Ein Modell der aufgespaltenen Dünndarmschlinge in Kostenlose Hühner narkotisierten spezifischen Erreger Clostridium Perfringens Virulenz zu studieren

Summary

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um chirurgisch "Darm aufgespaltenen Loops" Huhn Dünndarm schaffen. Dieses Verfahren ermöglicht den Vergleich von mehreren Clostridium Perfringens Stämmen Virulenz in Situ in einem einzelnen Host. Diese Methode verringert deutlich die Anzahl der Hühner in der Regel für ähnliche in Vivo Experimente notwendig.

Abstract

Nekrotische Enteritis wurde bei Hühnern, die mit verschiedenen in Vivo Infektionsmodelle untersucht. Die meisten davon verwenden eine Kombination der prädisponierenden Faktoren wie Kokzidiose und Ernährung, mit Magensonde oder Verabreichung über das Futter mit Clostridium Perfringens. In diesen Modellen erfordert der Vergleich mehrerer C. Perfringens Belastungen für Virulenz Studien eine große Anzahl von Hosts, signifikante Ergebnisse zu erhalten. Sterblichkeit im Verlauf der Studie kann je nach experimentellen Modell, daher ethische Bedenken bezüglich Tierschutz in der Forschung hoch sein. Die Entwicklung der neuen Infektionsmodelle erfordern weniger Tiere, Pathogenese, noch eine statistisch signifikante und gültige Ergebnisse zu studieren ist wichtig bei der Verringerung der Tierversuche in der Forschung. Aufgespaltenen Dünndarmschlinge Modelle wurden verwendet, um eine Infektionen in verschiedenen Arten wie Mäuse, Kaninchen und Kälber zu studieren. Nach chirurgischen Eingriffen, aufgespaltenen Schleife Segmente zu erstellen sind C. Perfringens Stämmen direkt in die Schlaufen herstellen einen engen Kontakt zwischen den Bakterien und die Darmschleimhaut injiziert. Proben der Dünndarm und der luminalen Inhalte sind bei Beendigung der Verfahren nach ein paar Stunden genommen. In jedem Tier, damit die Verringerung der Anzahl der erforderlichen Themen in den Experimenten können mehrere Bakterienstämme inokuliert werden. Auch sind Eingriffe unter Vollnarkose, Tieren Schmerzen zu reduzieren. Bei Hühnern wäre dieses Modell besser geeignet als orale Verabreichung, C. Perfringens Belastungen Pathogenität zu vergleichen, weil weniger Tiere erforderlich sind, keine prädisponierenden Faktoren erforderlich sind, um die Krankheit zu induzieren und Schmerz durch Analgetika gesteuert wird . Die aufgespaltenen Dünndarmschlinge Modell ist schlecht beschrieben bei Hühnern und Standardisierung ist wichtig für die optimale Nutzung. Diese Handschrift enthält die notwendigen Schritte um zahlreiche Darm aufgespaltenen Schleifen bei Hühnern zu erstellen und bringt Informationen über die kritischen Punkte um valide Ergebnisse zu erhalten.

Introduction

Die Verwendung von Tiermodellen, ansteckende Krankheiten, die Auswirkungen auf Mensch und Tier zu studieren ist ein zentrales Instrument bei der Beurteilung der Virulenzfaktoren Regulierung der Pathogenese einer bestimmten Bedingung sowie, erarbeiten Strategien zur Vorbeugung und Behandlung von Krankheiten¹. Trotz der zahlreichen Vorteile der Verwendung von Tiermodellen um zu verschiedenen Krankheiten zu studieren entstehen ethische Bedenken in Bezug auf diese Praxis. Forscher müssen Verwendung von Tieren bei der Erlangung relevanter und gültige Ergebnisse zu minimieren. Das Konzept der 3 Rs Grundsätze (Replace, Reduce und verfeinern) wurde erarbeitet, um sicherzustellen, dass Tierschutz in solchen Studien behandelt wurden. In Huhn nekrotische Enteritis Studien sind in Vivo Huhn Modelle zur Ätiologie, Verhütung und Behandlung von diesem Zustand^2,3,4,5zu untersuchen. Pathogene Stämme von C. Perfringens tragen spezielle Virulenzfaktoren, wie z. B. der NetB Toxin⁶, werden verabreicht, um nekrotische Enteritis in Hühner⁷verursachen. Das Ersatz-Prinzip ist daher schwierig, in einem solchen Fall zu erreichen, da diese Virulenzfaktoren möglicherweise nicht so kritisch bei anderen Tierarten. Die meisten Modelle für nekrotische Enteritis bei Hühnern verwenden eine Kombination von Risikofaktoren wie Kokzidiose und veränderte Ernährung zu induzieren nekrotische Enteritis, gefolgt von Magensonde bouillonkultur mit einer großen Anzahl von C. Perfringens². Diese Modelle werden die Krankheit in eine große Anzahl von Hühnern induzieren und Sterblichkeit kann in solchen Studien⁸, so Bedenken über die Reduzierung und Raffinesse Prinzipien in Tierversuchen wichtig sein.

Intestinale aufgespaltenen Schleifen Modelle sind eine wünschenswerte Alternative für das Studium der Krankheiten ausgelöst durch Darm Krankheitserreger in Bezug auf die Reduzierung der Grundsatz und Raffinesse. In diesen Modellen entstehen indem man Ligaturen, entlang den Darm-Trakt, unabhängige und hermetische Fächer zu bilden, wo Krankheitserreger allein⁹ injiziert werden können, oder mit anderen Molekülen, wie z. B. Impfstoffkandidaten Darm Segmente, so genannte "Loops" ^{10 , 11}. die Erreger von Interesse stehen in engem Kontakt mit der Darmzellen und nach ein paar Stunden hinweg Infektion, intestinale Proben zur weiteren Analyse gewonnen werden können. Dies ermöglicht die Verwendung von mehreren Behandlungs- und Kontrollgruppen im selben Tier. Statistische Analyse kann mit Messwiederholungen Modelle, die die Kraft der Unterscheidung zwischen Gruppen erhöht und reduziert die Anzahl der notwendigen Hühner im Vergleich zu oralen Magensonde Studien durchgeführt werden. Darüber hinaus sind chirurgische Eingriffe und anschließende Infekt-Zeiten unter kontinuierlicher allgemeine Anästhesie und Analgesie, damit den Tieren Schmerzen zu minimieren durchgeführt. Closed-Loop-grundsätzlich sind eine ideale Vorlage zur Verringerung der Host-Nummern und eine menschlichere System in Tierversuchen zu schaffen.

Intestinale aufgespaltenen Schleifen Modelle sind gut beschrieben in verschiedenen Arten, wie Kälber, Hasen und Mäuse^2,9, aber schlecht in Hühner⁷beschrieben. Für eine optimale Nutzung dieses chirurgische Modells sind richtige Technik und Ausführung Voraussetzung für die Schaffung der aufgespaltenen Darm Schleifen zur Vermeidung von Schäden für die intestinale Integrität. Das Ziel dieser Handschrift ist eine Schritt-für-Schritt-Methode bei der Schaffung von mehreren Darm Schleifen in einem Huhn-Modell zu beschreiben. Diese Technik ist durch Geschick und Erfahrung des Operateurs begrenzt, da genaue Verfahren essentiell für den Erfolg des Projekts sind.

Protocol

Alle Verfahren mit live Tiernutzung wurden autorisiert durch die Ethikkommission der Faculty of Veterinary Medicine, Université de Montréal (CÉUA, 'Comité d' Éthique de Runden des Animaux ").

1. Überlegungen vor der Operation

1. Wählen Sie 10 Wochen alt spezifischen Erreger freie (SPF) Leghorn Hühnern für die Chirurgie.
   Hinweis: ihr Gewicht muss zwischen 1,0 und 1,2 kg liegen.
2. Zurückziehen des Feeds 12 h vor dem Verfahren, den Darm zu entleeren.
3. Legen Sie vor der Operation die Hühner unter Vollnarkose nach einem Protokoll von einem Anästhesisten überprüft. Premedicate jedes Huhn 15 min vor der Operation mit einer intramuskulären Injektion (IM) Midazolam 1 mg/kg und Butorphanol 4 mg/kg. Wiederholen, alle 4 h die Injektion von Butorphanol 4 mg/kg IM oder die Atmung Muster Änderungen und Frequenz steigt, während der Narkose. Für die Vollnarkose während alle Verfahren zu verwalten Isofluran in einer Konzentration zwischen 1,5 und 2,5 % mit einer intratrachealen Rohr.
   Hinweis: Die Verwendung von Prämedikation für Sedierung und Analgesie wird empfohlen, da sie werden erheblich verbessern die Tiefe der Narkose, reduzieren Sie die Menge der Anästhesie notwendig bei allen Eingriffen, sowie erlauben es, Schmerzen zu kontrollieren.
4. Überwachen Sie die Narkose durch die Erfassung der Körpertemperatur, Herzfrequenz und Elektrokardiogramm (EKG), respiratory Rate und Rhythmus, Sauerstoff-Sättigung, abgelaufene Kohlendioxid (CO₂) und neurologische Reflexe.
   Hinweis: Eine Person muss zugewiesen werden, um diese Parameter über alle Verfahren zu überwachen.
5. Grundsätzen der Sterilität im gesamten chirurgischen Eingriffen. Stellen Sie sicher, dass der Chirurg und der Chirurg mit sterilen Kittel, Handschuhe, Maske Kleid und Schutzbrille nach institutionellen präoperative Protokolle. Stellen Sie sicher, dass der Chirurg die Hände mit einer Chlorhexidin Gluconat imprägniert sterile Bürste bis zum Ellenbogen mit Schwerpunkt auf Fingernägel und jeder Finger Oberfläche scheuert.
6. Sterilisieren Sie die chirurgischen Instrumente mit einem Sterilisator.

2. chirurgische Baustellenvorbereitung

1. Erstens, manuell zu entfernen die Federn aus dem Bauch mit einem sanften Traktion.
2. Schrubben Sie der Operationsstelle mit einer Chlorhexidin Gluconat Waschmittel imprägnierten sterile Bürste. Schrubben Sie vorsichtig die Haut von der Mitte nach außen für eine totale Kontaktzeit von 5 min ohne zurück in die Mitte zu kommen.
3. Durchführen Sie 3 alternative Passagen an der Operationsstelle Chlorhexidin Gluconat Lösung mit Isopropyl-Alkohol mit sterile Gazen.
   Hinweis: Die Passage muss aus der Mitte der Operationsstelle bis an die Grenzen zur Vermeidung von Kontaminationen aus den Bereichen nicht desinfiziert an der Operationsstelle beginnen.
4. Legen Sie die sterile op-Tuch, auf das Huhn.

3. Gewinnung des Dünndarms aus der Bauchhöhle

1. Einschneiden Sie den chirurgischen Faltenwurf mit der Schere, nur die Haut an der Operationsstelle verfügbar zu machen.
2. Einschneiden der Haut durch ein '' L'' Form Low-Mittellinie Schnitt mit einem Skalpellklinge #3 ausführen.
   1. Den erste Schnitt 1 cm auf dem Brustbein kaudalen und Ankunftsflughäfen Sie es 1 cm kranial an der Kloake.
   2. Den zweite Schnitt senkrecht zur ersten Schnitt ausführen. Ab der kaudalen Ende des ersten Schnittes und 5 cm auf der linken Seite des Bauches durch das Becken Linie weiter.
      Hinweis: Diese Öffnung schafft eine Klappe, die es eine einfachere Extraktion des Darms ermöglichen.
3. Mit Chirurgie schneiden Schere, Sie das Peritoneum und Bauchmuskeln mit dem gleichen '' L'' Form Muster, die Bauchhöhle zu öffnen.
   Hinweis: Dadurch werden die Lungenbläschen sichtbar. Darm befinden sich unterhalb dieser Strukturen. Luftsäcke muss mit Gazen gesättigt mit steriler Kochsalzlösung 0,85 % zur Vermeidung von Austrocknung und möglichen Bruch während des Verfahrens befeuchtet werden.
4. Einfügen, die eine lange Nase zu kastrieren Haken in die Bauchhöhle durch Anschluss an der linken Bauchwand und arbeiten rund um den Bauch Luftsäcke.
5. Sanft exteriorize den Darm und verteilt diese auf das Operationsfeld.
   Hinweis: Bewahren Sie Darm befeuchtet durch sterile Kochsalzlösung 0,9 % während des Verfahrens häufig sprühen. Gazen mit steriler Kochsalzlösung befeuchtet können auch auf den Darm um Austrocknung zu vermeiden platziert werden.
6. Schnappen Sie sich den Darm mit einem trockenen steriler Gaze und vorsichtig herausziehen den Dünndarm durch manuelle Traktion, das Jejunum verfügbar zu machen.
   Hinweis: Mesenterialen Gefäße sind zerbrechlich und übermäßige Spannung können sie die zu Darm ischämischen Läsionen führen und erheblich beeinträchtigen das Ergebnis des Verfahrens kann platzen.

4. Herstellung von intestinalen Schleifen

1. Erstellung von Schleife Nr. 1.
   1. Legen Sie eine einfache Ligatur mit einem Polyglactin Multifil synthetische resorbierbare Material in den proximalen Jejunum durch die Vermeidung der Ligatur der großen mesenterialen Gefäße.
   2. Statt einer distalen Ligatur 2 cm weg von der proximalen Ligatur.
      Hinweis: Einfache Ligaturen, die mit Multifil Nahtmaterial befinden sich entlang den Darm-Trakt, hermetische Segmente zu erstellen. Ein Schema (Abbildung 1) beschreibt die Position des alle Ligaturen. Die Loops bestehen aus einem proximalen und distalen Ligatur durch 2 cm getrennt.
2. Erstellung von Interloop Nr. 1.
   1. Legen Sie eine einfache Ligatur 0,5 cm aborally an der distalen Ligatur der Schleife Nr. 1.
      Hinweis: Zwischen aufeinanderfolgenden Schleifen gibt es Interloops von 1 cm, d.h. Segmente, so dass eine räumliche Trennung zwischen den Schleifen. Um das mögliche Risiko einer Kreuzkontamination von einer Schleife in eine andere Wahrscheinlichkeit zu verringern, ist eine einfache Ligatur in der Mitte der Interloop (0,5 cm von der proximalen und distalen Ligatur von 2 benachbarten Schleifen) platziert. Dies reduziert das Risiko einer möglichen durchgesickerten Kontaminanten aus einer Schleife, die Ligatur einer angrenzenden Schleife zu erreichen. Diese Segmente sind nicht obligatorisch, aber verringert sich das Risiko einer Kreuzkontamination.
3. Erstellung von nachfolgenden Schleifen und Interloops.
   1. Wiederholen Sie die Schritte 4.1 und 4.2, die Anzahl der gewünschten Schleifen zu erhalten.
      Hinweis: In diesem Experiment wurden 9 Loops und 8 Interloops erstellt. Gesamtlänge betrug 26 cm. Die Anzahl der Schleifen kann je nach Studie eingestellt werden.

5. Injektion von Clostridium Perfringens Stämmen in the Loops

1. Spritzen Sie mit eine sterile Spritze und Nadel 26 G des Erregers in Schleife Nr. 1. Sanft legen Sie die Nadel auf der antimesenteric Seite des Darms in einem Winkel von 45°.
   Hinweis: In diesem Experiment wurde 0,2 mL Gehirn Herz Infusion (BHI) mit 1 x 10⁶ KBE (Kolonie bildende Einheiten) von C. Perfringens in der Mitte des Log Wachstumsphase in jedem Schleifendurchlauf injiziert. 5 verschiedene Stämme wurden in 5 verschiedenen Schleifen injiziert und die 4 verbleibenden Loops wurden mit eine Negativkontrolle enthält keine Bakterien (sterile BHI), abwechselnd Krankheitserreger und sterile BHI Schleifen injiziert.
2. Wiederholen Sie Schritt 5.1 alle Schleifen zu injizieren.
3. Ersetzen Sie sanft den Darm-Trakt im dorsalen Bereich der Bauchhöhle unterhalb der Luftsäcke.

6. Abschluss der Bauchhöhle

1. Die Naht des Peritoneums und Bauchmuskeln.
   1. Naht das Peritoneum und Bauchmuskeln entlang des Beckens (hergestellt in Schritt 3.3) mit einem einfachen kontinuierliche Naht Muster mit einem Polyglactin Multifil synthetische resorbierbare Material.
   2. Naht das Peritoneum und Bauchmuskeln aus dem Brustbein, der Kloake (hergestellt in Schritt 3.3. mit einem einfachen kontinuierliche Naht Muster mit einem Polyglactin Multifil synthetische resorbierbare Material.
2. Die Naht der Haut.
   1. Schließen Sie mit einem Polyglactin Multifil synthetischen Material und eine einfache kontinuierliche Naht Muster, den Schnitt der Haut entlang des Beckens im Schritt 3.2 gemacht.
   2. Mit dem gleichen Multifil Ligatur-Material und eine einfache kontinuierliche Naht Muster, schließen Sie die Inzision der Haut aus dem Brustbein, der Kloake in Schritt 3.2 gemacht.

7. Abschluss

1. Halten Sie nach chirurgischen Eingriffen das Huhn unter Vollnarkose mit richtigen Gebrauch von Analgetika, Tieren Schmerzen während der Zeit der Infektion zu minimieren. Weiterhin Narkose überwachen um eine ausreichende Anästhesie zu gewährleisten.
2. Nach dem gewünschten Infektion Mal Human einzuschläfern Sie das Huhn durch zervikale Dislokation unter Vollnarkose.
   Hinweis: Für diese Verfahren wurde die erforderliche Zeit, mikroskopische Läsionen mit C. Perfringens pathogenen Stämmen zu induzieren 7 h.
3. Geschnitten Sie mit einem Skalpellklinge #3 0,5 cm auf 1 cm langen Loop Sektion und in 10 % Formalin zur Fixierung über Nacht und weitere histopathologische Analyse.
4. Schneiden Sie mit der gleichen Skalpellklinge die restlichen Loop Sektion und legen Sie sie in einen sterilen Microcentrifuge Schlauch für die Isolierung von C. Perfringens Stämmen in jeder Schleife weiter bakteriologischen Analyse für ihre genetische Charakterisierung.
5. Wiederholen Sie die Schritte 7.2 und 7.3 für alle Schleifen durch eine Änderung der Skalpellklinge zwischen jeder Schleife.

Results

Abbildung 1zeigt eine schematische Darstellung der 9 Darm Loops und 8 Interloops. In diesem Modell werden insgesamt 9 Schleifen und 8 Interloops mit einfachen Ligaturen erstellt. Eine Schleife besteht aus proximalen und distalen Ligaturen Abstand von 2 cm, gemessen von der proximalen Ligatur. Zwei benachbarte Schleifen werden durch eine Interloop von 1 cm getrennt. Um das mögliche Risiko einer Kreuzkontamination zwischen Schleifen durch Leckage aus einer Liga...

Discussion

Intestinale Schleifen Modelle wurden in zahlreichen Arten, Wirt-Pathogen Interaktionen und Pathogenese von Krankheiten, die durch verschiedene Darm Krankheitserreger, wie , Clostridium Perfringensund Clostridium Difficile zu studieren beschrieben Salmonella Enterica^7,9,13,14,15. Es wurde auch verwendet, der mukosalen Immunantwort

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
EZ-Scrub 747	Becton Dickinson and Company		4% Chlorhexidingluconat, mit Reinigungsmittel imprägnierte sterile Bürste. Keine Katalognummer verfügbar. Webadresse: https://www.bd.com/en-us/offerings/capabilities/infection-prevention/surgical-hand-scrubs/ez-scrub-preoperative-surgical-scrub-brushes
Isopropylalkohol 70% USP 4 L	Handelsüblicher Isopropylalkohol	P016IP70	Webadresse: http://www.comalc.com/products/
Chlorexidin	Sigma-Aldrich	282227-1G	Chlorhexidingluconatlösung, muss auf 4% verdünnt werden. Webadresse: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/282227?lang=fr®ion=CA&gclid=EAIaIQ obChMI8vHr4_OY1wIV3rrACh2Z WQKuEAAYAiAAEgLKx_D_BwE
Chirurgisches Abdecktuch klein (27 Zoll x 24 Zoll) mit 3 x 6 Zoll Fenster	Veterinärmedizinische Spezialprodukte	32724	Webadresse: http://www.vetspecialtyproducts.com/index.cfm?fuseaction=ecommercecatalog. detail&productgroup_id=15
Skalpellklingen #3	Swann-Morton	301	Webadresse: https://www.swann-morton.com/product/16.php
Sterile Kochsalzlösung NaCl 0,9%	Sigma-Aldrich	S8776-100ML	Webadresse: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s8776?lang=fr®ion=CA
Vicryl 3-0	Ethicon	D9003	Polyglactin Multifilament resorbierbares Nahtmaterial. Webadresse: http://www.ethicon.com/healthcare-professionals/products/wound-closure/absorbable-sutures/coated-vicryl-polyglactin-910-suture
Spritze 1 ml mit 26G Nadel	Becton Dickinson and Company	329652	Webadresse: https://www.bd.com/en-us/offerings/capabilities/diabetes-care/insulin-syringes/bd-1-ml-conventional-insulin-syringes
Brain Heart Infusion	Sigma-Aldrich	1104930500	Webadresse: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/mm/110493?lang=fr®ion=CA&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xorders-_-prodRecCold2-1
Eppendorf Röhrchen	Sigma-Aldrich	T9661-500EA	Mikrozentrifugenröhrchen. Webadresse: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t9661?lang=fr®ion=CA&gclid=EAIaIQ obChMI-YizzfiY1wIVRkCGCh 30SQjuEAAYAiAAEgLK5fD_BwE
Formalinlösung, gepuffert neutral, 10%	Sigma-Aldrich	HT501128-4L	Verhältnis Gewebe : Formalin von 1: 10 für eine adäquate Fixierung. Webadresse: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/ht501128?lang=fr®ion=CA
Clostridium perfringens stämme	Université de Montré al, Chaire en recherche avicole	N/A	Spezifisch für jedes Labor, erhältlich auf Anfrage an den entsprechenden Autor