Eine schnelle und Facile Pipeline für die Erzeugung von Genomic Punkt Mutanten in C. Elegans verwenden CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Generierung genomischer Punktmutationen in C.Elegans unter Verwendung von einzelsträngigen Oligonukleotid-Homologie-gerichteten Reparatur-Templates und CRISPR/Cas9-Ribonukleoproteinen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Neurowissenschaften zu beantworten, wie z. B. die Bestimmung der pathologischen Folgen der genetischen Varianz im Zusammenhang mit neurodegenerativen Erkrankungen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass genomische Punktmutationen schnell erzeugt werden können, was die funktionelle Untersuchung genetischer Varianz im Rahmen einer endognösen regulatorischen Kontrolle ermöglicht und gleichzeitig die Vorbehalte einer Proteinüberexpression vermeidet.

Um die sgRNA-Zielauswahl durchzuführen, öffnen Sie die hier gezeigte Webseite. Geben Sie ca. 60 Basenpaare der Sequenz ein, die die gewünschte Bearbeitung von Interesse flankieren. Nachdem Sie das C.Elegans-Genom und das an den Protospacer angrenzende Motiv gemäß dem Textprotokoll ausgewählt haben, klicken Sie auf Senden.

Wählen Sie auf der Ergebnisseite die Zielsequenz mit dem höchsten Rang aus, die der gewünschten Bearbeitung am nächsten kommt. Nach Erhalt zentrifugieren Sie das lyophilisierte sgRNA-haltige Röhrchen eine Minute lang bei Raumtemperatur und mindestens 12.000 g. Geben Sie 60 Mikroliter nukleasefreies TE in das Röhrchen und verwenden Sie eine p200-Pipette zur sanften Resuspendierung, indem Sie 15 bis 20 Mal auf und ab pipettieren.

Die Endkonzentration beträgt 50 Mikromolaren. Entwerfen Sie ein ssODN HDR-Template, das die interessierende Mutation, eine im Rahmen der Frame-Restriktions-Endonuklease-Stelle einzigartige Mutation, eine stille Mutation eines oder beider Gs innerhalb der NGG-PAM-Sequenz und 50 Basenpaare, fünf Primzahl- und drei Primzahl-Homologiearme, die die erste und letzte Mutation flankieren, enthält. Zentrifugieren Sie nach Erhalt das lyophilisierte ssODN-enthaltende Röhrchen, wie gerade gezeigt, und verwenden Sie dann nukleasefreies DD H20, um ssODN vorsichtig auf eine Endkonzentration von 100 Mikromolar zu resuspendieren.

Um eine Injektionsmischung herzustellen, zentrifugieren Sie die hier gezeigten Reagenzien bei maximaler Geschwindigkeit und vier Grad Celsius für zwei Minuten. Geben Sie die Reagenzien in der angegebenen Reihenfolge in ein nukleasefreies PCR-Röhrchen. Verwenden Sie dann eine p20-Pipette, um den Inhalt vorsichtig und gründlich zu mischen.

Inkubieren Sie das Röhrchen zehn Minuten lang bei Raumtemperatur. Nach der Injektion von P0-Tieren gemäß dem Textprotokoll lassen Sie sie ein bis zwei Stunden lang bei Raumtemperatur auf einer mit OP50-Säen besäten 35-Millimeter-NGM-Platte erholen. Anschließend werden mit einem Platindraht-Wurmpickel einzelne injizierte P0-Tiere auf einzelne, mit OP50-Säen versehene 35-Millimeter-NGM-Platten übertragen.

Zwei Tage nach der Injektion wird ein Fluoreszenzmikroskop verwendet, um P0-Platten zu identifizieren, die F1-Nachkommen enthalten, die mCherry im Pharynx exprimieren. Wählen Sie drei P0-Platten aus, die die meisten mCherry-positiven F1-Tiere enthalten. Von jeder der drei ausgewählten P0-Platten werden mit einem Wurmpickel acht bis 12 mCherry-positive F1-Tiere für insgesamt 24 bis 36 mCherry-positive F1-Tiere einzeln entnommen.

Lassen Sie einzelne F1 sich selbst befruchten und legen Sie ein bis zwei Tage lang Eier bei Raumtemperatur. Nach ein bis zwei Tagen der Eiablage verwenden Sie einen Wurmpickel, um die F1s in einzelne PCR-Streifenröhrchenkappen zu übertragen, die sieben Mikroliter Wurmlysepuffer enthalten. Zentrifugieren Sie die PCR-Röhrchen eine Minute lang bei maximaler Geschwindigkeit und Raumtemperatur, um die Tiere auf den Boden des Röhrchens zu bringen.

Anschließend frieren Sie die Röhrchen eine Stunde lang bei minus 80 Grad Celsius ein. Als nächstes lysieren Sie gefrorene Würmer in einem Thermocycler mit dem folgenden Programm. Richten Sie dann einen PCR-Mastermix ein, wie in dieser Tabelle gezeigt.

Geben Sie 21 Mikroliter PCR-Mastermix in saubere PCR-Röhrchen, fügen Sie dann vier Mikroliter des Wurmlyseröhrchens hinzu und mischen Sie es durch Pipettieren gut. Führen Sie dann das PCR-Programm gemäß den Richtlinien des Herstellers durch. Reinigen Sie die PCR-Reaktionen mit einem DNA-Reinigungs- und Konzentrat-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers.

Verdünnen Sie dann die DNA, indem Sie 10 Mikroliter Wasser in die Spin-Säule geben. Nach dem Einrichten des Restriktionsenzym-Mastermixes geben Sie 10 Mikroliter zu jeder gereinigten PCR-Reaktion und inkubieren die Röhrchen ein bis zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Trennen Sie dann die verdauten PCR-Produkte auf einem 1,5%igen Agarosegel unter Verwendung von 1x TAE-Puffer bei 120 Volt.

Untersuchen Sie enzymverdaute Proben auf das Vorhandensein von Banden, die auf potenziell editierte Tiere hinweisen. Nach der Identifizierung potenziell editierter Tiere verwenden Sie die restlichen drei Mikroliter Wurmlyse und wiederholen die PCR. Laden Sie dann sofort die abgeschlossenen Reaktionen auf ein 1%-Agarose-Gel, bevor Sie die Bande mit einem Gelextraktionskit trennen und extrahieren.

Führen Sie mit dem F1-Primer eine Sanger-Sequenzierung durch, um korrekt editierte Tiere zu identifizieren. Schließlich sollen homozygote Tiere aus verifizierten heterozygoten editierten Tieren, einzelne acht bis 12 F2-Tiere gewonnen und eine Genotypisierung und Sequenzverifizierung gemäß dem Textprotokoll durchgeführt werden. Um die Einfachheit, Machbarkeit und Effizienz des CRISPR/Cas9 RNP-basierten Ansatzes zu demonstrieren, wurde das C.Elegans sod-1-Gen ins Visier genommen, um die krankheitsassoziierte humane G93a-Variante in das Wurmgenom einzuführen.

Dieses Gelbild zeigt die Genotypisierungsergebnisse von 24 mCherry-positiven F1-Tieren. 10 enthielten monoallylische oder biallylische Modifikationen, 10 waren Wildtyp, drei waren potentielle Indels und eines war ein PCR-Versagen. Um zu zeigen, dass der fluoreszierende mCherry-Marker für die Genommodifikation angereichert ist, wurden acht mCherry-negative Tiere aus jeder der drei P0-Platten ausgewählt.

Nur ein Tier wurde korrekt verändert, während 23 vom Wildtyp waren. Diese Abbildung zeigt das Chromatogramm des mit Gel extrahierten PCR-Produkts in voller Länge, das zeigt, dass die präzisen Nukleotidänderungen, die im ssODN HDR-Template entworfen wurden, originalgetreu in das Genom dieses homozygoten F1-Tieres eingebaut wurden. Einmal gemeistert, kann diese Technik verwendet werden, um genomische Punktmutationen in C.Elegans innerhalb von vier bis fünf Tagen zu generieren und zu identifizieren, wenn sie richtig durchgeführt wird.

Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, daran zu denken, kernfreie Reagenzien und Techniken wie RNase-freies Wasser, Filterpipettenspitzen und Handschuhe zu verwenden. Im Anschluss an dieses Verfahren können zelluläre, molekulare und Verhaltensassays durchgeführt werden, um Phänotypen zu untersuchen, die mit der interessierenden Mutation assoziiert sein können. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie genomische Punktmutationen in C.Elegans mit chimärer Single Guide RNase und CRISPR/Cas9 Ribonuclearproteinen präzise generiert werden können.