Eine schnelle und Facile Pipeline für die Erzeugung von Genomic Punkt Mutanten in C. Elegans verwenden CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

Jüngsten technologischen Fortschritte haben radikal umgewandelt und beschleunigt die Fähigkeit, genau Ingenieur Genome. Insbesondere wurde das CRISPR-Cas9-System, das stützt sich auf die RNA-geführte Endonuklease Cas9 induzieren eine Doppelstrang-Pause (DSB) in der Nähe der Zielsequenz von Interesse, weitgehend verwendet, um genau das Genom der Mehrheit der verwendeten Modellorganismen Ingenieur Biomedizinische Forschung^1,2,3,4. Bezeichnenderweise hat die Verwendung von CRISPR-Cas9 freigeschaltet Genom-Bearbeitung auch bei schwierigen Arten wie C. Elegans⁵. Unabhängig von der Spezies, Generierung von Punktmutationen mit dem Redaktionssystem CRISPR-Cas9 Basis-Genom stützt sich auf drei Kernkomponenten: (1) Cas9 Endonuklease, 2) einen einzigen Führer RNA (SgRNA), die Cas9 Endonuklease einer Zielsequenz und (3) ein Benutzer entwickelt, leitet unter der Regie von Homologie Reparatur (HDR) Vorlage mit dem gewünschten edit(s) von Interesse².

Es gibt mehrere Methoden, die verwendet werden können, die gezielt SgRNA und Cas9 einzuführen Nuklease in Zellen einschließlich Plasmid, RNA und viral-basierte Lieferung Methoden⁶. Vor kurzem hat Direktlieferung von Pre-komplexiert SgRNA-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs) als ein leistungsfähiges und effizientes Werkzeug im CRISPR-Cas9-basierte Genom Bearbeitung⁷entstanden. Die direkte Zustellung von Pre-komplexiert CRISPR-Cas9-RNPs hat einige deutliche Vorteile, nämlich: (1) RNPs umgehen die Notwendigkeit einer zellulären Transkription und Übersetzung, 2) RNPs sind schnell gelöscht, Spezifität erhöhen durch Verringerung der zur Verfügung stehende Zeit für Ziel Spaltung und 3) RNPs enthalten keine fremden DNA/RNA-Elemente, die die Einführung von Gebietsfremden Sequenzen in das wirtsgenom durch zufällige Integration umgeht. Zusammen bieten diese Attribute wahrscheinlich eine kurzlebige Platzen der zielgerichtet CRISPR Bearbeitung bei gleichzeitiger Minimierung der Ziel-Effekte.

Ein einfaches und effizientes Protokoll für die Einführung von standortspezifischer genomischer Veränderungen in C. Elegansbeschrieben. Dieses Protokoll enthält targeting SgRNA und einzelne gestrandeten Oligonukleotid (SsODN)-HDR-Template-Design, SgRNA-Cas9 RNP Komplexbildner und Lieferung und eine Genotypisierung Strategie für die eindeutige Kennzeichnung der richtig bearbeiteten Tiere. Mit dieser Strategie, nicht nur die gewünschten Site-spezifische Änderungen zurückgewonnen werden, aber andere unspezifische Indel Mutationen können auch wiederhergestellt werden. So, unsere Strategie erlaubt die Generation der ein Allel Serie mit einer einheitlichen Strategie, wo Mono-Allele, Bi-Allel und Indel Mutanten in der F-₁ Generation erzeugt werden können.

Alle Tierpflege und experimentelle Verfahren befolgt die Leitlinie vom National Institutes of Health und institutionelle Tier Pflege und Nutzung Committee (IACUC) an der University of Michigan. Verwenden Sie RNase-freie Lösungen und Tipps im gesamten Protokoll pipette. Reinigen Sie der Arbeitsbereich, Pipetten, Schläuche und Zentrifuge mit RNase Dekontaminationslösung nach den Herstellerrichtlinien (siehe Materialtabelle).

1. SgRNA Zielauswahl

1. Mit einem Webbrowser, öffnen Sie die Webseite: http://crispor.tefor.net⁸
   1. Eingabe von ~ 60 Basenpaaren (bp) Sequenz flankieren die gewünschte Bearbeitung von Interesse (d.h. 30 bp 5' und 3' des gewünschten bearbeiten).
   2. Wählen Sie das Caenorhabditis Elegans Genom aus dem Pulldown-Menü.
   3. Wählen Sie die Protospacer angrenzenden Motiv (20 bp-NGG - SpCas9, SpCas9-HF1, eSPCas9 1.1) aus dem Pulldown-Menü.
   4. Klicken Sie auf Absenden. Wählen Sie auf der Ergebnisseite der oberste Rang Zielsequenz am nächsten an die Bearbeitung von Interesse. Wenn kein geeignetes Ziel Standorte innerhalb der flankierenden 60 bp Eingabesequenz vorhanden sind, erweitern Sie die Reihenfolge der Abfrage bis zu 100 bp (d.h. 50 bp beiderseits des gewünschten bearbeiten).
2. Aus einer verfügbaren Quellen, z. B. Synthego, erhalten eine 20-Mer Ziel SgRNA mit den folgenden Spezifikationen: 3 Nmol; keine Änderungen.
3. Nach Erhalt, Zentrifugieren lyophilisierten SgRNA mit Schlauch an > 12.000 x g für 1 min bei Raumtemperatur. Das Rohr 60 µL Nuklease-freie TE hinzu, und auszusetzen Sie sanft wieder nach oben und unten 15 - 20 Mal mit einer P200 Pipette pipettieren. Die Endkonzentration beträgt 50 µM.

(2) Homologie gerichtete Reparatur-Template-Design

1. Entwerfen einer SsODN HDR Vorlage enthält: (1) die Mutation von Interesse, (2) ein einzigartiges in-Frame Beschränkung Endonuklease Website, (3) eine Stille Mutation von einem oder beiden der Gs innerhalb der NGG PAM-Sequenz, und (4) 50 bp 5' und 3' Homologie Arme flankieren die erste und letzte Mutation. (Abbildung 1) ^{9 , 10}.
   1. Wenn Mutation der NGG PAM-Sequenz nicht möglich ist, stellen Sie ca. 5-6 Stille Mutationen innerhalb der SgRNA Anerkennung Zielsequenz, SgRNA-vermittelte Spaltung der SsODN HDR Vorlage zu verhindern.
2. Aus einer verfügbaren Quellen, z. B. Idtdna, erhalten eine "Ultramer DNA-Oligonukleotid" mit den folgenden Parametern: Skala: 4 Nmol; Formulierung: Keine; Reinigung: Standard Entsalzung.
3. Nach Erhalt, Zentrifugieren lyophilisierten SsODN mit Schlauch an > 12.000 x g für 1 min bei Raumtemperatur. Auszusetzen Sie vorsichtig wieder SsODN, eine Endkonzentration von 100 µM Nuklease-freie DdH₂O durch nach oben und unten 15 - 20 Mal mit einer P200 Pipette pipettieren.

3. Design Genotypisierung Primer

1. Entwerfen Sie eine Grundierung, die voraussichtlich eine ~ 400-700 bp PCR Amplifikate¹¹generieren flankieren die Genom-Modifikation.
2. Optimieren Sie PCR Radfahren Bedingungen, ein Einzel- und spezifischen Amplifikate¹¹zu produzieren.

4. Injektion Mischung vorbereiten

1. Zentrifugieren Sie Tabelle 1 Reagenzien mit maximaler Geschwindigkeit für 2 min bei 4 ° C.
2. Fügen Sie in der aufgeführten Reihenfolge Tabelle 1 Reagenzien zu einem Nuklease-freie PCR-Schlauch hinzu.
3. Mischen von pipettieren sanft nach oben und unten 10 mal mit einer Pipette P20.
4. Inkubieren Sie Injektion-Mix für 10 min bei Raumtemperatur.

5. Injektion Protokoll

1. Last Injektion Mikropipette mit ungefähr Hälfte der Injektion mischen¹². Speichern Sie verbleibende Injektion Mischung für den Fall, dass die Injektionsnadel verstopft oder bricht.
2. Mikropipette Spitze zu brechen, so dass ~ 20-30 p.s.i. eine allmähliche fließende Lösung¹²produziert.
   Hinweis: Größere Durchmesser Tipps negativ beeinflussen Tiergesundheit und F₁ Nachkommen Ausbeute zu verringern.
3. Injizieren von 10-15 junge Erwachsene Würmer in beiden Gonaden Armen möglichst¹². Ist dies nicht der Fall, Injektion in einen Gonaden Arm reicht.
4. Lassen Sie injizierte Tiere (P₀) für 1-2 h bei Raumtemperatur wieder auf eine 35 mm OP50 ausgesät Nematoden Medien (NGM) Wachstumsfuge zu. Anschließend wählen Sie injizierten P₀ Einzeltiere zu einzelnen OP50 entkernt 35 mm NGM Platten mit einem Platindraht Wurm¹².

6. P₀ Siebbleche und einzelne mCherry(+) F₁s

1. Zwei Tage nach der Injektion, P₀ Platten mit F₁ Nachkommen mit dem Ausdruck mCherry in den Rachenraum mit einem fluoreszierenden Stereomikroskop zu identifizieren (Abbildung 1, Tag 2: 3). Wählen Sie drei P-₀ -Platten, die die meisten mCherry(+) F₁ Tiere enthalten.
2. Aus jedem der drei ausgewählten P₀ Platten, einzelne 8-12 mCherry(+) F₁ Tiere für eine Gesamtmenge von 24-36 mCherry(+) F₁s mit einem Wurm wählen (Abbildung 1, Tag 2: 3).
   Hinweis: mCherry(-) Tiere können auch von diesen P-₀ -Platten ausgezeichnet, aber die Wahrscheinlichkeit korrekt identifizieren bearbeitet Tiere ist viel niedriger (Abb. 2A).
3. Ermöglichen Sie individuelle F₁s self-fertilize und Eier für 1-2 Tage bei Raumtemperatur.

7. Single Worm PCR und Genotypisierung

1. Übertragen Sie nach 1-2 Tagen eierlegende die F₁s in einzelnen PCR-Streifen Rohr Kappen mit 7 µL Wurm Lysis Puffer mit einem Wurm-Pick ( Abbildung 1,Tabelle 2, Tag 4-5).
2. Zentrifuge PCR-Röhrchen mit maximaler Geschwindigkeit für 1 min bei Raumtemperatur zu bringen Tiere den Rohrboden und Einfrieren von Rohren bei-80 ° C für 1 h.
   Hinweis: Würmer können bei-80 ° C auf unbestimmte Zeit gespeichert werden.
3. Lösen Sie gefrorene Würmer in einem Thermocycler mit dem folgenden Programm: 60 ° C für 60 min, 95 ° C für 15 min, 4 ° C halten.
4. Set-up PCR Mastermix wie in Tabelle 3dargestellt.
5. Fügen Sie 21 µL des PCR Mastermix in saubere PCR-Röhrchen, und fügen Sie 4 µL Wurm Lyse aus Schritt 3. Mischen Sie gut mit einer Pipette und führen Sie PCR-Programm nach den Hersteller-Richtlinien (siehe Materialtabelle).
6. PCR-Reaktionen mit einem DNA-sauber und Konzentrat-Kit, Anschluss an die Anweisungen des Herstellers zu reinigen (siehe Materialtabelle). Eluieren Sie DNA durch Zugabe von 10 µL Wasser auf die Spin-Spalte.
7. Set-up Restriktionsenzym Mastermix wie in Tabelle 4dargestellt.
8. Jeder gereinigten PCR Reaktion 10 µL Restriktionsenzym Mastermix hinzu und inkubieren Sie für 1-2 h bei 37 ° C¹³.
9. Separate verdaut PCR-Produkte auf einem 1,5 % Agarose-Gel bei 120 V mit 1 X Tris-Acetat-EDTA (TAE) Puffer¹⁴laufen.

8. Feststellung und Überprüfung der Reihenfolge der bearbeiteten Tiere

1. Untersuchen Sie Enzym verdaut Proben für die Anwesenheit von Bands, die darauf hinweisen, dass Potenzial Tiere¹⁴ (Abbildung 1, Tag 4-5) bearbeitet.
   Hinweis: Laden Sie eine N2-Steuerelement, um potenzielle Indel Mutationen zu identifizieren, die als Veränderungen in der Bandgröße und/oder unerwarteten und komplexen Beschränkung Enzym Verdauung Streifenbildung Muster beobachtet werden kann.
2. Verwenden Sie nach der Identifizierung potenzieller bearbeiteten Tiere die verbleibenden 3 µL Wurm Lyse und wiederholen der PCR-Reaktion. Nicht reinigen oder Restriktionsenzym verdauen der PCR-Reaktion, nachdem das Programm beendet ist. Die PCR-Reaktion auf einem 1 % Agarosegel, separate laden und extrahieren Sie die Band mit einem Gel Extraction Kit¹⁵ (siehe Materialtabelle).
3. Sanger Sequenz¹⁶ Gel extrahiert DNA mit Hilfe des F1-Primers zur Identifizierung richtig bearbeiteten Tiere (Abbildung 1A)
   Hinweis: Heterozygot liest enthalten werden überlagert Gipfeln aufgrund des Vorhandenseins von dem Wildtyp und Allel entwickelt.
4. Homozygote Tiere von verifizierten heterozygot bearbeiteten Tiere, einzelne 8-12₂ Tiere und führen Sie die Schritte 7-8.

Mutationen im menschlichen Superoxid-Dismutase 1 (SOD1) entfallen ca. 10-20 % der familiäre Amyotrophe Lateralsklerose, eine verheerende Neurodegenerative Erkrankung, die unweigerlich zu Lähmung und Tod17führt. Menschlichen SOD-1 ist ein evolutionär konservierte Protein 55 % Identität und 70 % Ähnlichkeit mit C. Elegans SOD-1-Proteins (Abbildung 1 b) zu teilen. Um die Einfachheit, Machbarkeit und Effizienz der CRISPR-Cas9 RNP basierenden Ansatzes zu demonstrieren, gezielte wir das C. Elegans Sod-1 -gen die krankheitsassoziierten menschlichen G93A Variante des Wurm-Genoms (Abbildung 1A) einzuführen.

Um die G93A Mutation im Genom von C. Elegans Ingenieur, wurde ein SgRNA gewählt, dessen PAM Anerkennung Seite 3 sitzt bp stromaufwärts des G93-Codon (Abbildung 1). Wir entwarfen ein HDR Reparatur Vorlage mit SsODN: 1) Nukleotid Änderungen A93 G93 Codon konvertieren (GGA GCA), (2) eine Stille Änderung der NGG PAM Sequenz (CGG CAG) um SgRNA-Cas9-vermittelte Spaltung der HDR-Vorlage (3) eine Stille Mutation (CT) zu verhindern, stellt eine einzigartige HindIII Restriktionsenzym Stätte für die Genotypisierung und 4) 50 bp 5' und 3' Homologie Arme (Abbildung 1). Ein PCR-Primer-Set (F1-R1) wurde entwickelt, um ein einzelnes 592 bp PCR-Produkt in N2-Steuerelementen (Abbildung 1A) zu produzieren. Eine Injektion Mischung enthält die SgRNA, wurden Cas9, SsODN und einem fluoreszierenden Marker Plasmid (pCFJ90) miteinander vermischt, für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert und in einer Mikroinjektion Pipette geladen.

Abbildung 1 zeigt den Workflow nach der Injektion-Mix in einer Injektion Mikropipette geladen wird. Am Tag 0 wurden in einem oder beiden Gonade Armen mit standard Mikroinjektion Technik18,1910-15 P0 Tiere injiziert. Injizierte Tiere erholt für 1-2 h und wurden dann einzeln auf OP50 ausgesät NGM Platten beschichtet. Nach 2-3 Tagen wurden erfolgreiche P-0 -Injektionen durch solche mit mCherry(+) F1 Nachkommen identifiziert. Die oberen drei P-0 -Platten (d.h. diejenigen, die die größte Anzahl an mCherry(+) F1s) wurden für die spätere Analyse ausgewählt. Aus jedem dieser drei Platten (P0-8, P0-10, P0-12) wurden zu einzelnen OP50 entkernt 35 mm NGM Platten für eine Gesamtmenge von 24 mCherry(+) F1s 8 mCherry(+) F1s hob. Nach 2-3 Tagen der Eiablage (Tag 4 - 5) wurden die einzelnen F1s in PCR-Röhrchen mit Wurm Lyse Puffer übertragen und für 1 h bei-80 ° c eingefroren Anschließend wurden die F1s lysiert um genomic DNA zu befreien, und PCR unterworfen. Die PCR-Produkte wurden dann gereinigt und verdaut mit HindIII 1 h und laufen auf einem 1,5 % Agarose-Gel um Potenzial erkennen Tiere bearbeitet. In richtig bearbeiteten Tiere HindIII Verdauung schneidet das Full-Length PCR-Produkt (592 bp) in zwei Bands von 370 bp und 222 bp. Diese Genotypisierung Strategie eindeutig unterscheidet zwischen Wildtyp (592 bp), heterozygot (592, 370, 222 bp) und homozygoten (370, 222 bp) Tiere. Abbildung 2A zeigt die Genotypisierung Ergebnisse für die 24 mCherry(+) Tiere.

Um zu demonstrieren, dass die fluoreszierenden mCherry Marker für Genom Modifikation bereichert, nahmen wir auch 8 mCherry(-) Tiere aus jeder der drei P-0 -Platten. Von den 24 mCherry(+) F1s gezeigt (roter Balken), 10 enthaltenen Mono-Allele oder Bi-allelic Veränderung (42 %), 10 wurden Wildtyp (42 %), 3 waren potenzielle Indels (13 %), und es gab 1 PCR-Fehler (Abbildung 2A). Dagegen war der 24 mCherry(-) F1s gezeigt, nur 1 Tier richtig modifizierte (4 %); in der Erwägung, dass 23 Wildtyp (96 %) wurden (Abbildung 2A). Abbildung 2 b zeigt dem Chromatogramm von abendfüllenden gel extrahierten PCR-Produkt (F18-6), zeigen, dass die genauen Nukleotid-Änderungen in der SsODN-HDR-Vorlage entworfen flossen originalgetreu in das Genom dieser homozygot F 1 Tier. F1 Tiere 10-7 10-8 und 12-3 ausgestellt vor allem unerwartete PCR Produktgrößen und Einschränkung Digest Streifenbildung Mustern, was darauf hindeutet, dass diese Tiere komplexe Indel Mutationen (Abbildung 2A) tragen können. So, unsere Methode ist nicht nur geeignet zur Erzeugung der gewünschten Genom ihrerseits mit Leichtigkeit, Effizienz und Treue, sondern ermöglicht auch die Identifizierung und Wiederherstellung der einzigartigen Indel Allele, die wichtig und unerwartete Einblicke in Genfunktion werfen kann.

Abbildung 1 . CRISPR-Cas9 Engineering von der C. ElegansSod-1 Locus. (A) Schematische Darstellung zeigt die Exon-Intron-Struktur von der Sod-1 -Lokus in C. Elegans. Die rote Balken kennzeichnet die Position des G93 im Exon 3. Primer paar Set ist durch den roten Pfeilen (F1-R1) zur Kenntnis genommen. (B) Reihenfolge Ausrichtung des Menschen- und C. Elegans (Wurm)-SOD-1-Proteine. Die gezielte G93 Rückstände ist rot hervorgehoben. (C) oben, ein Teil der genomischen DNA rund um das G93-Codon ist als Referenz gezeigt, und die PAM (grün) und SgRNA (blau) Zielseiten werden hervorgehoben. Unten, der einzigen gestrandeten Oligonukleotid (SsODN) Homologie gerichtet Reparatur (HDR) Vorlage wird angezeigt mit: das Codon bearbeiten ändern G93, A93, eine Stille Änderung das PAM-Motiv zur Spaltung durch die SgRNA-Cas9-Komplex, zu verhindern, dass ein stiller ändern in stellen einen einzigartigen Platz im HindIII Restriktionsenzym (gelbe Box) und flankierende 5' und 3' 50 bp Homologie Arme (schwarze Balken). Alle Nukleotid Änderungen in der SsODN sind rot hervorgehoben. (D) schematische Darstellung der Pipeline für die Erzeugung und CRISPR-Cas9 RNP-basierte Punkt Mutanten zu identifizieren. Am Tag 0 injizieren Sie 10-15 P0 Tiere mit Einspritzung-Mix. Am Tag 2-3 Geben Sie erfolgreich eingespritzte P0 Tiere mit fluoreszierenden F1 nachkommen, und wählen Sie drei P-0 -Platten mit den meisten fluoreszierenden nachkommen. Aus jedem der drei P0 Platten single 8 fluoreszierende F1 nachkommen. Am Tag 4-5, (a) Schritt 1, sind einzelne F1s abgeholt und in PCR-Röhrchen mit Lysis Puffer gelegt; (b) Schritt 2, sind nach dem Einfrieren bei-80 ° C, PCR-Röhrchen mit F-1 -Würmer lysiert genomischen DNA, lösen die als PCR-Vorlage verwendet wird. Die PCR-Produkte werden dann gereinigt und mit der einzigartigen Restriktionsenzym verdaut; (c) Schritt 3, Enzym verdaut Produkte werden auf einem Agarosegel aufgelöst, wo wilde Art (+ / +), heterozygot (m / +), und homozygot (m/w) Tiere durch Beschränkungsauswahl Streifen Muster identifiziert werden können. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2 . Genotypisierung Daten für Sod-1 (G93A) Mutanten. (A) Gelbild der F 1 Tiere einzeln lysiert, PCRed und mit HindIII verdaut. Für jedes P0 Platte (P0-8, P0-10, P0-12) wurden 8 mCherry(+) und 8 mCherry(-) F1 Tiere analysiert. Mono-Allelen (blaue Zahlen) und Bi-Allelen (rote Zahlen) bearbeiteten Tiere wurden geborgen. Größe verschoben PCR-Produkte oder unvorhergesehene HindIII verdaute Bands auch geborgen wurden, die bezeichnend für Indel Mutanten (gelbe Zahlen) sind. N2-Steuerelemente werden als Referenz für die PCR Produkt Dimensionierung und Enzym Spezifität angezeigt. (B) oben, Codon Abstand und Aminosäure-Übersetzungen sind für den Wildtyp (WT) oben und unten für G93A geändert Stränge. Die gewünschte Bearbeitung wird durch ein rotes Feld hervorgehoben, und die Stille Veränderungen, die eine in-Frame HindIII Einschränkung Website erstellen werden durch ein gelbes Kästchen hervorgehoben. Alle gestalteten Nukleotid-Änderungen sind fett dargestellt. Unten, repräsentative Chromatogramm von homozygot F1 Tier 8-6. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Tabelle 1. CRISPR-Cas9 RNP Injektion Mix. Alle Reagenzien sollten neu suspendierten Nuklease-freie DdH2O. RNase-freie Techniken sollten beim Umgang mit Reagenzien und bei der Injektion Mix verwendet werden.

Tabelle 2: Wurm Lysis Puffer Rezept. Proteinase K sollte frisch vor jedem Gebrauch hinzugefügt werden.

Tabelle 3. PCR Mastermix. Der PCR Mastermix sollte durch pipettieren, bis die Lösung homogen ist gut gemischt werden. 21 µL des PCR-Mastermix sauber PCR-Röhrchen hinzugefügt werden, und dann 4 µL der einzelnen Wurm lysate ordnungsgemäß beschrifteten Röhrchen hinzugefügt werden.

Tabelle 4. Restriktionsenzym Mastermix. Das Restriktionsenzym Mastermix sollte durch pipettieren, bis die Lösung homogen ist gut gemischt werden. 10 µL Restriktionsenzym Mastermix sollte 10 µL des gereinigten PCR Produkt hinzugefügt werden

Wir danken Mitglieder des Beg-Labors für kritische Lektüre des Manuskripts. Stämme lieferte Caenorhabditis Genetik Zentrum, das von NIH Büro Infrastruktur Forschungsprogramme (P40 OD010440) gefördert wird. Forschung im Labor Beg wird durch Zuschüsse aus dem NIH (R01 NS094678) und die Muscular Dystrophy Association (MDA382300), A.A.B. unterstützt.