Methodenartikel

Bewertung der Exon-Aufnahme durch induzierte Splice Switching Antisense Oligonukleotide in SMA Patienten Fibroblasten

DOI:

10.3791/57530

⸱

11. Mai 2018

 ,  , 
1Department of Medical Genetics, University of Alberta Faculty of Medicine and Dentistry, 2Muscular Dystrophy Canada Research Chair, Department of Medical Genetics, University of Alberta Faculty of Medicine and Dentistry

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Verschiedenen antisense Oligonukleotide (AONs) haben gezeigt, zu induzieren Exon Aufnahme (Spleiß-Modulation) und SMN Ausdruck für Spinale Muskelatrophie (SMA) zu retten. Hier beschreiben wir ein Protokoll für AON Lipotransfection, Exon Aufnahme in das SMN2 -gen und die Bewertungsmethoden zu ermitteln, die Wirksamkeit bei SMA Patienten Fibroblasten zu induzieren.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Spinaler Muskelatrophie (SMA), eine tödliche neurologische Erkrankung, verursacht durch den Verlust des SMN1, präsentiert einen einmaligen Fall in das Feld der antisense-Oligonukleotid (AON)-Therapie vermittelt. Während SMN1 Mutationen für die Krankheit verantwortlich sind, AONs targeting intronischen Spleißstellen Schalldämpfer (ISS) in SMN2, einschließlich der FDA-zugelassene Nusinersen haben gezeigt, dass Wiederherstellung SMN Ausdruck und die Symptome zu lindern. Derzeit konzentrieren sich viele Studien mit AON-Therapie für SMA auf neuartige AON Chemikalien SMN2 , die effektiver und weniger toxisch als Nusinersen möglicherweise gezielt zu untersuchen. Hier beschreiben wir ein Protokoll für in-vitro- Bewertung der Exon-Aufnahme mit Lipotransfection von AONs gefolgt von reverse Transkription Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR), quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) und westliche Beflecken. Diese Methode kann für verschiedene Arten von AON Chemikalien eingesetzt werden. Mit dieser Methode, wir zeigen, dass AONs bestehend aus abwechselnd gesperrt Nukleinsäuren (LNAs) und DNA-Nukleotide (LNA/DNA-Mixmers) zu effizienten SMN2 Exon Aufnahme und Wiederherstellung des SMN-Protein zu einem sehr niedrigen Konzentration und daher LNA führen / DNA-Mixmer-basierte antisense Oligonukleotide möglicherweise eine attraktive therapeutische Strategie, Spleißen Defekte, die durch genetische Krankheiten zu behandeln. Die in-vitro- Bewertung hier beschriebene Methode ist schnell, einfach und empfindlich genug für die Prüfung von verschiedenen neuartigen AONs.

Einleitung

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Spinaler Muskelatrophie (SMA) ist eine tödliche neuromuskuläre Erkrankung in einem autosomal rezessive Muster vererbt. Es zeichnet sich durch den Abbau von Motoneuronen und progressive Stamm und Gliedmaßen Muskel Paralyse1,2. Die Mehrheit der SMA Vorkommen sind eine homozygote Mutation im Survival Motor Neuron 1 (SMN1) gen3. Das Überleben der Motor Neuron 2 (SMN2) Gen ist eine inverse Duplikat des SMN1und hat eine fast identische Sequenz unterscheiden sich durch nur fünf Basen4,5. Ein C-to-Tape-Übergang in SMN2 befindet sich im Exon 7 macht das Gen fast nicht funktionsfähig, weil die Mutation zu wesentlichen Exon 7 führt, in fast 90 % des SMN2 Transkripte (Abbildung 1(eine) ausgeschlossen. SMN2 mRNAs fehlende Exon 7 kann nicht für die SMN1 -Funktion auszugleichen, weil seine Proteinprodukt instabil ist und wird rasch abgebaut.

Antisense Therapie tauchte vor kurzem als eine sehr vielversprechende Strategie für die Behandlung von SMA-6. Die neue Zustimmung des Nusinersen durch die US Food and Drug Administration (FDA) das erste Medikament zur Verfügung gestellt für die Behandlung von SMA-7. Nusinersen ist ein 18-Mer antisense-Oligonukleotid (AON) mit einer 2′-O-Methoxyethyl-Modifikation (MOE) und ein Phosphorothioat Rückgrat. Das Medikament richtet sich an die intronischen Spleißen Schalldämpfer N1 (ISS-N1) befindet sich im Intron 7 des SMN2 Gens. Bindung von Nusinersen zur ISS-N1 fördert die Erholung der funktionalen Full-Length SMN-Protein-Expression von endogenen SMN2 Gens durch Induktion Exon 7 Aufnahme (Abbildung 1(eine)8,9,10 . Viele Studien mit AON-Therapie für SMA, konzentrieren sich auf die Untersuchung neuartiger AON-Chemikalien, die effektiver und weniger toxisch als Nusinersen möglicherweise. Es wurde nachgewiesen, dass AONs mit anderen Chemikalien auch effizient Exon Aufnahme in SMN2 Exon 7 induzieren in Vitro und in Vivo11,12,13.

Gesperrte Nukleinsäuren (LNAs) sind chemisch modifizierte RNA-Analoga, enthält eine Methylen-Brücke verbindet die 4 ' -Carbon mit dem 2′ -Sauerstoff in der Furanose-Struktur (Abb. 1b)14,15. Im Vergleich zu DNA oder RNA, LNAs haben eine erhöhte Affinität für die Bindung an komplementäre RNA-Sequenzen und haben den zusätzlichen Vorteil des Seins sehr widerstandsfähig gegen endogene Nukleasen. Die LNA-Chemie wurde für den Einsatz als Sonden für die Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (FISH) und qPCR16,17angewendet. Darüber hinaus wird es genutzt, um die Genexpression regulieren in Vitro und in Vivo. GapmeR AONs sind eine Kombination aus einsträngiger DNA-Moleküle, flankiert von mehreren LNAs an den 5 ' und 3 ' enden. Sie niederzuschlagen Genexpression durch Bindung ergänzen gezielte mRNAs, wodurch sie von der aktivierten RNase H18abgebaut werden. LNA/DNA Mixmers sind AONs, bestehend aus DNA Nukleotide zwischen LNAs integriert sind. Präsentiert in dieser Ausrichtung können sie binden, MiRNA, hemmen die Funktion (LNA-AntimiR)19. Einige LNA-AntimiRs haben klinischen Entwicklung erreicht. Zum Beispiel Miravirsen (AntimiR-122) ist ein LNA-AntimiR, die MiR-122 zur Behandlung von Hepatitis C-Infektion hemmt und mehrere klinische Phase II-Studien sind derzeit19,20. Vor kurzem wurde nachgewiesen, dass Mixmers LNA/DNA-RNA-Spleißen21auch modulieren kann. Es kann eine bestimmte Sequenz der mRNA zu binden und induzieren Exon-skipping bei Dystrophin mRNA und Exon Aufnahme in SMN2 mRNA in-vitro-13,22.

In diesem Artikel beschreiben wir eine Methodik für die Induktion von Exon-Aufnahme mit AONs und die Bewertung der Wirksamkeit der RNA und Protein Ebene. Um diese Methode zu veranschaulichen, haben wir die LNA/DNA Mixmers targeting ISS-N1 im Intron 7 des SMN2verwendet. AONs transfiziert in SMA Patienten Zellen durch Lipotransfection induzierte Exon 7 Aufnahme in die endgültige SMN2 Transkript und Hochregulation des SMN-Protein-Produktion. Einer der Vorteile der Verwendung von LNA/DNA Mixmers induzieren die Exon-Aufnahme ist, dass die wirksame Konzentration für die Transfektion deutlich niedriger als andere Chemikalien13. Diese Methode kann für viele andere AONs außer Phosphorodiamidate Morpholino Oligomere (PMOs), verwendet werden, die aufgrund ihrer neutralen Ladung Zellen durch Endozytose induziert durch das Endo-Porter Co Transfection Reagens eingeben müssen.

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Protokoll

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(1) Zellkultur

  1. Kultur-SMA Patienten Fibroblasten in das Wachstumsmedium (Dulbeccos modifiziert Eagle mittlere 1:1-12 (Ham) mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) und 0,5 % Penicillin/Streptomycin) in eine CO2 Inkubator bei 37 ° C.
  2. Zellkonzentration mit einem automatisierten Zelle Zähler zu bestimmen und zu 1 x 105 Zellen/mL im Wachstumsmedium, dann Samen auf die entsprechende Platte Zellen verdünnen. Verwenden Sie 12-Well-Platten (1 mL pro Well) für RT-PCR oder qPCR.
  3. Inkubieren Sie die Platten für 24 h in einem CO2 Inkubator bei 37 ° c

(2) LNA/DNA Mixmer Transfektion

  1. Zelle Konfluenz von etwa 65-80 % für optimale Transfektion Effizienz zu gewährleisten.
  2. 10 μM LNA/DNA Mixmers langsam auf Eis Auftauen.
  3. Bereiten Sie in einer 1,5-mL-Tube eine 20 X mixmer Lösung Serum beraubt Medien die Mixmers hinzu, so dass das Endvolumen 50 μL erreicht.
  4. Mischen Sie die Mixmer-Lösung mit 50 μL Serum beraubt Medien mit 3 % Transfection Reagens (Verhältnis 1:1).
  5. 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
  6. Fügen Sie 900 μl Serum beraubt Medium mit 5 % FBS für jedes Rohr.
  7. Aspirieren Sie die alten Medien von der Platte und mit 1 mL LNA/DNA Mixmer Lösung, enthält die Transfektion Reagenz zu ersetzen.
  8. Inkubieren Sie die Zellen für 24-48 h bei 37 ° C in einem CO2 Inkubator.

(3) RNA-Extraktion

  1. Entfernen Sie das Medium und 1 mL Guanidinium-Thiocyanat-Phenol-Chloroform-Reagenz zu den Zellen. Unteren Rand auch mehrmals mit Guanidinium-Thiocyanat-Phenol-Chloroform waschen und in 1,5 mL Röhrchen zu sammeln.
  2. Strudel mit hoher Geschwindigkeit für 30 s und bei-80 ° C für 1 Stunde oder über Nacht.
  3. Die Proben bei Raumtemperatur und Wirbel gut Auftauen.
  4. Fügen Sie 200 µL Chloroform, schütteln Sie kräftig für 15 s, und bei Raumtemperatur 3 min inkubieren.
  5. Zentrifuge bei 12.000 x g für 15 min bei 4 ° C.
  6. Sammeln der oberen klaren wässrigen Phase zu einem neuen Schlauch. Achten Sie darauf, um zu vermeiden, sammeln eines weißen Interphase, die zwischen den oberen und unteren Phasen bildet.
  7. Hinzufügen von 500 µL Isopropanol und 1 µL 8 µg/µL Glykogen (RNA-Klasse). Wirbel für 10 s und Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur für 10 min oder bei-20 ° C.
  8. 12.000 x g für 10 min bei 4 ° C zentrifugiert und entfernen Sie alle überstand. Ein weißes Granulat wird an der Unterseite des Rohres bilden.
  9. Fügen Sie 1 mL kalte 75 % Ethanol und Zentrifuge bei 7.500 x g für 5 min bei 4 ° C.
  10. Entfernen Sie das Ethanol und trocknen Sie das Pellet bei Raumtemperatur, bis kein Ethanol in der Röhre gelassen wird.
  11. Das Pellet in 30 µL DNase/RNase freies Wasser auflösen und 10 min bei 60 ° c inkubieren
  12. RNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer Messen (bei 260 nm), und passen Sie RNA-Konzentration, 50 ng/µL.

4. einen Schritt RT-PCR, die Exon-Aufnahme bei SMN2 Messen

  1. Mix 12,5 µL 2 x RT-PCR-Reaktion-Puffer, 1,0 µL von One-Step RT-PCR Enzym mischen, 0,5 µL jeder Grundierung (SMN2 nach vorne: 5'-CTGCCTCCATTTCCTTCTG-3', SMN2 Rückseite: 5'-TGGTGTCATTTAGTGCTGCTC-3', GAPDH nach vorn: 5'-TCCCTGAGCTGAACGGGAAG-3 ", GAPDH Rückseite: 5'-GGAGGAGTTTGGTCGCTGT-3', 2 µL Gesamt-RNS (50 ng/µL) und 8,5 µL RNase/DNase-freie destilliertes Wasser.
  2. Nachdem bei 50 ° C für 15 min cDNA synthetisiert wird, beginnen Sie die PCR-Reaktion. Verstärken der SMN2 Exon 6-8 mit 30 PCR-Zyklen (94 ° C für 15 s, 60 ° C für 30 s, 68 ° C für 25 s). Die GAPDH mit 20 PCR-Zyklen zu verstärken (94 ° C für 15 s, 60 ° C für 30 s, 68 ° C für 20 s).
  3. Fügen Sie 5 μL 6 x laden Farbstoff, das PCR-Produkt hinzu und laden Sie 5 µL des Gemisches in einem 2 % Agarose-Gel und 40 min bei 100 V laufen.
  4. Bild das Gel und analysieren mit ImageJ-Software.
  5. Messen Sie die Intensität des durchgehenden Bands und Δ7 Bands. Berechnen Sie die Rate von Exon 7 Aufnahme durch den Intensitätswert des (lang) / (Full-Length + Δ7 SMN2).

5. Quantitative PCR (qPCR) um die Exon Aufnahme Rate des SMN2 Messen

  1. Für die cDNA-Synthese, mix 1 µL Oligo-dT, 1 µL 10 mM dNTPs und 11 µL Gesamt RNA (50 ng/µL). Bei 65 ° C für 5 min inkubieren.
  2. Die Proben auf Eis legen und jede Probe 4 µL 5 x Puffer, 1 µL 0.1 M DVB-t, 1 µL RNase-Inhibitor und 1 µL Reverse Transkriptase hinzufügen.
  3. Bei 50 ° C für 60 min inkubieren Sie und Heizen Sie bis zu 80 ° C für 10 min, um die Reaktion zu stoppen. Die cDNA kann bei-20 ° c gelagert werden
  4. Verdünnen Sie die cDNAs mit RNase-freies Wasser (1:5 Verdünnung). Mischung 10 µL 2 x SYBR Green qPCR-Enzym-Mix, 0,8 µL 10 µM Primer (Full-Length SMN2 vorwärts: 5′-GCTATCATACTGGCTATTATATGGGTTTT-3 ', in voller Länge SMN2 -Rückseite: 5′-CTCTATGCCAGCATTTCTCCTTAAT-3 ', Δ7 SMN2 vorwärts: 5′ - TCTGGACCACCAATAATTCCCC-3′, Δ7 SMN2 Rückseite: 5 '-ATGCCAGCATTTCCATATAATAGCC-3 ', GAPDH nach vorne: 5′-GCAAATTCCATGGCACCGT-3 ', GAPDH umzukehren: 5′-AGGGATCTCGCTCCTGGAA-3 '), 3 µL verdünnt cDNA und 5.4 µL RNase-freies Wasser.
  5. Die qPCR-Reaktion zu starten. Die Nutzungsbedingungen: 95 ° C für 30 s, dann 40 Zyklus wiederholen bei 95 ° C für 5 s und 60 ° C für 20 s.
  6. Berechnen Sie die relative Expression in voller Länge SMN2 , GAPDH oder Δ7 SMN2und Normalisieren Sie den unbehandelten Zellen mit den ΔΔCt-Algorithmus.

6. Western blotting

  1. Transfektion Medium aus Zellen entfernen und einmal mit Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) waschen.
  2. Fügen Sie 100 µL Lyse Puffer mit einem Proteaseinhibitor.
  3. Lösen Sie Zellen von der Unterseite von jedem Bohrloch mit einem sterilen Zelle Schaber zu, und sammeln Sie in 1,5 mL Röhrchen. Inkubieren Sie Proben für 30 min auf Eis.
  4. Durchlaufen Sie Zelle lysate Nadel 21 G 10-mal um die Zellen zu vernichten.
  5. 20.800 x g für 15 min bei 4 ° C zentrifugiert und den überstand in neuen 1,5 mL Röhrchen sammeln. Die Probe kann in einer Tiefkühltruhe-80 ° C gelagert werden.
  6. Bestimmen Sie Proteinkonzentration mit einem BCA Protein Assay-Kit zu, und passen Sie die Konzentration auf 1,0 µg/µL.
  7. Mix 5 µL Proben und 5 µL 2 x Probenpuffer Sodium Dodecyl Sulfat (SDS) (10 % SDS; 14 % 0,5 M Tris-HCl-Lösung, pH 6,7; 1 % 0,5 M EDTA-2Na Stammlösung, pH 8.0; 20 % Glycerin; 0,004 % Bromophenol blauen Farbstoff, 5 % β-Mercaptoethanol) und Wärme bei 70 ° C für 10 Minuten.
  8. Laden Sie die Proben in eine 4-12 % Bis-Tris Protein Gele und für 1 h bei 150 V laufen.
  9. Tränken Sie ein dickes Filterpapier in den einzelnen Puffern: (konzentrierte Anode Puffer: 0,3 M Tris-HCl, 20 % Methanol; Anode Puffer: 0,03 M Tris-HCl, 20 % Methanol, Kathode Puffer: 25 mM Tris, 20 % Methanol, 40 mM 6-amino-n-Hexanoic Säure, 0,01 % SDS).
  10. Genießen Sie eine Polyvinylidene Difluoride (PVDF) Membran in Methanol für 20 s, dann in der Anode Puffer übertragen.
  11. Equilibrate das Gel nach der SDS-PAGE mit der Kathode Puffer für 5-10 min. unter Rühren.
  12. Legen Sie die Filterpapiere, PVDF-Membranen und das Gel auf einem semi-dry blotting Computer wie folgt: konzentriert Anode Puffer Papier/Anode Puffer Papier/PVDF Membranprotein/Gel/Kathode Puffer Papier (Abbildung 2).
  13. Decken Sie den Stapel und starten Sie die Übertragung bei 20 V für 30 min.
  14. Spülen Sie nach der Übertragung die PVDF-Membran mit PBST (PBS mit 0,05 % Tween 20) einmal.
  15. Blockieren Sie die Membran bei Raumtemperatur für 30 min in 5 % Magermilchpulver in in PBST aufgelöst oder bei 4 ° C für eine Nacht.
  16. Verdünnen Sie ein gereinigtes Maus Anti-SMN-Antikörper und ein Kaninchen Anti-Cofilin Antikörper 1: 10.000 in 5 % Magermilchpulver in PBST. Über Nacht inkubieren Sie die Membran drin für 1 h bei Raumtemperatur oder bei 4 ° C.
  17. Waschen Sie 3 Mal für 10 min mit PBST.
  18. Verdünnen Sie Sekundärantikörper (Ziege HRP-konjugierten Anti-Maus und Anti-Kaninchen IgG (H + L)), 1: 10.000 in 5 % Magermilchpulver in PBST. 1 h bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.
  19. Waschen Sie die Membran mit PBST für 10 min 3 Mal.
  20. Das Ausgangssignal mit der Chemilumineszenz Western blotting Detection Kit zu erkennen.

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Ergebnisse

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Mit SMA Patienten Fibroblasten, gezielte wir die ISS-N1-Schalldämpfer-Region im Intron 7 des SMN2 Gens mit acht verschiedenen antisense LNA/DNA Mixmers, die bei einer 5 nM-Konzentration (Abbildung 3) transfiziert wurden. Jeder der Mixmers enthielt eine modifizierte Phosphorothioated Rückgrat die Nuklease Abbau widerstehen konnten. Um die Wirksamkeit von Mixmers, die Rate des SMN2 Exon wurde 7 Aufnahme durch RT-PCR und qPCR mit Primer spezifi...

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Diskussion

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Die in-vitro- Bewertung hier beschriebene Methode ist schnell, einfach und empfindlich genug für die Prüfung von verschiedenen AONs. Dieses Protokoll ist auf Exon-skipping und Einbeziehung von anderen Genen und verschiedene Zelltypen. Darüber hinaus können die meisten AON Chemikalien (außer PMOs) transfiziert werden mit dieser Methode. AONs kann Spleißen der Pre-mRNA von endogenen und künstlich eingeführte Gene regulieren kann und mit Plasmid-Vektoren mit gezielten Genen Co transfizierten.

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

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Die Autoren danken Nicole McRorie für Hilfe mit den Experimenten. Diese Arbeit wurde von der University of Alberta Fakultät für Medizin und Zahnmedizin, Slipchuk SMA Research Foundation Research Grant, der kanadischen Institute der Gesundheit Forschung (CIHR), die Freunde von Garrett Cumming Forschungsmittel, HM Toupin neurologischen unterstützt. Wissenschaft Forschungsmittel, die muskulöse Dystrophie Kanada, Kanada Stiftung für Innovation, Alberta Enterprise und Weiterbildung, und die Frauen und Kinder Health Research Institute (WCHRI).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
SMA-FibroblastenCoriell NIGMS humangenetisches ZellrepositoriumGM03813
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher11320033
fötales RinderserumSigma-AldrichF1051
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)Thermo Fisher15140122
Trypsin-EDTA (0,05%), PhenolrotThermo Fisher25300062
Medien mit SerumentzugThermo Fisher31985070
TransfektionsreagenzThermo Fisher15338100
Guanidiniumthiocyanat-Phenol-Chloroform (TRIzol)Thermo Fisher15596-018
RT-PCR PrimerSequenz 5' bis 3'SMN2
vorwärts: CTGCCTCCATTTCCTTCTG
SMN2 Rückseite: TGGTGTCATTTAGTGCTGCTC
GAPDH vorwärts: TCCCTGAGCTGAACGGGAAG
GAPDH Rückseite: GGAGGAGTTTGGTCGCTGT
qPCR Primer
SMN2 in voller Länge vorwärts:GCTATACTGGCTATTATGGGTTTT
in voller Länge SMN2 reverse: CTCTATGCCAGCATTTCTCCTTAAT
GAPDH vorwärts: GCAAATTCCATGGCACCGT
GAPDH Rückseite:AGGGATCTCGCTCCTGGAA
ChloroformSigma-AldrichP3803
Glykogen, RNA-QualitätThermo FisherR0551
ImageJ Software
Protease-Cocktail-Inhibitor Roche11836153001
Kathodenpuffer0,025 M Tris-Basis + 40  mM 6-Aminocapronsäure + 20 % Methanol
Anodenpuffer0,03 M Trisbase + 20 % Methanol
konzentrierter Anodenpuffer0,3 M Tris-Base + 20 % Methanol
Beta MercaptoethanolMilliporeES-007-E
PVDF-MembranGE10600021
Lade-/Probenpuffer für Western BlottingNuPage InvitrogenNP007
One-Step RT-PCR Kit Qiagen 210210
dNTPsClontech3040

Referenzen

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Bewertung der Exon InklusionSMN2 Exon 7LipotransfektionsprotokollRT PCR Analysequantitative PCRWestern BlottingLNA DNA MixmereAntisense Oligonukleotid Therapie

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