.

5. Injektion Protokoll

  1. Last Injektion Mikropipette mit ungefähr Hälfte der Injektion mischen12. Speichern Sie verbleibende Injektion Mischung für den Fall, dass die Injektionsnadel verstopft oder bricht.
  2. Mikropipette Spitze zu brechen, so dass ~ 20-30 p.s.i. eine allmähliche fließende Lösung12produziert.
    Hinweis: Größere Durchmesser Tipps negativ beeinflussen Tiergesundheit und F1 Nachkommen Ausbeute zu verringern.
  3. Injizieren von 10-15 junge Erwachsene Würmer in beiden Gonaden Armen möglichst12. Ist dies nicht der Fall, Injektion in einen Gonaden Arm reicht.
  4. Lassen Sie injizierte Tiere (P0) für 1-2 h bei Raumtemperatur wieder auf eine 35 mm OP50 ausgesät Nematoden Medien (NGM) Wachstumsfuge zu. Anschließend wählen Sie injizierten P0 Einzeltiere zu einzelnen OP50 entkernt 35 mm NGM Platten mit einem Platindraht Wurm12.

6. P0 Siebbleche und einzelne mCherry(+) F1s

  1. Zwei Tage nach der Injektion, P0 Platten mit F1 Nachkommen mit dem Ausdruck mCherry in den Rachenraum mit einem fluoreszierenden Stereomikroskop zu identifizieren (Abbildung 1, Tag 2: 3). Wählen Sie drei P-0 -Platten, die die meisten mCherry(+) F1 Tiere enthalten.
  2. Aus jedem der drei ausgewählten P0 Platten, einzelne 8-12 mCherry(+) F1 Tiere für eine Gesamtmenge von 24-36 mCherry(+) F1s mit einem Wurm wählen (Abbildung 1, Tag 2: 3).
    Hinweis: mCherry(-) Tiere können auch von diesen P-0 -Platten ausgezeichnet, aber die Wahrscheinlichkeit korrekt identifizieren bearbeitet Tiere ist viel niedriger (Abb. 2A).
  3. Ermöglichen Sie individuelle F1s self-fertilize und Eier für 1-2 Tage bei Raumtemperatur.

7. Single Worm PCR und Genotypisierung

  1. Übertragen Sie nach 1-2 Tagen eierlegende die F1s in einzelnen PCR-Streifen Rohr Kappen mit 7 µL Wurm Lysis Puffer mit einem Wurm-Pick ( Abbildung 1,Tabelle 2, Tag 4-5).
  2. Zentrifuge PCR-Röhrchen mit maximaler Geschwindigkeit für 1 min bei Raumtemperatur zu bringen Tiere den Rohrboden und Einfrieren von Rohren bei-80 ° C für 1 h.
    Hinweis: Würmer können bei-80 ° C auf unbestimmte Zeit gespeichert werden.
  3. Lösen Sie gefrorene Würmer in einem Thermocycler mit dem folgenden Programm: 60 ° C für 60 min, 95 ° C für 15 min, 4 ° C halten.
  4. Set-up PCR Mastermix wie in Tabelle 3dargestellt.
  5. Fügen Sie 21 µL des PCR Mastermix in saubere PCR-Röhrchen, und fügen Sie 4 µL Wurm Lyse aus Schritt 3. Mischen Sie gut mit einer Pipette und führen Sie PCR-Programm nach den Hersteller-Richtlinien (siehe Materialtabelle).
  6. PCR-Reaktionen mit einem DNA-sauber und Konzentrat-Kit, Anschluss an die Anweisungen des Herstellers zu reinigen (siehe Materialtabelle). Eluieren Sie DNA durch Zugabe von 10 µL Wasser auf die Spin-Spalte.
  7. Set-up Restriktionsenzym Mastermix wie in Tabelle 4dargestellt.
  8. Jeder gereinigten PCR Reaktion 10 µL Restriktionsenzym Mastermix hinzu und inkubieren Sie für 1-2 h bei 37 ° C13.
  9. Separate verdaut PCR-Produkte auf einem 1,5 % Agarose-Gel bei 120 V mit 1 X Tris-Acetat-EDTA (TAE) Puffer14laufen.

8. Feststellung und Überprüfung der Reihenfolge der bearbeiteten Tiere

  1. Untersuchen Sie Enzym verdaut Proben für die Anwesenheit von Bands, die darauf hinweisen, dass Potenzial Tiere14 (Abbildung 1, Tag 4-5) bearbeitet.
    Hinweis: Laden Sie eine N2-Steuerelement, um potenzielle Indel Mutationen zu identifizieren, die als Veränderungen in der Bandgröße und/oder unerwarteten und komplexen Beschränkung Enzym Verdauung Streifenbildung Muster beobachtet werden kann.
  2. Verwenden Sie nach der Identifizierung potenzieller bearbeiteten Tiere die verbleibenden 3 µL Wurm Lyse und wiederholen der PCR-Reaktion. Nicht reinigen oder Restriktionsenzym verdauen der PCR-Reaktion, nachdem das Programm beendet ist. Die PCR-Reaktion auf einem 1 % Agarosegel, separate laden und extrahieren Sie die Band mit einem Gel Extraction Kit15 (siehe Materialtabelle).
  3. Sanger Sequenz16 Gel extrahiert DNA mit Hilfe des F1-Primers zur Identifizierung richtig bearbeiteten Tiere (Abbildung 1A)
    Hinweis: Heterozygot liest enthalten werden überlagert Gipfeln aufgrund des Vorhandenseins von dem Wildtyp und Allel entwickelt.
  4. Homozygote Tiere von verifizierten heterozygot bearbeiteten Tiere, einzelne 8-122 Tiere und führen Sie die Schritte 7-8.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Mutationen im menschlichen Superoxid-Dismutase 1 (SOD1) entfallen ca. 10-20 % der familiäre Amyotrophe Lateralsklerose, eine verheerende Neurodegenerative Erkrankung, die unweigerlich zu Lähmung und Tod17führt. Menschlichen SOD-1 ist ein evolutionär konservierte Protein 55 % Identität und 70 % Ähnlichkeit mit C. Elegans SOD-1-Proteins (Abbildung 1 b) zu teilen. Um die Einfachheit, Machbarkeit und Effizienz der CRISPR-...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Das CRISPR-Cas9-System ist ein leistungsfähiges und effektives Werkzeug für präzise Änderung des Genoms von Modellorganismen. Hier zeigen wir die Chimäre SgRNAs20 in Verbindung mit SsODN HDR Vorlagen ermöglichen hoch effiziente Erzeugung von genomischen Punktmutationen in C. Elegans. Wichtig ist, zeigen wir, dass RNP Lieferung hocheffiziente Bearbeitung erzeugt, wenn Fluoreszenz dient als ein Co Selektionsmarker, Hervorhebung der Benutzerfreundlichkeit und Zuverlässigkeit der Technik.

...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Wir danken Mitglieder des Beg-Labors für kritische Lektüre des Manuskripts. Stämme lieferte Caenorhabditis Genetik Zentrum, das von NIH Büro Infrastruktur Forschungsprogramme (P40 OD010440) gefördert wird. Forschung im Labor Beg wird durch Zuschüsse aus dem NIH (R01 NS094678) und die Muscular Dystrophy Association (MDA382300), A.A.B. unterstützt.

Danksagungen

Es gibt keine Interessenkonflikte im Zusammenhang mit diesem Bericht.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
CRISPRevolution sgRNA  EZ KitSynthego Inc.chimäre sgRNA
Nuklease-frei TESynthego Inc.mit dem sgRNA-Kit EZ Kit
Nukleasefreies WasserSynthego Inc.bereitgestellt mit dem sgRNA-Kit, EZ-Kit
4 nmol, Ultramer, DNA, OligoIntegrated DNA Technologies, ssODN, HDR-Template
, Alt-R, S.p., HiFi, Cas9 Nuclease, 3NLS,Integrated DNA Technologies, 1078728Cas9-Protein
, pCFJ90 Addgene19327Pmyo-2::mCherry Marker Plasmid
KClSigmaP5405
HEPESSigmaH4034
DNA Reinigen & KonzentratorZymo ResearchD4004
Zymoclean Gel DNA Recovery KitZymo ResearchD4002
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master MixNew England BiolabsM0494L
Proteinase KSigmaP2308
Glas Borosilikatglas MikropipettenSutter InstrumentsBF100-78-10OD: 1,0 mm. ID: 0.78mm
Trizma HydrochloridSigmaT5941
MgCl2SigmaM2393
NP-40Sigma74385
Tween-20 FisherScientificBP337-100
RNaseZap DekontaminationslösungFisher ScientificAM9780
, ,

Referenzen

  1. Dickinson, D. J., Goldstein, B. CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering. Genetics. 202, 885-901 (2016).
  2. Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346, 1258096(2014).
  3. Ma, D., Liu, F. Genome Editing and Its Applications in Model Organisms. Genomics Proteomics Bioinformatics. 13, 336-344 (2015).
  4. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 32, 347-355 (2014).
  5. Kim, H. M., Colaiacovo, M. P. CRISPR-Cas9-Guided Genome Engineering in C. elegans. Curr Protoc Mol Biol. 115, 31-31 (2016).
  6. Yin, H., Kauffman, K. J., Anderson, D. G. Delivery technologies for genome editing. Nat Rev Drug Discov. 16, 387-399 (2017).
  7. Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 24, 1012-1019 (2014).
  8. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biol. 17, 148(2016).
  9. Paix, A., Folkmann, A., Seydoux, G. Precision genome editing using CRISPR-Cas9 and linear repair templates in C. elegans. Methods. , (2017).
  10. Prior, H., Jawad, A. K., MacConnachie, L., Beg, A. A. Highly Efficient, Rapid and Co-CRISPR-Independent Genome Editing in Caenorhabditis elegans. G3 (Bethesda). 7, 3693-3698 (2017).
  11. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. PCR: The Polymerase Chain Reaction. J Vis Exp. , (2017).
  12. Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J Vis Exp. , (2008).
  13. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests. J Vis Exp. , (2017).
  14. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. DNA Gel Electrophoresis . J Vis Exp. , (2017).
  15. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Gel Purification. J Vis Exp. , (2017).
  16. Estrada-Rivadeneyra, D. Sanger sequencing. FEBS J. , (2017).
  17. Ludolph, A. C., Brettschneider, J., Weishaupt, J. H. Amyotrophic lateral sclerosis. Curr Opin Neurol. 25, 530-535 (2012).
  18. Evans, T. C. WormBook. , The C. elegans Research Community, WormBook. (2006).
  19. Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).
  20. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-821 (2012).
  21. Boyd, S. D., et al. A Balanced Look at the Implications of Genomic (and Other "Omics") Testing for Disease Diagnosis and Clinical Care. Genes (Basel). 5, 748-766 (2014).
  22. Saccon, R. A., Bunton-Stasyshyn, R. K., Fisher, E. M., Fratta, P. Is SOD1 loss of function involved in amyotrophic lateral sclerosis? Brain. 136, 2342-2358 (2013).
  23. Acevedo-Arozena, A., et al. A comprehensive assessment of the SOD1G93A low-copy transgenic mouse, which models human amyotrophic lateral sclerosis. Dis Model Mech. 4, 686-700 (2011).
  24. Gurney, M. E., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264, 1772-1775 (1994).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

Genomeditierung bei C elegansAuswahl der sgRNA ZielsequenzssODN HDR TemplateGenotypisierung mittels Restriktionsenzymenfluoreszierender mCherry MarkerVerifizierung durch Sanger Sequenzierunghomozygote Mutantenschnelle Mutationspipeline

Verwandte Artikel