Hier präsentieren wir homogene Zeitaufgelöste FRET (HTRF) als effiziente Methode zum Schnellnachweis von Insulin aus den Zellen abgesondert.
Methodenartikel
Hier präsentieren wir homogene Zeitaufgelöste FRET (HTRF) als effiziente Methode zum Schnellnachweis von Insulin aus den Zellen abgesondert.
Die Erkennung der Insulin-Sekretion ist entscheidend für erhellendes Mechanismen der regulierten Sekretion sowie wie in Studien des Stoffwechsels. Obwohl zahlreiche Insulin-Assays für Dekaden bestanden haben, hat die jüngsten Aufkommen der homogenen Zeitaufgelösten Förster Resonance Energy Transfer (HTRF) Technologie diese Messungen deutlich vereinfacht. Dies ist eine schnelle, kostengünstige, reproduzierbare und robuste optische Assay abhängig, Antikörper konjugiert, helle Fluorophore mit lang anhaltende Emission, die Zeitaufgelöste Förster Resonance Energy Transfer erleichtert. Darüber hinaus ist HTRF Insulin Erkennung für die Entwicklung von Hochdurchsatz-Screening-Assays. Hier verwenden wir HTRF, um Insulin-Sekretion in INS-1E Zellen, eine Ratte Insulinom abgeleitet Zell-Linie zu erkennen. Dies ermöglicht es uns, basalen Ebenen von Insulin und deren Veränderungen in Reaktion auf die Stimulation der Glukose zu schätzen. Darüber hinaus verwenden wir diese Insulin-Detection-System, um die Rolle von Dopamin als negativer Regulator der Glukose-stimulierten Insulinsekretion (GSIS) zu bestätigen. In ähnlicher Weise, anderen Dopamin D2-wie-Rezeptor-Agonisten, Quinpirole und Bromocriptin, GSIS Konzentration abhängig zu senken. Unsere Ergebnisse zeigen das Dienstprogramm des Formates HTRF Insulin-Test bei der Bestimmung der Rolle von zahlreichen Medikamenten im GSIS und ihre pharmakologische Profile.
Die Verordnung des Energiestoffwechsels ist durch ein großen anabole Hormon Insulin verfeinert. Insulin ist synthetisiert und von pankreatischen Betazellen in Reaktion auf erhöhte extrazelluläre Blutzuckerwerte veröffentlicht. Das freigesetzte Insulin löst die Aufnahme von Glukose durch Insulin-empfindlichen Gewebe1,2. Physiologisch ist dies auf die Höhe der Glukosekonzentration nach einer Mahlzeit, gefolgt von Sekretion von Insulin, Glukoseaufnahme Regeln verbunden. Störungen in Glukose Homöostase zu metabolische Beeinträchtigungen bis hin zu Insulinresistenz führen und letztlich bei der Entstehung von Typ-2 ....
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(1) INS-1E Zellen: Wartung und Beschichtung
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Wir validiert unsere Insulin HTRF Assay durch die Erzeugung eines Insulin-Standardkurve mit gereinigtem Humaninsulin Standards der vordefinierten Konzentrationen (Abbildung 2). Generation der Standardkurve erlaubt uns, die ratiometrischen Fluoreszenz Lesungen zu extrapolieren und somit bestimmen die sekretierten Insulinspiegel in Reaktion auf die medikamentöse Behandlungen (Abbildung 2). Intraplate Variante für Kurvenanpassung wa.......
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Die hier beschriebenen HTRF Insulin Assay bietet eine schnelle, effiziente System zur Messung der Insulin-Sekretion aus einem kultivierten Zell-basierte System. Einer der wichtigsten Vorteile bietet dieser Test eine geringe Hintergrundsignal aufgrund der hohen Signal-Rausch-Verhältnis. Darüber hinaus haben wir bestätigt, dass das HTRF-Signal über einen längeren Zeitraum hinweg stabil ist (> 24 h)7. Dennoch, da die Insulin-Bindung monoklonaler Antikörper schnell bindende Sättigung nach Zugabe der P.......
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Wir danken Nicolas Pierre (Cisbio Bioassays) für hilfreiche Ratschläge und Dr. Pierre Maechler (Universität Genf) für die großzügige Bereitstellung von INS-1E Zellen. Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Finanzierung aus dem Department of Defense (Grant PR141292, Z.F.), John F. und Nancy A. Emmerling Fund of The Pittsburgh Foundation (Z.F.).
Die Autoren haben nichts preisgeben.
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| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 96-Well-Weiß-Halbflächenplatte | Greiner Bio-One | 82050-042 | |
| 384-Well-Weißplatte mit niedrigem Volumen und rundem Boden | Corning | 15100157 | |
| Insulin High Range Kit | Cisbio Bioassays | 62IN1PEH | 10.000 Tests HTRF-basiertes Insulin-Assay-Kit |
| PHERAstar FSX Platten-Reader | BMG Labtech | FSX | Platten-Reader angepasst für HTRF-basierte Assay-Messwerte |
| Plattenversiegeler | Fisher Scientific | DY992 | Zum Verschließen der Platte, während Antikörper inkubieren |
| Hämozytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
| RPMI Medium 1640 (1x) | Gibco | 11875-093 | [+] L-Glutamin |
| Trypsin 0,05% | Corning | 25-052-CI | 0,53 mM EDTA, (-) Natriumbicarbonat |
| DPBS (Dulbecco-phosphatgepufferte Kochsalzlösung) | Corning | 21-031-CV | Ohne Calcium und Magnesium |
| Fötales Rinderserum | Corning | 35-010-CV | |
| HEPES | Gibco | 156-30-080 | |
| Natriumpyruvat | Gibco | ||
| Penicillin/Streptomycin-Lösung 100x | Corning | 30-002 CT | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M1348 | |
| Trypanblauer Fleck (0,4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Dopaminhydrochlorid | Sigma | 8502 | |
| Bromocriptinmesylat | Tocris | 427 | |
| (-)-Chinpirolhydrochlorid | Tocris | 1061 | |
| Rinderserumalbumin | Calbiochem | 12659 | |
| Poly-L-Lysin | Sigma | P4832 | |
| Glukose | Sigma | G7021 | |
| DMSO (Dimethylsulfoxid) | Sigma | 276855 |
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