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Methodenartikel

Murine Speichel funktionale Bewertung über Pilocarpin Stimulation folgenden fraktioniert Bestrahlung

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DOI:

10.3791/57522

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4. Mai 2018

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1Department of Biomedical Engineering, University of Rochester, 2Department of Otolaryngology, University of Rochester Medical Center, 3Center for Oral Biology, University of Rochester Medical Center

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir präsentieren Ihnen einen detaillierten Ansatz zur Durchführung von Speichel Sammlung, einschließlich murinen Tracheostoma und die Isolation der drei großen Speicheldrüsen.

Zusammenfassung

Hyposalivation wird allgemein in der Autoimmun-Reaktion von Sjögren Syndrom oder die folgenden Strahlung Verletzung der großen Speicheldrüsen beobachtet. In diesen Fällen bleiben Fragen hinsichtlich der Pathogenese der Krankheit und wirksame Interventionen. Eine optimierte Technik, die funktionale Bewertung der Speicheldrüsen können, ist von unschätzbarem Wert für die Untersuchung von therapeutisches Drüse Biologie, Dysfunktion und Therapeutika. Hier präsentieren wir einen Schritt-für-Schritt-Ansatz zur Durchführung von Pilocarpin stimuliert die Sekretion von Speichel, einschließlich Tracheostoma und die Zerlegung der drei großen murinen Speicheldrüsen. Wir ausführlich auch die entsprechenden murine Kopf und Hals Anatomie während dieser Techniken zugegriffen. Dieser Ansatz ist skalierbar, so dass für mehrere Mäuse gleichzeitig verarbeitet werden somit die Effizienz der Arbeitsabläufe. Unser Ziel ist es, die Reproduzierbarkeit dieser Methoden zu verbessern, von die jede weitere Anwendungen auf dem Gebiet hat. Neben Speichel Sammlung diskutieren wir Metriken für die Quantifizierung und Normalisierung der Funktionsfähigkeit dieser Gewebe. Repräsentative Daten sind 2 Wochen nach der fraktionierte Bestrahlung (4 Dosen von 6,85 Gy) von mandibulären Drüsen mit depressiven Speicheldrüse Funktion enthalten.

Einleitung

Speicheldrüse Störungen gehören Syndrome Dysregulated oder beeinträchtigt Sekretion führt zu Überproduktion (Sialorrhea) oder Unterproduktion (Xerostomie und endodontischen) Speichel1. In beiden Fällen gibt es Interesse an der Verbesserung unser Verständnis der Biologie der Speicheldrüse auf das Endziel der therapeutischen Entwicklung2.

Die Speicheldrüsen sind sehr strahlenempfindlichen Organe und sind oft im Kopf und Nacken Krebs Strahlentherapie, führt zu dauerhaften Mundtrockenheit (Xerostomie)3,4beschädigt. Im Gegensatz zu anderen strahlenempfindlichen Geweben Speicheldrüse Fluktuationsrate ist relativ gering, und der Mechanismus der sekretorischen Verlust ist schlecht verstandene5,6. In dieser Umgebung einzigartig Verletzung erfordern Gewebe-Regeneration und Strahlenschutz-Strategien Speichel funktionale Bewertung. Experimentell, ist murine Speichel Sammlung ein besonders wertvolles Instrument bei der Bewertung der Drüse auf Strahlung und Therapeutika.

Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode für die Durchführung und Quantifizierung der stimulierten Speichels Sekretion mit Pilocarpin, eine potente muskarin Agonist-7. Pilocarpin stimuliert das vegetative Nervensystem Drüse Sekret8,9induzieren. Um diesen Test entsprechend abzuschließen, ist ein Tracheostoma erforderlich, um sicherzustellen, dass die Maus hält ein patent Atemwege während des Verfahrens und zur Reduzierung des Risikos von Würgen und Aspiration von gepoolten Sekret in der Mundhöhle10.

Dies ist ein terminal Verfahren, die ihren Höhepunkt bei der Entfernung von den drei großen Speicheldrüsen: die Parotis (PG), der mandibulären (SMG) und der Sublingual (SLG). Für funktionelle Studien Drüse Gewichte werden aufgezeichnet und werden oft verwendet, um Speichel Messung11,12,13zu normalisieren. Diese Daten sind besonders wichtig in Strahlung Studien, wobei Drüse Atrophie ein erwartetes Ergebnis14,15 ist

Gibt es Variabilität in der Literatur in Bezug auf wie stimuliert Sekretion von Speichel erfolgt und16berichtet. Z. B. Pilocarpin Dosen innerhalb der Literatur Span mindestens drei Größenordnungen17,18,19,20,21,22,23. Hier präsentieren wir Ihnen eine optimierte hochdosierte Pilocarpin-Protokoll mit der Absicht der verbesserte Reproduzierbarkeit Methodenausführung sowie eine modulare Plattform von Techniken (Tracheostoma, Speichel Sammlung und Drüse Dissektion), die als angepasst werden kann benötigt.

Wir gehören neben Protokoll Demo 2 Wochen nach fraktionierte Bestrahlung (4 Dosen von 6,85 Gy) für die SMG-Region repräsentative Funktionsdaten des Speichelflusses.

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Protokoll

Alle in-Vivo -Verfahren unten umrissen wurden vom Ausschuss für Tier-Ressourcen an der University of Rochester, Rochester University angenommen. NY.

1. Vorbereitung

  1. Wiegen Sie mit Hilfe einer Analysenwaage, 20 mg Pilocarpin. In 2 mL steriler Kochsalzlösung in einem Microcentrifuge Schlauch auflösen.
    Hinweis: Da Pilocarpin lichtempfindlich ist und Aktivität im Laufe der Zeit verliert, diese Lösung sollte am Tag der Injektion vorbereitet, und lichtgeschützt bis verabreicht.
  2. Mit Hilfe einer Analysenwaage, wiegen und alle Röhrchen und Glaskapillaren identifizieren. Die Anzahl der Röhrchen und Glaskapillaren sollte die Anzahl der Mäuse übereinstimmen.

(2) Tracheostoma

  1. Wiegen Sie C57/BL6 Mäuse mit einer Analysenwaage.
  2. Mit einer 0,5 mL Spritze mit 29 x ½" Nadel, Betäuben Sie Mäuse mit einem intraperitoneal injizierten steriler Kochsalzlösung von 100 mg/kg Ketamin und 10 mg/kg Xylazin. Fahren Sie mit dem folgenden Schritt fort, wenn die Maus reagiert nicht mehr auf Reize (z. B. Fehlen der Reflex-Pedal Rückzug), die in der Regel innerhalb von 5 bis 10 min nach der Injektion auftritt.
  3. Nach der Entnahme Schmiermittel auf einem Baumwolle-gespitzten Applikator, sanft gelten für Augen und platzieren Sie den Mauszeiger in Rückenlage auf der Bühne. Das narkotisierten Tier muss auf warme Oberfläche gehalten werden.
    Hinweis: Alle Schritte sind bei Raumtemperatur durchgeführt.
  4. Die Nase, Gliedmaßen und Rute auf die Bühne mit chirurgischen Klebeband zu sichern.
  5. Reinigen und den Hals mit einem Alkohol abwischen naß.
    Hinweis: Dies wird helfen, Fell in nachfolgenden Einschnitte zu verhindern.
  6. Anhebung der ventralen Mittellinie Halshaut mit einer Pinzette, machen Sie einen kleinen, oberflächlichen Schnitt mit sezierenden Schere. Führen Sie die Schere in die Öffnung, und öffnen Sie langsam die klingen subkutan, um Gewebe Flugzeuge zu trennen.
  7. Halten Sie die Haut angehoben, schneiden Sie vorsichtig bis 1 cm unterhalb der Mündung.
  8. Stellen Sie zwei seitliche Einschnitte die minderwertigen und überlegenen Aspekte des ersten Schnittes. Mit Pinzette, sanft spiegeln Sie entfernt die Haut, um Zugriff auf Kopf und Nacken Strukturen ermöglichen.
  9. Das sezierenden Mikroskop bei 8 X Vergrößerung, visualisieren die submandibulären Drüsen (Mittellinie: Abbildung 1).
  10. Mit feinen Pinzette, heben Sie vorsichtig die Drüsen, die die vier Infrahyoid (Gurt) Muskeln über die Luftröhre aussetzen. Vermeiden Sie reißen oder Störung der umliegenden Gefäßsystem oder absondernde Luftschachte.
  11. Wenn Speichel aus mehrere Mäuse sammeln, wiederholen Sie Schritte 2.1-2.10 mit jeder Maus bevor Sie fortfahren.
    Hinweis: Dieses Verfahren kann sicher auf bis zu 5 Mäuse gleichzeitig durchgeführt werden.
  12. Mit kleinen sezierenden Schere Entfernen des medialen Teils der Gurt Muskeln während Ihres Aufenthalts möglichst nahe an der Mittellinie wie möglich. Schneiden Sie nur so viel wie nötig zu visualisieren Luftröhre Gurt Muskeln aus dem Weg während des Verfahrens. Vermeiden Sie nicking keine nahe gelegenen Schiffe, denn wenn es Volumenmangel sekundär zu erheblichen Blutungen gibt, Pilocarpin nicht effektiv bei der Induktion der Sekretion.
  13. Der Gurt Muskeln Weg von der Luftröhre zu reflektieren.
  14. Visualisieren Sie den Kehlkopf, Luftröhre und Schilddrüse. Sicherstellen Sie, dass die Luftröhre klar ist der darüberliegende Gewebe.
  15. Nehmen Sie einen horizontalen Schnitt in der Luftröhre minderwertig/Posterior an der Schilddrüse mit kleinen sezierenden Schere. Sicherstellen Sie, dass die Atemwege Patent- und klare Flüssigkeit.

(3) Speichel Sammlung

  1. Entfernen Sie das Klebeband in der Nähe von Mund und Winkel Dissektion Stufe nach unten (45° cranially), mit Speichelfluss zu unterstützen.
  2. Führen Sie mit einer 0,5 mL Spritze mit 29 x ½" Nadel, intraperitoneale Injektion von 10 µL/g Körper Gewicht Pilocarpin für eine Gesamtdosis von 100 mg/kg.
  3. Einen Timer gestartet wird. Wenn mehrere Mäuse Dosierung, reduzieren Sie Vorbereitungs-und Anlaufzeit sich schnell zu bewegen und gleichzeitig die verbleibenden Mäuse zu injizieren Assistent.
  4. Öffnen Sie standard Pinzetten verwenden, den Mund für Kapillarrohr Zugang.
  5. Sobald eine Perle von Speichel im Mund beobachtet wird, legen Sie das proximale Ende der Kapillare in die Flüssigkeit mit dem distalen Ende in ein Sammelrohr unterhalb der sezierenden Bühne (beide Rohre vorher gewogen) gelegt.
    Hinweis: Bei weiblichen Mäusen C57/BL6 6-10 Wochen alt, tritt grobe Speichelfluss innerhalb von 2 min. von Pilocarpin-Injektion.
  6. Wenn Speichel im Mund bauen, aber nicht durch das Rohr fließt, Korrekturen Sie vorherigen Schritt. Stellen Sie sicher, dass das Rohr nicht direkt gegen eine Schleimhautoberfläche gesetzt, die den Einlass behindern können.
  7. Sammeln Sie Speichel für insgesamt 12 min nach Pilocarpin Stimulation. Stellen Sie sicher, dass das Stoma klar bleibt.
    Hinweis: Erhöhte Tidalvolumen und Sekret (Speichel, Urin, fäkale) sind während dieser Zeit normal.
  8. Wenn Mäuse Speichel Funktion gedrückt haben (zB., aufgrund einer Verletzung oder Intervention), die restliche Flüssigkeit aus dem Mund auf dem Sammelrohr mit einer Mikropipette P200 übertragen. Wenn mehrere Mäuse sammeln, sicherzustellen Sie, dass Tipps geändert werden.
  9. Nehmen Sie das Gewicht der gesammelten Speichel plus Rohre 12 min nach Pilocarpin Injektion.

(4) Drüse Dissektion

  1. Einschläfern Mäuse durch CO2 Euthanasie (wie beschrieben in den AVMA Richtlinien für Euthanasie von Tieren: die Ausgabe 2013) gefolgt von Thorakotomie, kümmert sich um die Strukturen des Kopfes und des Halses zu bewahren. Vermeiden Sie aus diesem Grund zervikale Dislokation als Methode der Euthanasie.
  2. Platzieren Sie den Mauszeiger in Rückenlage auf der Bühne. Positionieren Sie Drüsen am ursprünglichen Standort in der Luftröhre (Abbildung 1).
  3. Mit einem sezierenden Mikroskop unter 8 X Vergrößerung, visualisieren die großen Drüsen: die PG, SMG und SLG. Um die Drüsen während der Präparation zu unterscheiden, erkennen Sie, dass das PG diffuse, liegt lateral der SMG und SLG.
    Hinweis: Wenn die PG sezieren, sollte dies zuerst erfolgen, da ist der zuletzt definierte und höchstwahrscheinlich abgerissen werden.
  4. Das Heck des PG mit der Pinzette, ziehen es weg von zugrunde liegenden Strukturen zu erfassen und Spannung vor dem Schnitt den Kopf des PG mit präparierscheren sanft auftragen.
  5. Verletzung der Kapsel umgibt die SMGs mit Pinzette. Vorsichtig Trennen der linken und rechten SMG.
  6. Kostenlos des dorsalen Aspekt des SMG aus eingehalten nonglandular Gewebe mit Pinzette.
  7. Entfernen Sie die SMG vom Hals, indem Wharton Kanal straff mit der Pinzette zeichnen und schneiden das Rohr mit präparierscheren.
  8. Trennen Sie vorsichtig die SLG von der SMG mit Pinzette.
    Hinweis: Die SLG ist in der Superolateral Aspekt der SMG.
  9. Verwendung eines analytischen Waage, SMG Gewichte aufnehmen.

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Ergebnisse

Wenn Speichel Sammlung durchführen hochdosierte Pilocarpin stimuliert werden, ist es wichtig, die Atemwege um Aspiration zu vermeiden oder würgen von Sekret in der Mundhöhle. Eine schematische Darstellung des das Tracheostoma ist (Abbildung 1) zur Verfügung gestellt. Nach trachealen Schnitt muss das Stoma Gewebe und Flüssigkeiten frei bleiben.

Zur Verbesserung der Kapillarwirkung im Speichel Sammlun...

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Diskussion

Wir präsentieren Ihnen eine mehrstufige Methode zur Speicheldrüse Funktion bewerten die Drüse Verletzungen und Therapeutika studieren angewendet werden können. Unsere Verfahren beinhaltet Tracheostoma, Speichel Sammlung und Drüse Dissektion, von denen jede experimentelle Anwendungen hat, die ein integriertes Studium der Speicheldrüse Biologie unterstützen kann. Beispielsweise hat murinen Tracheostoma für allgemeine Atemwegsmanagement bei Eingriffen, die Behinderung der Mundhöhle verwendet worden.

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Forschung berichtet in dieser Publikation wurde durch das nationale Institut des Dental und Craniofacial Forschung (NIDCR) und das National Cancer Institute (NCI) der National Institutes of Health Award Anzahl R56 DE025098, UG3 DE027695 und F30 CA206296 unterstützt. Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health. Diese Arbeit wurde auch von der NSF-DMR-1206219 und der IADR-Innovation in Oral Care Award (2016) unterstützt.

Wir möchten Dr. Eri Maruyama und Andrew Hollomon danken für ihre Unterstützung mit Speichel-Kollektion. Wir möchten Pei-Lun Weng danken für Unterstützung mit Drüse Dissektion. Wir möchten danken Matthew Ingalls für seine Unterstützung bei der Vorbereitung der Figur. Wir möchten Dr. Elaine Smolock und Emily Wu für kritische Lektüre des Manuskripts danken.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Pilocarpin HydrochloridSigma AldrichP6503Pilocarpin
Student Vannas FederschereFine Science Tools91500-9Federschere für Tracheostomie
Sterile KochsalzlösungMedlineRDI30296HKochsalzlösung
Dumont #7 PinzetteFine Science Tools11274-20Gebogene Pinzette
Dumont #5 PinzetteFine Science Tools11251-10Gerade Pinzette
mit StandardmusterFine Science Tools11000-12Stumpfe Pinzette
Feine Schere - WolframkarbidFine Science Tools14568-09Sezierschere
Mikrohämatokrit Heparinisierte KapillarrohreFisher Scientific22362566Kapillarrohre
Gleitmittel AugensalbeAktualisierenN/AAktualisieren Lacri-Lube
Ziege polyklonales Anti-Nkcc1Santa Cruz BiotechSC-21545Nkcc1 Antikörper
DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindole, Dihydrochlorid)Thermo Fisher ScientificD1306DAPI
GraphPad Prism GraphPadver6.0Statistische Software
Applikator mit WattespitzeMedlineMDS202000Applikator für Augensalbe
0,5cc Insulinspritze, 29G x 1/2"BD7629Spritze für die intraperitoneale Injektion

Referenzen

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