Bewertung der Exon-Aufnahme durch induzierte Splice Switching Antisense Oligonukleotide in SMA Patienten Fibroblasten

Zusammenfassung

Verschiedenen antisense Oligonukleotide (AONs) haben gezeigt, zu induzieren Exon Aufnahme (Spleiß-Modulation) und SMN Ausdruck für Spinale Muskelatrophie (SMA) zu retten. Hier beschreiben wir ein Protokoll für AON Lipotransfection, Exon Aufnahme in das SMN2 -gen und die Bewertungsmethoden zu ermitteln, die Wirksamkeit bei SMA Patienten Fibroblasten zu induzieren.

Zusammenfassung

Spinaler Muskelatrophie (SMA), eine tödliche neurologische Erkrankung, verursacht durch den Verlust des SMN1, präsentiert einen einmaligen Fall in das Feld der antisense-Oligonukleotid (AON)-Therapie vermittelt. Während SMN1 Mutationen für die Krankheit verantwortlich sind, AONs targeting intronischen Spleißstellen Schalldämpfer (ISS) in SMN2, einschließlich der FDA-zugelassene Nusinersen haben gezeigt, dass Wiederherstellung SMN Ausdruck und die Symptome zu lindern. Derzeit konzentrieren sich viele Studien mit AON-Therapie für SMA auf neuartige AON Chemikalien SMN2 , die effektiver und weniger toxisch als Nusinersen möglicherweise gezielt zu untersuchen. Hier beschreiben wir ein Protokoll für in-vitro- Bewertung der Exon-Aufnahme mit Lipotransfection von AONs gefolgt von reverse Transkription Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR), quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) und westliche Beflecken. Diese Methode kann für verschiedene Arten von AON Chemikalien eingesetzt werden. Mit dieser Methode, wir zeigen, dass AONs bestehend aus abwechselnd gesperrt Nukleinsäuren (LNAs) und DNA-Nukleotide (LNA/DNA-Mixmers) zu effizienten SMN2 Exon Aufnahme und Wiederherstellung des SMN-Protein zu einem sehr niedrigen Konzentration und daher LNA führen / DNA-Mixmer-basierte antisense Oligonukleotide möglicherweise eine attraktive therapeutische Strategie, Spleißen Defekte, die durch genetische Krankheiten zu behandeln. Die in-vitro- Bewertung hier beschriebene Methode ist schnell, einfach und empfindlich genug für die Prüfung von verschiedenen neuartigen AONs.

Einleitung

Spinaler Muskelatrophie (SMA) ist eine tödliche neuromuskuläre Erkrankung in einem autosomal rezessive Muster vererbt. Es zeichnet sich durch den Abbau von Motoneuronen und progressive Stamm und Gliedmaßen Muskel Paralyse^1,2. Die Mehrheit der SMA Vorkommen sind eine homozygote Mutation im Survival Motor Neuron 1 (SMN1) gen³. Das Überleben der Motor Neuron 2 (SMN2) Gen ist eine inverse Duplikat des SMN1und hat eine fast identische Sequenz unterscheiden sich durch nur fünf Basen^4,5. Ein....

Protokoll

(1) Zellkultur

1. Kultur-SMA Patienten Fibroblasten in das Wachstumsmedium (Dulbeccos modifiziert Eagle mittlere 1:1-12 (Ham) mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) und 0,5 % Penicillin/Streptomycin) in eine CO₂ Inkubator bei 37 ° C.
2. Zellkonzentration mit einem automatisierten Zelle Zähler zu bestimmen und zu 1 x 10⁵ Zellen/mL im Wachstumsmedium, dann Samen auf die entsprechende Platte Zellen verdünnen. Verwenden Sie 12-Well-Platten (1 mL pro Well) für RT-PCR oder qPCR.
3. Inkubieren Sie die Platten für 24 h in einem CO₂ Inkubator bei 37 ° c

(2) LNA/DNA Mixmer Transfektion

Ergebnisse

Mit SMA Patienten Fibroblasten, gezielte wir die ISS-N1-Schalldämpfer-Region im Intron 7 des SMN2 Gens mit acht verschiedenen antisense LNA/DNA Mixmers, die bei einer 5 nM-Konzentration (Abbildung 3) transfiziert wurden. Jeder der Mixmers enthielt eine modifizierte Phosphorothioated Rückgrat die Nuklease Abbau widerstehen konnten. Um die Wirksamkeit von Mixmers, die Rate des SMN2 Exon wurde 7 Aufnahme durch RT-PCR und qPCR mit Primer spezifi.......

Diskussion

Die in-vitro- Bewertung hier beschriebene Methode ist schnell, einfach und empfindlich genug für die Prüfung von verschiedenen AONs. Dieses Protokoll ist auf Exon-skipping und Einbeziehung von anderen Genen und verschiedene Zelltypen. Darüber hinaus können die meisten AON Chemikalien (außer PMOs) transfiziert werden mit dieser Methode. AONs kann Spleißen der Pre-mRNA von endogenen und künstlich eingeführte Gene regulieren kann und mit Plasmid-Vektoren mit gezielten Genen Co transfizierten.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
SMA-Fibroblasten	Coriell NIGMS humangenetisches Zellrepositorium	GM03813
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Thermo Fisher	11320033
fötales Rinderserum	Sigma-Aldrich	F1051
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)	Thermo Fisher	15140122
Trypsin-EDTA (0,05%), Phenolrot	Thermo Fisher	25300062
Medien mit Serumentzug	Thermo Fisher	31985070
Transfektionsreagenz	Thermo Fisher	15338100
Guanidiniumthiocyanat-Phenol-Chloroform (TRIzol)	Thermo Fisher	15596-018
RT-PCR Primer			Sequenz 5' bis 3'SMN2
vorwärts:			CTGCCTCCATTTCCTTCTG
SMN2 Rückseite:			TGGTGTCATTTAGTGCTGCTC
GAPDH vorwärts:			TCCCTGAGCTGAACGGGAAG
GAPDH Rückseite:			GGAGGAGTTTGGTCGCTGT
qPCR Primer
SMN2 in voller Länge vorwärts:			GCTATACTGGCTATTATGGGTTTT
in voller Länge SMN2 reverse:			CTCTATGCCAGCATTTCTCCTTAAT
GAPDH vorwärts:			GCAAATTCCATGGCACCGT
GAPDH Rückseite:			AGGGATCTCGCTCCTGGAA
Chloroform	Sigma-Aldrich	P3803
Glykogen, RNA-Qualität	Thermo Fisher	R0551
ImageJ Software
Protease-Cocktail-Inhibitor	Roche	11836153001
Kathodenpuffer			0,025 M Tris-Basis + 40  mM 6-Aminocapronsäure + 20 % Methanol
Anodenpuffer			0,03 M Trisbase + 20 % Methanol
konzentrierter Anodenpuffer			0,3 M Tris-Base + 20 % Methanol
Beta Mercaptoethanol	Millipore	ES-007-E
PVDF-Membran	GE	10600021
Lade-/Probenpuffer für Western Blotting	NuPage Invitrogen	NP007
One-Step RT-PCR Kit	Qiagen	210210
dNTPs	Clontech	3040