Integration von Imaging Durchflusszytometrie und transkriptomischen Profilierung zu veränderten Endocytic CD1d Handel bewerten

Summary

Durchflusszytometrie Imaging bietet einen idealen Ansatz um die morphologische und funktionelle Veränderung der Zellen auf individuelle und populational Ebene zu erkennen. Gestörten endocytic Funktion für Lipid Antigenpräsentation in Schadstoff-exponierten menschlichen dendritischen Zellen wurde mit einem kombinierten transkriptomischen Profilierung der Genexpression und morphologischen Demonstration des Handels mit Protein nachgewiesen.

Abstract

Populational Analysen der morphologischen und funktionellen Veränderung der endocytic Proteine sind aufgrund der Nachfrage der Bilderfassung in einer Einzelzelle Ebene und statistische Bildanalyse auf einem populational Niveau anspruchsvoll. Um diese Schwierigkeit zu überwinden, zum wir bildgebende Durchflusszytometrie und transkriptomischen profiling (RNA-Seq) veränderten subzelluläre Lokalisation des Clusters Differenzierung 1D Protein (CD1d) verbundenen bestimmen mit eingeschränkter endocytic Genexpression in menschlichen Dendritische Zellen (DCs), die die gemeinsame lipophilen ausgesetzt wurden Luft Schadstoff Benzo [a] pyren. Die NS1 CD1d und endocytic Marker Lamp1-Proteine aus Tausenden von Zelle Bilder mit imaging-Durchflusszytometrie wurde mit Ideen und ImageJ-Fidschi analysiert Programme. Zahlreiche zelluläre Bilder mit Co gefärbten CD1d und Lamp1 Proteine wurden nach Anspritzung auf CD1d visualisiert⁺Lamp1⁺ DCs mit Ideen. Die verbesserte CD1d und Lamp1 NS1 auf BaP Exposition weiter demonstriert wurde, mit thresholded Scatterplots, getestet mit Mander des Koeffizienten für Co lokalisierte Intensität und geplottet basierend auf dem Prozentsatz von Co lokalisierten Bereichen mit ImageJ-Fidschi. Unsere Daten bieten einen vorteilhaften Instrumental- und bioinformatische Ansatz zur Messung von Protein NS1 auf Einzel- und populational zellulären Ebenen beeinträchtigtes funktionelle Ergebnis transkriptomischen Änderung in Schadstoff-exponierten Menschen unterstützen DCs.

Introduction

Antigenpräsentation umfasst in der Regel intrazelluläre Protein Menschenhandel, die oft mit Morphologische Charakterisierung und phänotypischen Profilierung der antigenpräsentierende Zellen^{1,2,3 untersucht wurden} . Um die Vorteile der Bildgebung und Phänotypisierung Methoden zu integrieren, beschreiben wir eine bildgebende Analyseplattform auf Einzelzelle und Einwohnerzahlen zu einem veränderten Protein NS1 in menschlichen dendritischen Zellen (DCs) zeigen. Im Peptid Antigenpräsentation große Histocompatibility complex (MHC) Klasse I Moleküle binden eine kurze Peptid (8-10 Rü....

Protocol

Menschlichen Protokolle in dieser Studie wurden von der Institutional Review Board von der University of Cincinnati genehmigt und alle Methoden wurden gemäß den einschlägigen Richtlinien und Verordnungen durchgeführt. Die Hoxworth Blutzentrale am Medical Center University of Cincinnati wurden Blutproben von gesunden Spendern entnommen.

1. transkriptomischen Profilierung der Schadstoff ausgesetzt menschliche Monocyte abgeleitet DCs

1. Insgesamt RNA-Extraktion von BaP-exponierten DCs
   1. Menschlichen DCs mit Zytokinen GM-CSF und IL-4 zu unterscheiden, und DCs, BaP für 4 Tage¹³setzen.
   2. BaP-exponiert....

Results

Die lipophile Schadstoff BaP verändert endocytic gen-Cluster in menschlichen DCs. Human Monocyte abgeleitet DCs von jedem Spender (n = 3) wurden mit BaP inkubiert und sortiert für konventionelle DCs, die weiter für RNA-Extraktion und transkriptomischen Analyse wie beschrieben verwendet wurden . Nach der Normalisierung der Genexpression wurden veränderte Gene zwischen BaP-exponierten und nicht-exponierten Gruppen entsprechend der funktionalen Zusammenhang differentiell exprimierten Gene gr.......

Discussion

Funktionale Bestätigung über eine veränderte Gen Weg ist anspruchsvoll, wegen der stark belasteten Genexpression, an denen mehrere Wege und die Schwierigkeit, individuelle und populational Zellaktivitäten zu integrieren. Wir beschäftigten bildgebenden Durchflusszytometrie, speziell Test CD1d Handel in endocytic Fächern. Imaging Durchflusszytometrie integriert die populational Messung der Zellen und die individuelle Demonstration der subzellulären NS1 mehrere Proteine. Konfokale Mikroskopie hat zuvor hohen Auflösung bei d.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Transkriptomik	Illumina	HiSeq 2500 v4	Illumina HiSeq-System
ImagingStream X	Millipore	100220	Bildgebende Durchflusszytometrie
mirVana miRNA-Isolationskit	Thermo Fisher		Gesamt-RNA-Extraktion
Agilent RNA 6000 Pico Kit	Agilent		Gesamt-RNA QC-Analyse
Veriti 96-Well Schnell-Thermocycler	Thermo Fisher		PCR, Enzymreaktion
NEBNext Poly(A) mRNA Magnetisches Isolationsmodul	New England Biolab		PolyA RNA-Aufreinigung
Automatisiertes SMARTer Apollo-System	Takara		PolyA RNA-Aufreinigung
NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit für Illumina	New England Biolab		Bibliotheksvorbereitung
Agencourt AMPure XP magnetische Beads	Beckman Coulter		DNA-Aufreinigung
2100 Bioanalyzer	Agilent		Library QC, Größenverteilungsanalyse
Agilent High Sensitivity DNA Kit	Agilent		Library QC, Größenverteilungsanalyse
QuantStudio 5 Real-Time PCR System (Thermo Fisher)	Thermo Fisher		Library Quantifizierung
NEBNext Library Quant Kit	New England Biolab		Library Quantifizierung
cBot	Illumina		Library Cluster-Generierung
TruSeq SR Cluster Kit v3 - cBot – HS	Illumina		Library Cluster-Generation
HiSeq 1000	Illumina		Sequencing
TruSeq SBS Kit v3 - HS (50-Zyklen)	Illumina		Sequenzierung
Phycoerythrin/Cyanin 7 (PE/Cy7)	Bio Legend	L243
Phycoerythrin/Cyanin 5 (PE/Cy5)	Bio Legend	3.9
Brilliant violet 421	Bio Legend	L161
PE-Anti-Maus IgG2b	Bio Legend	51.1
Alexa Fluor 647 (AF647)	Bio Legend	CD107a(H4A3)