Hier präsentieren wir eine Methode, um das Genom von C. Elegans Ingenieur CRISPR-Cas9 Ribonucleoproteins und Homologie abhängigen Reparatur Vorlagen.
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Methodenartikel
Eine schnelle und Facile Pipeline für die Erzeugung von Genomic Punkt Mutanten in C. Elegans verwenden CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die gruppierten regelmäßig eingestreuten palindromischen Wiederholungen (CRISPR) - CRISPR - assoziierten Protein 9 (Cas9) prokaryotische adaptive Immunabwehr als ein mächtiges Werkzeug für präzise eukaryotische Genom Engineering kooptiert worden hat. Hier präsentieren wir Ihnen eine schnelle und einfache Methode mit Chimären einzelne Guide RNAs (SgRNA) und CRISPR-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs) für die effiziente und präzise Generation von genomischen Punktmutationen in C. Elegans. Wir beschreiben eine Pipeline für SgRNA Zielauswahl, unter der Regie von Homologie (HDR) Vorlage Reparaturverfahren CRISPR-Cas9-RNP Komplexbildner und Lieferung und eine Genotypisierung-Strategie, die die robuste und schnelle Identifizierung von richtig bearbeiteten Tiere ermöglicht. Unser Ansatz ermöglicht die einfache Erzeugung und Identifizierung des gewünschten genomische Punkt mutierte Tiere nicht nur, sondern erleichtert auch den Nachweis von anderen komplexen Indel Allele in ca. 4-5 Tage mit hohem Wirkungsgrad und einer reduzierten Screening Arbeitsauslastung.
Einleitung
Jüngsten technologischen Fortschritte haben radikal umgewandelt und beschleunigt die Fähigkeit, genau Ingenieur Genome. Insbesondere wurde das CRISPR-Cas9-System, das stützt sich auf die RNA-geführte Endonuklease Cas9 induzieren eine Doppelstrang-Pause (DSB) in der Nähe der Zielsequenz von Interesse, weitgehend verwendet, um genau das Genom der Mehrheit der verwendeten Modellorganismen Ingenieur Biomedizinische Forschung1,2,3,4. Bezeichnenderweise hat die Verwendung von CRISPR-Cas9 freigeschaltet Genom-Bearbeitung auch bei schwierigen Arten ....
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Protokoll
Alle Tierpflege und experimentelle Verfahren befolgt die Leitlinie vom National Institutes of Health und institutionelle Tier Pflege und Nutzung Committee (IACUC) an der University of Michigan. Verwenden Sie RNase-freie Lösungen und Tipps im gesamten Protokoll pipette. Reinigen Sie der Arbeitsbereich, Pipetten, Schläuche und Zentrifuge mit RNase Dekontaminationslösung nach den Herstellerrichtlinien (siehe Materialtabelle).
1. SgRNA Zielauswahl
- Mit einem Webbrowser, öffnen Sie die Webseite: http://crispor.tefor.net8
- Eingabe von ~ 60 Basenpaaren (bp) Sequenz flankieren die gewünschte ....
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Ergebnisse
Mutationen im menschlichen Superoxid-Dismutase 1 (SOD1) entfallen ca. 10-20 % der familiäre Amyotrophe Lateralsklerose, eine verheerende Neurodegenerative Erkrankung, die unweigerlich zu Lähmung und Tod17führt. Menschlichen SOD-1 ist ein evolutionär konservierte Protein 55 % Identität und 70 % Ähnlichkeit mit C. Elegans SOD-1-Proteins (Abbildung 1 b) zu teilen. Um die Einfachheit, Machbarkeit und Effizienz der CRISPR-.......
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Diskussion
Das CRISPR-Cas9-System ist ein leistungsfähiges und effektives Werkzeug für präzise Änderung des Genoms von Modellorganismen. Hier zeigen wir die Chimäre SgRNAs20 in Verbindung mit SsODN HDR Vorlagen ermöglichen hoch effiziente Erzeugung von genomischen Punktmutationen in C. Elegans. Wichtig ist, zeigen wir, dass RNP Lieferung hocheffiziente Bearbeitung erzeugt, wenn Fluoreszenz dient als ein Co Selektionsmarker, Hervorhebung der Benutzerfreundlichkeit und Zuverlässigkeit der Technik.
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Offenlegungen
Wir danken Mitglieder des Beg-Labors für kritische Lektüre des Manuskripts. Stämme lieferte Caenorhabditis Genetik Zentrum, das von NIH Büro Infrastruktur Forschungsprogramme (P40 OD010440) gefördert wird. Forschung im Labor Beg wird durch Zuschüsse aus dem NIH (R01 NS094678) und die Muscular Dystrophy Association (MDA382300), A.A.B. unterstützt.
Danksagungen
Es gibt keine Interessenkonflikte im Zusammenhang mit diesem Bericht.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| CRISPRevolution sgRNA EZ Kit | Synthego Inc. | chimäre sgRNA | |
| Nuklease-frei TE | Synthego Inc. | mit dem sgRNA-Kit EZ Kit | |
| Nukleasefreies Wasser | Synthego Inc. | bereitgestellt mit dem sgRNA-Kit, EZ-Kit | |
| 4 nmol, Ultramer, DNA, Oligo | Integrated DNA Technologies | , ssODN, HDR-Template | |
| , Alt-R, S.p., HiFi, Cas9 Nuclease, 3NLS, | Integrated DNA Technologies | , 1078728 | Cas9-Protein |
| , pCFJ90 | Addgene | 19327 | Pmyo-2::mCherry Marker Plasmid |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| DNA Reinigen & Konzentrator | Zymo Research | D4004 | |
| Zymoclean Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4002 | |
| Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs | M0494L | |
| Proteinase K | Sigma | P2308 | |
| Glas Borosilikatglas Mikropipetten | Sutter Instruments | BF100-78-10 | OD: 1,0 mm. ID: 0.78mm |
| Trizma Hydrochlorid | Sigma | T5941 | |
| MgCl2 | Sigma | M2393 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| Tween-20 Fisher | Scientific | BP337-100 | |
| RNaseZap Dekontaminationslösung | Fisher Scientific | AM9780 |
Referenzen
- Dickinson, D. J., Goldstein, B. CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering. Genetics. 202, 885-901 (2016).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346, 1258096(20....
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Nachdrucke und Genehmigungen
