Name: Eine schnelle und Facile Pipeline für die Erzeugung von Genomic Punkt Mutanten in C. Elegans verwenden CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Lernen Sie eine schnelle CRISPR/Cas9-Methode zur Erzeugung genomischer Punktmutationen in C. elegans mit Ribonukleoproteinen. Diese Technik ermöglicht funktionelle Studien genetischer Varianten im Kontext endogener Regulationskontrolle.

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Es gibt keine Interessenkonflikte im Zusammenhang mit diesem Bericht.

Alle Tierpflege und experimentelle Verfahren befolgt die Leitlinie vom National Institutes of Health und institutionelle Tier Pflege und Nutzung Committee (IACUC) an der University of Michigan. Verwenden Sie RNase-freie Lösungen und Tipps im gesamten Protokoll pipette. Reinigen Sie der Arbeitsbereich, Pipetten, Schläuche und Zentrifuge mit RNase Dekontaminationslösung nach den Herstellerrichtlinien (siehe Materialtabelle).
1. SgRNA Zielauswahl
<ol><li>Mit einem Webbrowser, öffnen Sie die Webseite: http://crispor.tefor.net8<ol>
<li>Eingabe von ~ 60 Basenpaaren (bp) Sequenz flankieren die gewünschte Bearbeitung von Interesse (d.h. 30 bp 5' und 3' des gewünschten bearbeiten).</li>
		<li>Wählen Sie das Caenorhabditis Elegans Genom aus dem Pulldown-Menü.</li>
		<li>Wählen Sie die Protospacer angrenzenden Motiv (20 bp-NGG - SpCas9, SpCas9-HF1, eSPCas9 1.1) aus dem Pulldown-Menü.</li>
		<li>Klicken Sie auf Absenden. Wählen Sie auf der Ergebnisseite der oberste Rang Zielsequenz am nächsten an die Bearbeitung von Interesse. Wenn kein geeignetes Ziel Standorte innerhalb der flankierenden 60 bp Eingabesequenz vorhanden sind, erweitern Sie die Reihenfolge der Abfrage bis zu 100 bp (d.h. 50 bp beiderseits des gewünschten bearbeiten).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aus einer verfügbaren Quellen, z. B. Synthego, erhalten eine 20-Mer Ziel SgRNA mit den folgenden Spezifikationen: 3 Nmol; keine Änderungen.</li>
	<li>Nach Erhalt, Zentrifugieren lyophilisierten SgRNA mit Schlauch an > 12.000 x g für 1 min bei Raumtemperatur. Das Rohr 60 µL Nuklease-freie TE hinzu, und auszusetzen Sie sanft wieder nach oben und unten 15 - 20 Mal mit einer P200 Pipette pipettieren. Die Endkonzentration beträgt 50 µM.</li>
</ol>(2) Homologie gerichtete Reparatur-Template-Design
<ol><li>Entwerfen einer SsODN HDR Vorlage enthält: (1) die Mutation von Interesse, (2) ein einzigartiges in-Frame Beschränkung Endonuklease Website, (3) eine Stille Mutation von einem oder beiden der Gs innerhalb der NGG PAM-Sequenz, und (4) 50 bp 5' und 3' Homologie Arme flankieren die erste und letzte Mutation. (Abbildung 1) 9 , 10.<ol>
<li>Wenn Mutation der NGG PAM-Sequenz nicht möglich ist, stellen Sie ca. 5-6 Stille Mutationen innerhalb der SgRNA Anerkennung Zielsequenz, SgRNA-vermittelte Spaltung der SsODN HDR Vorlage zu verhindern.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aus einer verfügbaren Quellen, z. B. Idtdna, erhalten eine "Ultramer DNA-Oligonukleotid" mit den folgenden Parametern: Skala: 4 Nmol; Formulierung: Keine; Reinigung: Standard Entsalzung.</li>
	<li>Nach Erhalt, Zentrifugieren lyophilisierten SsODN mit Schlauch an > 12.000 x g für 1 min bei Raumtemperatur. Auszusetzen Sie vorsichtig wieder SsODN, eine Endkonzentration von 100 µM Nuklease-freie DdH2O durch nach oben und unten 15 - 20 Mal mit einer P200 Pipette pipettieren.</li>
</ol>3. Design Genotypisierung Primer
<ol><li>Entwerfen Sie eine Grundierung, die voraussichtlich eine ~ 400-700 bp PCR Amplifikate11generieren flankieren die Genom-Modifikation.</li>
	<li>Optimieren Sie PCR Radfahren Bedingungen, ein Einzel- und spezifischen Amplifikate11zu produzieren.</li>
</ol>4. Injektion Mischung vorbereiten
<ol><li>Zentrifugieren Sie Tabelle 1 Reagenzien mit maximaler Geschwindigkeit für 2 min bei 4 ° C.</li>
	<li>Fügen Sie in der aufgeführten Reihenfolge Tabelle 1 Reagenzien zu einem Nuklease-freie PCR-Schlauch hinzu.</li>
	<li>Mischen von pipettieren sanft nach oben und unten 10 mal mit einer Pipette P20.</li>
	<li>Inkubieren Sie Injektion-Mix für 10 min bei Raumtemperatur.</li>
</ol>5. Injektion Protokoll
<ol><li>Last Injektion Mikropipette mit ungefähr Hälfte der Injektion mischen12. Speichern Sie verbleibende Injektion Mischung für den Fall, dass die Injektionsnadel verstopft oder bricht.</li>
	<li>Mikropipette Spitze zu brechen, so dass ~ 20-30 p.s.i. eine allmähliche fließende Lösung12produziert. Hinweis: Größere Durchmesser Tipps negativ beeinflussen Tiergesundheit und F1 Nachkommen Ausbeute zu verringern.</li>
	<li>Injizieren von 10-15 junge Erwachsene Würmer in beiden Gonaden Armen möglichst12. Ist dies nicht der Fall, Injektion in einen Gonaden Arm reicht.</li>
	<li>Lassen Sie injizierte Tiere (P0) für 1-2 h bei Raumtemperatur wieder auf eine 35 mm OP50 ausgesät Nematoden Medien (NGM) Wachstumsfuge zu. Anschließend wählen Sie injizierten P0 Einzeltiere zu einzelnen OP50 entkernt 35 mm NGM Platten mit einem Platindraht Wurm12.</li>
</ol>6. P0 Siebbleche und einzelne mCherry(+) F1s
<ol><li>Zwei Tage nach der Injektion, P0 Platten mit F1 Nachkommen mit dem Ausdruck mCherry in den Rachenraum mit einem fluoreszierenden Stereomikroskop zu identifizieren (Abbildung 1, Tag 2: 3). Wählen Sie drei P-0 -Platten, die die meisten mCherry(+) F1 Tiere enthalten.</li>
	<li>Aus jedem der drei ausgewählten P0 Platten, einzelne 8-12 mCherry(+) F1 Tiere für eine Gesamtmenge von 24-36 mCherry(+) F1s mit einem Wurm wählen (Abbildung 1, Tag 2: 3). Hinweis: mCherry(-) Tiere können auch von diesen P-0 -Platten ausgezeichnet, aber die Wahrscheinlichkeit korrekt identifizieren bearbeitet Tiere ist viel niedriger (Abb. 2A).</li>
	<li>Ermöglichen Sie individuelle F1s self-fertilize und Eier für 1-2 Tage bei Raumtemperatur.</li>
</ol>7. Single Worm PCR und Genotypisierung
<ol><li>Übertragen Sie nach 1-2 Tagen eierlegende die F1s in einzelnen PCR-Streifen Rohr Kappen mit 7 µL Wurm Lysis Puffer mit einem Wurm-Pick ( Abbildung 1,Tabelle 2, Tag 4-5).</li>
	<li>Zentrifuge PCR-Röhrchen mit maximaler Geschwindigkeit für 1 min bei Raumtemperatur zu bringen Tiere den Rohrboden und Einfrieren von Rohren bei-80 ° C für 1 h. Hinweis: Würmer können bei-80 ° C auf unbestimmte Zeit gespeichert werden.</li>
	<li>Lösen Sie gefrorene Würmer in einem Thermocycler mit dem folgenden Programm: 60 ° C für 60 min, 95 ° C für 15 min, 4 ° C halten.</li>
	<li>Set-up PCR Mastermix wie in Tabelle 3dargestellt.</li>
	<li>Fügen Sie 21 µL des PCR Mastermix in saubere PCR-Röhrchen, und fügen Sie 4 µL Wurm Lyse aus Schritt 3. Mischen Sie gut mit einer Pipette und führen Sie PCR-Programm nach den Hersteller-Richtlinien (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>PCR-Reaktionen mit einem DNA-sauber und Konzentrat-Kit, Anschluss an die Anweisungen des Herstellers zu reinigen (siehe Materialtabelle). Eluieren Sie DNA durch Zugabe von 10 µL Wasser auf die Spin-Spalte.</li>
	<li>Set-up Restriktionsenzym Mastermix wie in Tabelle 4dargestellt.</li>
	<li>Jeder gereinigten PCR Reaktion 10 µL Restriktionsenzym Mastermix hinzu und inkubieren Sie für 1-2 h bei 37 ° C13.</li>
	<li>Separate verdaut PCR-Produkte auf einem 1,5 % Agarose-Gel bei 120 V mit 1 X Tris-Acetat-EDTA (TAE) Puffer14laufen.</li>
</ol>8. Feststellung und Überprüfung der Reihenfolge der bearbeiteten Tiere
<ol><li>Untersuchen Sie Enzym verdaut Proben für die Anwesenheit von Bands, die darauf hinweisen, dass Potenzial Tiere14 (Abbildung 1, Tag 4-5) bearbeitet. Hinweis: Laden Sie eine N2-Steuerelement, um potenzielle Indel Mutationen zu identifizieren, die als Veränderungen in der Bandgröße und/oder unerwarteten und komplexen Beschränkung Enzym Verdauung Streifenbildung Muster beobachtet werden kann.</li>
	<li>Verwenden Sie nach der Identifizierung potenzieller bearbeiteten Tiere die verbleibenden 3 µL Wurm Lyse und wiederholen der PCR-Reaktion. Nicht reinigen oder Restriktionsenzym verdauen der PCR-Reaktion, nachdem das Programm beendet ist. Die PCR-Reaktion auf einem 1 % Agarosegel, separate laden und extrahieren Sie die Band mit einem Gel Extraction Kit15 (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Sanger Sequenz16 Gel extrahiert DNA mit Hilfe des F1-Primers zur Identifizierung richtig bearbeiteten Tiere (Abbildung 1A) Hinweis: Heterozygot liest enthalten werden überlagert Gipfeln aufgrund des Vorhandenseins von dem Wildtyp und Allel entwickelt.</li>
	<li>Homozygote Tiere von verifizierten heterozygot bearbeiteten Tiere, einzelne 8-122 Tiere und führen Sie die Schritte 7-8.</li>
</ol>

<ol><li>Dickinson, D. J., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Based+Methods+for+Caenorhabditis+elegans+Genome+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering.</a> Genetics. 202, 885-901 (2016).</li>
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<li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas+systems+for+editing%2C+regulating+and+targeting+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat Biotechnol. 32, 347-355 (2014).</li>
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<li>Yin, H., Kauffman, K. J., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+technologies+for+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Delivery technologies for genome editing.</a> Nat Rev Drug Discov. 16, 387-399 (2017).</li>
<li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Res. 24, 1012-1019 (2014).</li>
<li>Haeussler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+off-target+and+on-target+scoring+algorithms+and+integration+into+the+guide+RNA+selection+tool+CRISPOR%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR.</a> Genome Biol. 17, 148(2016).</li>
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<li>Gurney, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neuron+degeneration+in+mice+that+express+a+human+Cu%2CZn+superoxide+dismutase+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation.</a> Science. 264, 1772-1775 (1994).</li>
</ol>

Wir danken Mitglieder des Beg-Labors für kritische Lektüre des Manuskripts. Stämme lieferte Caenorhabditis Genetik Zentrum, das von NIH Büro Infrastruktur Forschungsprogramme (P40 OD010440) gefördert wird. Forschung im Labor Beg wird durch Zuschüsse aus dem NIH (R01 NS094678) und die Muscular Dystrophy Association (MDA382300), A.A.B. unterstützt.

Das CRISPR-Cas9-System ist ein leistungsfähiges und effektives Werkzeug für präzise Änderung des Genoms von Modellorganismen. Hier zeigen wir die Chimäre SgRNAs20 in Verbindung mit SsODN HDR Vorlagen ermöglichen hoch effiziente Erzeugung von genomischen Punktmutationen in C. Elegans. Wichtig ist, zeigen wir, dass RNP Lieferung hocheffiziente Bearbeitung erzeugt, wenn Fluoreszenz dient als ein Co Selektionsmarker, Hervorhebung der Benutzerfreundlichkeit und Zuverlässigkeit der Technik....

Jüngsten technologischen Fortschritte haben radikal umgewandelt und beschleunigt die Fähigkeit, genau Ingenieur Genome. Insbesondere wurde das CRISPR-Cas9-System, das stützt sich auf die RNA-geführte Endonuklease Cas9 induzieren eine Doppelstrang-Pause (DSB) in der Nähe der Zielsequenz von Interesse, weitgehend verwendet, um genau das Genom der Mehrheit der verwendeten Modellorganismen Ingenieur Biomedizinische Forschung1,2,3,4. Bezeichnenderweise hat die Verwendung von CRISPR-Cas9 freigeschaltet Genom-Bearbeitung auch bei schwierigen Arten wie C. Elegans5. Unabhängig von der Spezies, Generierung von Punktmutationen mit dem Redaktionssystem CRISPR-Cas9 Basis-Genom stützt sich auf drei Kernkomponenten: (1) Cas9 Endonuklease, 2) einen einzigen Führer RNA (SgRNA), die Cas9 Endonuklease einer Zielsequenz und (3) ein Benutzer entwickelt, leitet unter der Regie von Homologie Reparatur (HDR) Vorlage mit dem gewünschten edit(s) von Interesse2.
Es gibt mehrere Methoden, die verwendet werden können, die gezielt SgRNA und Cas9 einzuführen Nuklease in Zellen einschließlich Plasmid, RNA und viral-basierte Lieferung Methoden6. Vor kurzem hat Direktlieferung von Pre-komplexiert SgRNA-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs) als ein leistungsfähiges und effizientes Werkzeug im CRISPR-Cas9-basierte Genom Bearbeitung7entstanden. Die direkte Zustellung von Pre-komplexiert CRISPR-Cas9-RNPs hat einige deutliche Vorteile, nämlich: (1) RNPs umgehen die Notwendigkeit einer zellulären Transkription und Übersetzung, 2) RNPs sind schnell gelöscht, Spezifität erhöhen durch Verringerung der zur Verfügung stehende Zeit für Ziel Spaltung und 3) RNPs enthalten keine fremden DNA/RNA-Elemente, die die Einführung von Gebietsfremden Sequenzen in das wirtsgenom durch zufällige Integration umgeht. Zusammen bieten diese Attribute wahrscheinlich eine kurzlebige Platzen der zielgerichtet CRISPR Bearbeitung bei gleichzeitiger Minimierung der Ziel-Effekte.
Ein einfaches und effizientes Protokoll für die Einführung von standortspezifischer genomischer Veränderungen in C. Elegansbeschrieben. Dieses Protokoll enthält targeting SgRNA und einzelne gestrandeten Oligonukleotid (SsODN)-HDR-Template-Design, SgRNA-Cas9 RNP Komplexbildner und Lieferung und eine Genotypisierung Strategie für die eindeutige Kennzeichnung der richtig bearbeiteten Tiere. Mit dieser Strategie, nicht nur die gewünschten Site-spezifische Änderungen zurückgewonnen werden, aber andere unspezifische Indel Mutationen können auch wiederhergestellt werden. So, unsere Strategie erlaubt die Generation der ein Allel Serie mit einer einheitlichen Strategie, wo Mono-Allele, Bi-Allel und Indel Mutanten in der F-1 Generation erzeugt werden können.

<table><tbody><tr><td>CRISPRevolution sgRNA&nbsp; EZ Kit</td><td>Synthego Inc.</td><td></td><td>chimäre sgRNA</td></tr><tr><td>Nuklease-frei TE</td><td>Synthego Inc.</td><td>mit dem sgRNA-Kit EZ Kit</td><td></td></tr><tr><td>Nukleasefreies Wasser</td><td>Synthego Inc.</td><td>bereitgestellt mit dem sgRNA-Kit, EZ-Kit</td><td></td></tr>, <tr><td>4 nmol, Ultramer, DNA, Oligo</td>, <td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>, ssODN, HDR-Template</td></tr><tr><td>, Alt-R, S.p., HiFi, Cas9 Nuclease, 3NLS,</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>, 1078728</td><td>Cas9-Protein</td></tr><tr><td>, pCFJ90&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>19327</td><td>Pmyo-2::mCherry Marker Plasmid</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>DNA Reinigen & Konzentrator</td><td>Zymo Research</td><td>D4004</td><td></td></tr><tr><td>Zymoclean Gel DNA Recovery Kit</td><td>Zymo Research</td><td>D4002</td><td></td></tr><tr><td>Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>M0494L</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma</td><td>P2308</td><td></td></tr><tr><td>Glas Borosilikatglas Mikropipetten</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF100-78-10</td><td>OD: 1,0 mm. ID: 0.78mm</td></tr><tr><td>Trizma Hydrochlorid</td><td>Sigma</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20 Fisher</td><td>Scientific</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap Dekontaminationslösung</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr></tbody></table>

eine schnelle und facile pipeline für die erzeugung von genomic punkt mutanten in c. elegans verwenden crispr/cas9 ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

Die gruppierten regelmäßig eingestreuten palindromischen Wiederholungen (CRISPR) - CRISPR - assoziierten Protein 9 (Cas9) prokaryotische adaptive Immunabwehr als ein mächtiges Werkzeug für präzise eukaryotische Genom Engineering kooptiert worden hat. Hier präsentieren wir Ihnen eine schnelle und einfache Methode mit Chimären einzelne Guide RNAs (SgRNA) und CRISPR-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs) für die effiziente und präzise Generation von genomischen Punktmutationen in C. Elegans. Wir beschreiben eine Pipeline für SgRNA Zielauswahl, unter der Regie von Homologie (HDR) Vorlage Reparaturverfahren CRISPR-Cas9-RNP Komplexbildner und Lieferung und eine Genotypisierung-Strategie, die die robuste und schnelle Identifizierung von richtig bearbeiteten Tiere ermöglicht. Unser Ansatz ermöglicht die einfache Erzeugung und Identifizierung des gewünschten genomische Punkt mutierte Tiere nicht nur, sondern erleichtert auch den Nachweis von anderen komplexen Indel Allele in ca. 4-5 Tage mit hohem Wirkungsgrad und einer reduzierten Screening Arbeitsauslastung.

Mutationen im menschlichen Superoxid-Dismutase 1 (SOD1) entfallen ca. 10-20 % der familiäre Amyotrophe Lateralsklerose, eine verheerende Neurodegenerative Erkrankung, die unweigerlich zu Lähmung und Tod17führt. Menschlichen SOD-1 ist ein evolutionär konservierte Protein 55 % Identität und 70 % Ähnlichkeit mit C. Elegans SOD-1-Proteins (Abbildung 1 b) zu teilen. Um die Einfachheit, Machbarkeit und Effizienz der CRISPR-...

Hier präsentieren wir eine Methode, um das Genom von C. Elegans Ingenieur CRISPR-Cas9 Ribonucleoproteins und Homologie abhängigen Reparatur Vorlagen.

Eine schnelle und Facile Pipeline für die Erzeugung von Genomic Punkt Mutanten in C. Elegans verwenden CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Generierung genomischer Punktmutationen in C.Elegans unter Verwendung von einzelsträngigen Oligonukleotid-Homologie-gerichteten Reparatur-Templates und CRISPR/Cas9-Ribonukleoproteinen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Neurowissenschaften zu beantworten, wie z. B. die Bestimmung der pathologischen Folgen der genetischen Varianz im Zusammenhang mit neurodegenerativen Erkrankungen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass genomische Punktmutationen schnell erzeugt werden können, was die funktionelle Untersuchung genetischer Varianz im Rahmen einer endognösen regulatorischen Kontrolle ermöglicht und gleichzeitig die Vorbehalte einer Proteinüberexpression vermeidet.Um die sgRNA-Zielauswahl durchzuführen, öffnen Sie die hier gezeigte Webseite. Geben Sie ca. 60 Basenpaare der Sequenz ein, die die gewünschte Bearbeitung von Interesse flankieren. Nachdem Sie das C.Elegans-Genom und das an den Protospacer angrenzende Motiv gemäß dem Textprotokoll ausgewählt haben, klicken Sie auf Senden.Wählen Sie auf der Ergebnisseite die Zielsequenz mit dem höchsten Rang aus, die der gewünschten Bearbeitung am nächsten kommt. Nach Erhalt zentrifugieren Sie das lyophilisierte sgRNA-haltige Röhrchen eine Minute lang bei Raumtemperatur und mindestens 12.000 g. Geben Sie 60 Mikroliter nukleasefreies TE in das Röhrchen und verwenden Sie eine p200-Pipette zur sanften Resuspendierung, indem Sie 15 bis 20 Mal auf und ab pipettieren.Die Endkonzentration beträgt 50 Mikromolaren. Entwerfen Sie ein ssODN HDR-Template, das die interessierende Mutation, eine im Rahmen der Frame-Restriktions-Endonuklease-Stelle einzigartige Mutation, eine stille Mutation eines oder beider Gs innerhalb der NGG-PAM-Sequenz und 50 Basenpaare, fünf Primzahl- und drei Primzahl-Homologiearme, die die erste und letzte Mutation flankieren, enthält. Zentrifugieren Sie nach Erhalt das lyophilisierte ssODN-enthaltende Röhrchen, wie gerade gezeigt, und verwenden Sie dann nukleasefreies DD H20, um ssODN vorsichtig auf eine Endkonzentration von 100 Mikromolar zu resuspendieren.Um eine Injektionsmischung herzustellen, zentrifugieren Sie die hier gezeigten Reagenzien bei maximaler Geschwindigkeit und vier Grad Celsius für zwei Minuten. Geben Sie die Reagenzien in der angegebenen Reihenfolge in ein nukleasefreies PCR-Röhrchen. Verwenden Sie dann eine p20-Pipette, um den Inhalt vorsichtig und gründlich zu mischen.Inkubieren Sie das Röhrchen zehn Minuten lang bei Raumtemperatur. Nach der Injektion von P0-Tieren gemäß dem Textprotokoll lassen Sie sie ein bis zwei Stunden lang bei Raumtemperatur auf einer mit OP50-Säen besäten 35-Millimeter-NGM-Platte erholen. Anschließend werden mit einem Platindraht-Wurmpickel einzelne injizierte P0-Tiere auf einzelne, mit OP50-Säen versehene 35-Millimeter-NGM-Platten übertragen.Zwei Tage nach der Injektion wird ein Fluoreszenzmikroskop verwendet, um P0-Platten zu identifizieren, die F1-Nachkommen enthalten, die mCherry im Pharynx exprimieren. Wählen Sie drei P0-Platten aus, die die meisten mCherry-positiven F1-Tiere enthalten. Von jeder der drei ausgewählten P0-Platten werden mit einem Wurmpickel acht bis 12 mCherry-positive F1-Tiere für insgesamt 24 bis 36 mCherry-positive F1-Tiere einzeln entnommen.Lassen Sie einzelne F1 sich selbst befruchten und legen Sie ein bis zwei Tage lang Eier bei Raumtemperatur. Nach ein bis zwei Tagen der Eiablage verwenden Sie einen Wurmpickel, um die F1s in einzelne PCR-Streifenröhrchenkappen zu übertragen, die sieben Mikroliter Wurmlysepuffer enthalten. Zentrifugieren Sie die PCR-Röhrchen eine Minute lang bei maximaler Geschwindigkeit und Raumtemperatur, um die Tiere auf den Boden des Röhrchens zu bringen.Anschließend frieren Sie die Röhrchen eine Stunde lang bei minus 80 Grad Celsius ein. Als nächstes lysieren Sie gefrorene Würmer in einem Thermocycler mit dem folgenden Programm. Richten Sie dann einen PCR-Mastermix ein, wie in dieser Tabelle gezeigt.Geben Sie 21 Mikroliter PCR-Mastermix in saubere PCR-Röhrchen, fügen Sie dann vier Mikroliter des Wurmlyseröhrchens hinzu und mischen Sie es durch Pipettieren gut. Führen Sie dann das PCR-Programm gemäß den Richtlinien des Herstellers durch. Reinigen Sie die PCR-Reaktionen mit einem DNA-Reinigungs- und Konzentrat-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers.Verdünnen Sie dann die DNA, indem Sie 10 Mikroliter Wasser in die Spin-Säule geben. Nach dem Einrichten des Restriktionsenzym-Mastermixes geben Sie 10 Mikroliter zu jeder gereinigten PCR-Reaktion und inkubieren die Röhrchen ein bis zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Trennen Sie dann die verdauten PCR-Produkte auf einem 1,5%igen Agarosegel unter Verwendung von 1x TAE-Puffer bei 120 Volt.Untersuchen Sie enzymverdaute Proben auf das Vorhandensein von Banden, die auf potenziell editierte Tiere hinweisen. Nach der Identifizierung potenziell editierter Tiere verwenden Sie die restlichen drei Mikroliter Wurmlyse und wiederholen die PCR. Laden Sie dann sofort die abgeschlossenen Reaktionen auf ein 1%-Agarose-Gel, bevor Sie die Bande mit einem Gelextraktionskit trennen und extrahieren.Führen Sie mit dem F1-Primer eine Sanger-Sequenzierung durch, um korrekt editierte Tiere zu identifizieren. Schließlich sollen homozygote Tiere aus verifizierten heterozygoten editierten Tieren, einzelne acht bis 12 F2-Tiere gewonnen und eine Genotypisierung und Sequenzverifizierung gemäß dem Textprotokoll durchgeführt werden. Um die Einfachheit, Machbarkeit und Effizienz des CRISPR/Cas9 RNP-basierten Ansatzes zu demonstrieren, wurde das C.Elegans sod-1-Gen ins Visier genommen, um die krankheitsassoziierte humane G93a-Variante in das Wurmgenom einzuführen.Dieses Gelbild zeigt die Genotypisierungsergebnisse von 24 mCherry-positiven F1-Tieren. 10 enthielten monoallylische oder biallylische Modifikationen, 10 waren Wildtyp, drei waren potentielle Indels und eines war ein PCR-Versagen. Um zu zeigen, dass der fluoreszierende mCherry-Marker für die Genommodifikation angereichert ist, wurden acht mCherry-negative Tiere aus jeder der drei P0-Platten ausgewählt.Nur ein Tier wurde korrekt verändert, während 23 vom Wildtyp waren. Diese Abbildung zeigt das Chromatogramm des mit Gel extrahierten PCR-Produkts in voller Länge, das zeigt, dass die präzisen Nukleotidänderungen, die im ssODN HDR-Template entworfen wurden, originalgetreu in das Genom dieses homozygoten F1-Tieres eingebaut wurden. Einmal gemeistert, kann diese Technik verwendet werden, um genomische Punktmutationen in C.Elegans innerhalb von vier bis fünf Tagen zu generieren und zu identifizieren, wenn sie richtig durchgeführt wird.Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, daran zu denken, kernfreie Reagenzien und Techniken wie RNase-freies Wasser, Filterpipettenspitzen und Handschuhe zu verwenden. Im Anschluss an dieses Verfahren können zelluläre, molekulare und Verhaltensassays durchgeführt werden, um Phänotypen zu untersuchen, die mit der interessierenden Mutation assoziiert sein können. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie genomische Punktmutationen in C.Elegans mit chimärer Single Guide RNase und CRISPR/Cas9 Ribonuclearproteinen präzise generiert werden können.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Dieses Video beschreibt eine Technik, um einen einzelnen Nematoden durch PCR-Screening schnell auf einen genetischen Marker zu untersuchen. Im Beispielprotokoll untersuchen wir die CRISPR-basierte Genom-Editierung.

Einzelwurm-PCR: Eine Methode zur Extraktion und Amplifikation genomischer DNA

Dieses Video beschreibt die Mikroinjektion, eine gängige Methode zur Herstellung transgener C. elegans-Stämme. Im Beispiel sehen wir, wie die Mikroinjektion verwendet wird, um einen Ribonukleoprotein (RNP)-Komplex für die Genbearbeitung auf CRISPR-Basen einzuführen.

Gonaden-Mikroinjektion: Eine Methode zur direkten Verabreichung von Verbindungen in die Keimbahn von C. elegans

CRISPR/Cas9 ist ein robustes System, um Störungen von Genen und genetischen Elementen zu erzeugen. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur effizienten Erzeugung genomischer Deletionen in Säugetierzelllinien mittels CRISPR/Cas9.

Generierung von Genomic Löschungen in Säugerzelllinien über CRISPR / Cas9

Die Genotypisierung hier beschriebene Technik, die Paare fluoreszierende Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Gelelektrophorese Kapillare ermöglicht eine Hochdurchsatz-Genotypisierung von Nuklease-vermittelte knockout-Klone. Es umgeht die von anderen Genotypisierung Techniken konfrontiert Einschränkungen und kostengünstiger als Sequenzierungsverfahren ist.

Mit Hilfe eines Fluoreszenz-PCR-Kapillar-Gel-Elektrophorese-Technik CRISPR zum Genotyp / Cas9 vermittelte Knock-out Mutanten in einem Hochdurchsatz-Format

Gezielte Genom-Bearbeitung im Modellsystem Danio Rerio (Zebrafisch) wurde durch das Aufkommen von CRISPR-basierte Ansätze erheblich erleichtert. Hier beschreiben wir eine schlanke, robuste Protokoll für Erzeugung und Identifizierung von CRISPR-abgeleitete Unsinn Allele, die Heteroduplex Mobility Assay integriert und Identifizierung von Mutationen mit Next Generation Sequencing.

Effiziente Produktion und Kennzeichnung der CRISPR/Cas9 generiert gen Knockouts im Modellsystem Danio rerio

Unter Verwendung einer vormontierten Cas9 ist Ribonucleoprotein Komplex (RNP) eine leistungsfähige Methode für präzise und effiziente Genom-Bearbeitung. Hier heben wir ihre Nützlichkeit in einem breiten Spektrum von Zellen und Organismen, einschließlich der primären humanen Zellen und sowohl klassische und neue Modellorganismen.

Verbesserte Genom Bearbeitung mit Cas9 Ribonucleoprotein in verschiedenen Zellen und Organismen

Dieses Protokoll bietet eine Methode zur Erleichterung der Erzeugung definierter heterozygoter oder homozygoter Nukleotid-Änderungen mit CRISPR-CAS9 in menschlichen pluripotenten Stammzellen.

Generierung definierter genomischer Modifikationen mit CRISPR-CAS9 in humanen pluripotenten Stammzellen

Ziel dieses Protokolls ist es, eine nahtlose CRISPR/Cas9-Bearbeitung des C. elegans-Genoms unter Verwendung von zusammengesetzten Ribonukleoproteinkomplexen und dem dpy-10-Co-CRISPR-Marker für das Screening zu ermöglichen. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um eine Vielzahl von genetischen Modifikationen in C. elegans vorzunehmen, einschließlich Insertionen, Deletionen, Genersatz und Codon-Substitutionen.

CRISPR/Cas9-Editierung des C. elegans rbm-3.2-Gens mit dem dpy-10 Co-CRISPR Screening Marker und Assembled Ribonucleoprotein Complexes.

Hier beschreiben wir eine einfache Technik zur effizienten Erzeugung von genetisch veränderten Mäusen namens CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). Diese Methode liefert Editierreagenzien durch Elektroporation in Embryonen mit einer Effizienz von nahezu 100%. Dieses Protokoll ist wirksam bei Punktmutationen, kleinen genomischen Insertionen und Deletionen in Säugetierembryonen.

Effiziente Genom-Editierung von Mäusen durch CRISPR-Elektroporation von Zygoten

Dieser Artikel demonstriert die CRISPR-Cas9-vermittelte Genomtechnik im Steinernema hermaphroditum, einem entomopathogenen (EPN: insektenparasitären) Nematoden, und einem entstehenden genetischen Modell. Die beschriebene Technologie ist nützlich zur Erzeugung von Mutanten und ermöglicht die Aufklärung von Genfunktionen in der Nematodenbiologie, die für mutualistische und parasitäre Symbiose relevant sind.

CRISPR-Cas9-basierte Mutagenese im entomopathogenen Nematoden Steinernema hermaphroditum und die Erhaltung mutanter Linien

Ein CRISPR/Cas9-Mikroinjektions-Workflow für endogene fluoreszierende Markierung in der Keimlinie Caenorhabditis elegans , um homozygote Knock-in-Linien für die In-vivo-Proteinlokalisationsanalyse zu erhalten.

CRISPR/Cas9-vermittelte endogene fluoreszierende Markierung keimbahnspezifischer Gene in Caenorhabditis elegans

Lernen Sie eine schnelle CRISPR/Cas9-Methode zur Erzeugung genomischer Punktmutationen in C. elegans mit Ribonukleoproteinen. Diese Technik ermöglicht funktionelle Studien genetischer Varianten im Kontext endogener Regulationskontrolle.

Eine schnelle und Facile Pipeline für die Erzeugung von Genomic Punkt Mutanten in C. Elegans verwenden CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins (Video) | JoVE Journal

Eine schnelle und Facile Pipeline für die Erzeugung von Genomic Punkt Mutanten in C. Elegans verwenden CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

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