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Methodenartikel

Schnelle und spezifische Immunomagnetic Isolierung der Maus primären Oligodendrozyten

13.8K Aufrufe

⸱

DOI:

10.3791/57543

⸱

21. Mai 2018

 ,  , 
1Program in Molecular and Cellular Biology, State University of New York Downstate Medical Center, 2Department of Neurology and Rehabilitation, University of Illinois at Chicago

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir beschreiben die Immunomagnetic Isolierung der primäre Maustaste Oligodendrozyten, ermöglicht die schnelle und spezielle Isolierung der Zellen für in-vitro- Kultur.

Zusammenfassung

Die effiziente und robuste Isolierung und Kultur der primären Oligodendrozyten (OLs) ist ein wertvolles Werkzeug für die in-vitro- Studie über die Entwicklung der oligodendrogliazellen sowie die Biologie der demyelinisierenden Erkrankungen wie der multiplen Sklerose und Pelizaeus-Merzbacher-ähnliche Erkrankung (PMLD). Hier präsentieren wir Ihnen eine einfache und effiziente Auswahlmethode für die Immunomagnetic Isolierung der Stufe drei O4+ Preoligodendrocytes Zellen von Neugeborenen Mäusen Welpen. Da unreif OL bilden mehr als 80 % der Nagetier-Gehirn weißen Substanz bei postnatalen 7.Tag (P7) dieser Isolationsmethode sorgt nicht nur für zelluläre Hochzinsanleihen, sondern auch die spezielle Isolierung des OLs bereits verpflichtet, die oligodendroglial Linie, Verringerung der Möglichkeit der Isolierung von kontaminierenden wie Astrozyten und andere Zellen aus dem Gehirn der Maus. Diese Methode ist eine Modifikation der zuvor berichteten Techniken und bietet Oligodendrozyt Vorbereitung Reinheit über 80 % in etwa 4 h.

Einleitung

Oligodendrozyten (OLs) sind die Myelinating Zellen des zentralen Nervensystems (ZNS)1. Die Isolation und die Kultur der primären Oligodendrozyten in einem streng regulierten Umfeld ist ein wertvolles Werkzeug für die in-vitro- Studie über die Entwicklung der oligodendrogliazellen sowie die Biologie der demyelinisierenden Erkrankungen wie der multiplen Sklerose2 . Dies erfordert eine effiziente und robuste Oligodendrozyt Isolation und Kultur Methode3. In dieser Studie nutzten wir den Ausdruck einer unverwechselbaren Oligodendrozyt Zelle Oberfläche Markierung eine modifizierte Isolierung Technik zu implementieren, die schnellen und spezifischen ist.

Vier verschiedene Stadien der Reifung Oligodendrozyt identifiziert worden, jeweils geprägt durch den Ausdruck des unverwechselbaren Zelle oberflächenmarker für jede Entwicklungsstufe (Abbildung 1). Diese Zelle oberflächenmarker durch spezifische Antikörper4,5erkannt werden und können verwendet werden, um die OLs in bestimmten Phasen zu isolieren. In der ersten Stufe haben Oligodendrozyt Vorläuferzellen (OPCs) die Fähigkeit, sich vermehren, migrieren und speziell express Platelet-derived Wachstumsfaktor-Rezeptor (PDGF-Rα)6, Gangliosid A2B5, Proteoglykan NG27,8 , Polysialic Säure-neuronale Zelle Adhäsion Molekül9 und 7 (FABP7)-Fett-Säure-bindendes Protein10. OPCs haben bipolare Morphologie mit wenigen kurzen Prozesse ausgehend von den entgegengesetzten Polen der Zellkörper charakteristisch von neuronalen Vorläufer Zellen11ist.

Diagramm der Oligodendrozytenreifung; Stadien mit Markern: OPC, Präoligodendrozyten, Unreif, Reif.
Abbildung 1: Ausdruck der Zelle oberflächenmarker während der Maus Oligodendrozyt Entwicklung. OLs Zelle oberflächenmarker wie z. B. A2B5, GalC (O1) NG2, O4 und PDGF-Rα können verwendet werden, um speziell Oligodendrozyten in bestimmten Entwicklungsstadium isolieren mit spezifischen Antikörpern.   Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.

In der zweiten Stufe OPCs geben Anlass zu Preoligodendrocytes und an der Zellmembran express nicht nur OPC Marker, sondern auch die Sulfatide (sulfatierten Galactolipid) von O4 Antikörper12,13, und das GPR17 Protein14anerkannt die weiterhin erst im Stadium der Unreife Oligodendrozyt (OL). Zu diesem Zeitpunkt verlängern Preoligodendrocytes multipolaren kurze Prozesse. Preoligodendrocytes sind die Hauptphase OL postnatale Tag 2 (P2) in der zerebralen weißen Substanz von Ratte und Maus mit einer kleineren Bevölkerung von unreifen OLs15.

Während der dritten Phase weiterhin die unreifen OLs express O4, Ausdruck von A2B5 und NG2 Markern zu verlieren und beginnen Galactocerebroside C16zum Ausdruck bringen. In diesem Stadium OLs oligodendroglial Abstammung verpflichtet und werden nach dem mitotischen Zellen mit langen verzweigten Ästen17,18. Unreife OL bilden mehr als 80 % der Nager weißen Substanz auf P7 und zu diesem Zeitpunkt die ersten Zellen der MBP+ 15,19,20,21eingehalten werden. Daher könnte Isolierung des OLs auf P7 zellulären Hochzinsanleihen sicherstellen.

In der vierten und letzten Ausbaustufe OL express Reife OLs Myelinating Proteine (Myelin basic Protein (MBP), Proteolipid-Protein (PLP), Myelin verbundenen Glykoprotein (MAG) und Myelin Oligodendrozyt Glykoprotein (MOG)22,23 ,24,25,26. In diesem Stadium Reifen OLs Membranen dieser Form kompakt Messgutes Hüllen um die Axone zu erweitern und sind in der Lage zu myelinisieren. Dies deckt sich mit der Beobachtung, dass im Gehirn der Ratte und Maus MBP+ Zellen immer reichlich bei P1419,20,21geworden.

Seit der ersten Isolierung von Oligodendrozyt von Fewster und Kollegen in 196727wurden mehrere Methoden zur Isolierung des OLs von Nagetier CNS einschließlich Immunopanning28,29,30umgesetzt, Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) Nutzung Zelle Oberfläche-spezifische Antigene28,31, Differentielle Zentrifugation gradient32,33,34,35 und eine schütteln Methode basiert auf differenzielle Einhaltung von verschiedenen CNS Glia36,37. Bestehende Kultur Verfahren haben jedoch Einschränkungen, insbesondere in Bezug auf Reinheit, Ertrag und Zeitaufwand Verfahren38. Daher sind effizientere Isolationsmethoden für Oligodendrozyten erforderlich.

In diesem Papier stellen wir eine einfache und effiziente Auswahlmethode für die Immunomagnetic Isolierung der Stufe drei O4+ Preoligodendrocytes Zellen von Neugeborenen Mäusen Welpen. Diese Methode ist eine Abwandlung der Techniken von Emery Et Al. berichtet 39 und Dincman Et al. 40 und bietet eine Oligodendrozyt Vorbereitung Reinheit über 80 % in etwa 4 h.

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Protokoll

Die Mäuse, die in dieser Studie verwendet wurden nach den Richtlinien der SUNY Downstate Medical Center Division von Labor Tier Ressourcen (DLAR)-Protokoll-Nummer 15-10492 betreut.

Hinweis: Primären Oligodendrozyten wurden isoliert von Neugeborenen (P5-P7 Wildtyp C57Bl/6N) Mäuse. In diesem Stadium bilden unreifen OLs mehr als 80 % der Nager weißen Substanz zellulären ertragreich zu gewährleisten. Alle Puffer und Reagenz Kompositionen stehen am Ende der Tabelle der Materialien.

(1) Deckgläsern Vorbereitung

Hinweis: Poly-D-Lysin (PDL) / Laminin beschichtet Deckgläsern sollten bereit sein, vor dem OL-Isolierung.

  1. Platz #1 Deutsch Glas Deckgläsern in ein 50 mL konische Röhrchen und 35 mL 70 % EtOH um sie zu reinigen.
  2. Verschließen Sie das Röhrchen, legen Sie sie in einem Nutating-Mischer und gleichzeitig sanft schaukelnden bei Raumtemperatur für mindestens 30 min inkubieren. Deckgläsern können über Nacht inkubiert.
  3. 70 % EtOH zu verwerfen.
  4. Waschen Sie die Deckgläsern 3 Mal mit entionisiertem Wasser, entfernen Sie das Wasser jedes Mal mit Vakuum Aspiration.
  5. Hinzugeben Sie 30-35 mL PDL 50 µg/mL auf Deckgläsern in der 50 mL Tube genug Deckung der Deckgläsern.
  6. Legen Sie die 50-mL-Röhrchen mit Deckgläsern auf einem Nutating-Mixer und Inkubation bei Raumtemperatur für mindestens 30 min beim Schaukeln sanft.
  7. Waschen Sie die Deckgläsern 3 Mal mit entionisiertem Wasser, entfernen das Wasser jedes Mal mit Vakuum Aspiration.
  8. Übertragen Sie die Deckgläsern in 60 mm Petrischalen mit entionisiertem Wasser.
  9. Verwenden Sie eine P200 PIPETTENSPITZE um den Deckgläsern als Schicht auf der gesamten Oberfläche der Petrischale anzuordnen.
  10. Das Wasser vorsichtig von den Gerichten mit Vakuum Aspiration.
  11. Entfernen Sie das überschüssige Wasser rund um die Deckgläsern und mit geöffnetem Deckel und unter UV-Licht in der Haube über Nacht trocknen lassen.
    Hinweis: PDL beschichtet Glasdeckgläser können bis zu drei Monate lang bei 4 ° C in sterile Petrischalen gespeichert werden.
  12. Legen Sie die Deckgläsern in 24-Well-Platten, einer pro Well, mit feinen Pinzette.
  13. Verschieben Sie die Deckgläsern, in die Mitte der gut, dafür zu sorgen, dass die Kanten die Wand des Brunnens nicht berühren.
  14. 100 µL 10 µg/mL Laminin verdünnt in B27NBMA hinzufügen (siehe die Tabelle der Materialien) beginnend in der Mitte der einzelnen Deckglas und bewegt sich in eine kreisförmige Art und Weise zu den Rändern hin um den Bereich abzudecken.
    Hinweis: Da Laminin OL Wartung beteiligt ist und fördert die Differenzierung in Reife OLs, ist es ein wichtiger OL Überlebensfaktor für in-vitro- Kultur41,42,43,44.
  15. Inkubieren Sie die Platte in einem 37 ° C Inkubator bei 5 % CO2 für mindestens 1 h oder bis zur Beschichtung der OLs bereitstehen.

(2) Maus Gehirn Kortex Dissoziation

  1. Opfern Sie postnatale 5-7-Tage alten C57Bl/6N Maus Welpen durch schnelle Enthauptung mit der Schere zuvor in 70 % igem Ethanol gereinigt.
    Hinweis: Cerebral Cortex von 5-6 Neugeborenen Mäusen Welpen wurden für jede Zubereitung verwendet. Im Durchschnitt ergibt ein Mäusegehirn 1-1.5 x 106 OLs.
  2. Die Kopfhaut entlang der Mittellinie mit kleinen sezierenden Schere geschnitten und einfahren um den Schädel zu entlarven.
  3. Schneiden Sie den Schädel sorgfältig entlang der Mittellinie die Öffnung auf der Rückseite des Schädels auf den vorderen Bereich, heben Sie mit der Schere zur Vermeidung von Schäden des Gehirns ab. Dann schneiden Sie die Öffnung im hinteren Teil des Schädels mit in Richtung jeder Augenhöhle entlang der Schädelbasis.
  4. Verwenden Sie feine Pinzette, um sanft zu necken die Rinde vom Mittelhirn und übertragen Sie sie auf eine 60-mm-Gewebe-Kultur-Schale mit 7 mL B27NBMA. Wiederholen Sie die Schritte 2,2 bis 2,4 für jedes Gehirn, Bündelung der seziert Cortex.
  5. Der Cortex auf eine neue 60-mm-Gewebe-Kultur-Schale mit 5 mL Dissoziation Puffer übertragen (B27NBMA, 20-30 U/mL Papain und 2.500 U DNase ich).
  6. Würfel der Cortex in kleine Stücke von ca. 1 mm3 mittels einer Skalpellklinge #15 und 20 min in einem 37 ° C, 5 % CO2 Inkubator inkubieren.
  7. Fügen Sie 1 mL der bovinen Wachstum Serum (BGS), die enzymatische Reaktion zu stoppen.
  8. Übertragen Sie der Cortex zusammen mit der Dissoziation-Medien auf eine 15 mL konische Rohr mit einer 10 mL serologische pipettieren.
  9. Vorsichtig beginnen, das Hirngewebe zu trennen, von langsam bis pipettieren und 6-8 Mal mit einer 10 mL serologische pipettieren, mit sorgen um Luftblasen zu minimieren.
  10. Lassen Sie die Gewebe-Brocken für 2-3 min zu begleichen und den überstand auf eine frische Rohr übertragen.
  11. Fügen Sie 3 mL B27NBMA mit 10 % BGS/2500 U DNase I, um das Gewebe pellet.
  12. Verwenden Sie eine serologische 5-mL-Pipette, um sanft das Hirngewebe distanzieren beim pipettieren rauf und runter 6 - 8 Mal. Achten Sie darauf, um Luftblasen zu minimieren.
  13. Lassen Sie die Gewebe-Stücke für 2-3 min. zu begleichen.
  14. Übertragen Sie den überstand auf eine frische Rohr. Fügen Sie 3 mL B27NBMA mit 10 % BGS/DNase I, um das Gewebe pellet.
  15. Sanft distanzieren Sie das Hirngewebe mit einer P1000 pipettieren Spitze, beim pipettieren des Mix aus Medien und Gehirn Sie Gewebe rauf und runter. Wiederholen Sie Schritte 2.13 und 2.14, bis keine großen Stücke des Gewebes bleiben oder B27NBMA mit 10 % BGS/DNase I ist erschöpft, was zuerst eintritt. Achten Sie darauf, um Luftblasen zu minimieren.
  16. Pool-Zellsuspension mit früheren Überstände.
  17. Platz 70 µm Zelle Sieb in einen 50-mL-Tube. Mit einer 10 mL serologische pipettieren, übergehen Sie die gepoolten Zellsuspension sanft 70 µm Zelle Sieb.
  18. Waschen Sie die Zelle Sieb durch Zugabe von 1 mL B27NBMA mit 10 % BGS/DNase ich.
  19. Entsorgen Sie die Zelle Sieb. 30 mL mit B27NBMA mit 10 % des Volumens bringen BGS/DNase ich.
  20. Übertragen Sie die Zellsuspension auf zwei 15 mL konische Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension für 10 min bei 200 X g.
  21. Den überstand zu entfernen, ohne die Zellen der Luft ausgesetzt. Der Überstand wird aufgrund zellenrückstand bewölkt sein. Fügen Sie 3 mL B27NBMA mit 10 % BGS zum Pellet.
  22. Trennen Sie sorgfältig die Zelle Pellet mit einem P1000 pipettieren. Bringen Sie das Volumen 15 ml mit B27NBMA mit 10 % BGS
  23. Ein frischer 40 µm Zelle Sieb übergehen Sie die Zellsuspension.
  24. Waschen Sie die Zelle Sieb durch Zugabe von 1mL B27NBMA mit 10 % BGS Entsorgen Sie die Zelle Sieb.
  25. 30 mL mit B27NBMA mit 10 % des Volumens bringen BGS
  26. Übertragen Sie die Zellsuspension auf 2 x 15 mL konische Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension für 10 min bei 200 X g.
  27. Entfernen Sie die meisten der Überstand, ohne die Zellen der Luft ausgesetzt. Aufzuwirbeln Sie die Zelle-Pellets in 5 mL Eis kalte magnetische Zelle Sortieren (MCS) Puffer.

3. Bestimmung der Zellzahl und Lebensfähigkeit

  1. Verdünnen Sie 100 µL Zellsuspension mit 400 µL Trypan blau Lösung in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch, eine Verdünnung von 1:5 bei 0,4 % (w/V) zu erreichen.
  2. Zentrieren Sie ein Deckglas über eine Hemocytometer Kammer und füllen, die die beiden Kammern mit 10 µL der Zelle Verdünnung mit Hilfe einer Pipette P10 und die Vermeidung von Überfüllsicherung. Die Lösung wird unter dem Deckglas durch Kapillarwirkung weitergeben.
  3. Legen Sie die Hemocytometer auf den Mikroskoptisch und stellen Sie Fokus 40 X Vergrößerung ein.
    Hinweis: Zellenzahlen sind mit einem handgeführten Zähler in jedem der fünf Quadrate (vier Ecken und einem Zentrum) aufgenommen. Nur nicht-lebensfähige Zellen absorbieren den Farbstoff und blau, während live angezeigt und gesunde Zellen erscheinen Runde und refraktiven und nicht absorbieren die blau gefärbten Farbstoff, so dass für die Bestimmung der Anzahl der lebensfähigen und total Zellen pro Milliliter.

4. Isolierung von O4+ Oligodendrozyten

  1. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 200 X g für 10 min.
  2. Sorgfältig entsorgen des Überstands mit Vakuum Aspiration, Vermeidung der Exposition der Zellen in die Luft.
  3. Aufzuwirbeln Sie das Pellet in 90 µL MCS Puffer pro 1 x 107 total Zellen gefolgt durch die Zugabe von 10 µL Anti-O4 Perlen pro 1 x 107 Zellen.
  4. Mischen Sie die Zellsuspension und Perlen durch die 15 mL konische Rohr mit dem Finger schnippen sanft 4-5 Mal.
  5. Inkubieren Sie die Mischung für 15 min bei 4 ° C, schnippte die 15 mL konischen Rohr mit dem Finger 4-5 Timesevery 5 min.
  6. Waschen Sie die Mischung, indem das Rohr vorsichtig 2 mL MCS Puffer pro 1 x 107 Zellen hinzufügen. Zentrifugieren Sie die Mischung bei 200 X g für 10 min.
  7. Verwerfen des Überstands vorsichtig mit Vakuum Aspiration, Vermeidung der Exposition der Zellen in die Luft. Aufschwemmen der Zelle Pellet in 500 µL MCS Puffer für jeden 1 x 10-7 -Zellen.
  8. Legen Sie einen Magnetabscheider auf einem Magnetabscheider Stand. Legen Sie eine Auswahl-Spalte auf den Magnetabscheider und platzieren Sie ein 40 µm Zelle Sieb oben auf die Spalte. Legen Sie zwei 15 mL oder eine 50 mL konische Rohr unterhalb der Trennkolonne die Durchströmung zu sammeln.
  9. Vorspülen der 40 µm Sieb und Trennung Spalte mit 3 mL MCS Puffer und den Puffer durch die Säule laufen, ohne dass es trocknen zu lassen.
  10. Fügen Sie die Mischung aus Zellsuspension und Perlen in der Zelle-Sieb und in der Spalte Auswahl.
  11. Waschen Sie die 40 µm Zelle Sieb mit 1 mL der MCS-Puffer.
  12. Verwerfen Sie die Zelle Sieb und lassen Sie die Mischung von Zellen, Perlen und Puffer ohne Trocknen durch die Säule laufen.
  13. Waschen Sie die Trennsäule 3 Mal mit 3 mL MCS Puffer und 1 mal mit OL Verbreitung Medien.
  14. Entfernen Sie die Trennsäule aus der Magnetabscheider, legen Sie sie schnell in ein 15 mL konische Röhrchen, und sofort 5 mL OL Verbreitung Medien.
  15. Legen Sie einen Kolben auf der Oberseite der Spalte und fest drücken, um die markierten Zellen in das 15 mL konische Röhrchen auszuspülen.
  16. Entfernen Sie 100 µL Zellsuspension, Zellzahl und Lebensfähigkeit verwenden Trypan blau und Hemocytometer, wie in Abschnitt 3 zu bestimmen.
    Hinweis: Zellviabilität über 80 % gilt als akzeptabel, mit der Kultur des OLs fortzufahren, aber Rentabilität größer als 90 % ist optimal.

5. Beschichtung von isolierten O4+ Oligodendrozyten

  1. Verdünnen Sie die Zellsuspension auf den Wunsch Beschichtung Dichte (5 x 105 Zellen pro Deckglas) mit OL Verbreitung Medien.
    Hinweis: OL Dichte Aussaat ist sehr wichtig, damit entsprechende Zelldichte bestätigt werden sollte, unter Verwendung eines Mikroskops Gewebekultur, bevor Sie fortfahren. Dichte unter 10.000 Zellen/Deckgläsern Aussaat führen zu schlechten Zelle überleben. Dichte bei 10.000 bis 25.000 OL Beschichtung ist morphologischen Differenzierung langsam45. Wir Platte OLs an Aussaatdichte von mindestens 50.000 Zellen/Deckgläsern, Zelle Überleben zu sichern.
  2. Verschieben Sie die 24-Well-Platten mit Deckgläsern mit Laminin aus Inkubator, der Gewebekultur Haube überzogen.
  3. Jede Deckglas entfernen Sie Laminin und ersetzen Sie es mit 100 µL der OL-Suspension.
  4. Inkubieren Sie OLs im 37 °C/5% CO2 Inkubator für maximal 45 min OL Adhäsion zu den Deckgläsern zu fördern.
  5. Entfernen Sie nach der Inkubation die 24-Well-Platten aus dem Inkubator. Jede Flut gut von der 24-Well-Platte mit 500 µL OL Verbreitung Medien.
  6. Legen Sie die OLs zurück in den 37 °C/5% CO2 Inkubator für weitere 24 h.
  7. 24 h nach der Beschichtung des OLs, Verbreitung Medien entfernen und ersetzen mit OL Differenzierung Medien, Differenzierung zu induzieren.
  8. Legen Sie die OLs zurück in den Inkubator und nicht entfernen Sie, bis die Zellen zur Fixierung bereitstehen.
    Hinweis: Veränderung des pH-Wertes sind schädlich für OLs und Zellviabilität zu verringern, unnötige Entfernung der OLs-Kulturen aus dem Inkubator sollte daher vermieden werden.

6. Immunfluoreszenz-Färbung

  1. Für den Nachweis von Zelle oberflächenmarker (NG2, O1 und O4) entfernen Sie das Medium aus dem Brunnen.
  2. Fügen Sie 250 µL Maus Hybridom Überstände mit primären Antikörper gegen O1 (unverdünnt)13 und O4 (unverdünnt)13 und Kaninchen gegen NG2 polyklonale (1: 150 in B27NBMA verdünnt).
    Hinweis: Wenn im Handel erhältlichen Anti-O1 und Anti-O4 Antikörper eingesetzt werden sollen, ist es ratsam Verdünnungen vorgeschlagen vom Hersteller zu nutzen.
  3. Inkubieren Sie die Zellen mit dem Primärantikörper in einem 37 °C/5% CO2 Inkubator maximal 45 min.
  4. Zweimal mit 0,05 % waschen Sie Tween-20/1 X PBS. Befestigen Sie die Zellen mit 4 % Paraformaldehyd (4 % PFA) für 10 min bei Raumtemperatur.
  5. Drei Mal für 5 min mit 0,05 % waschen Sie Tween-20/1 X PBS.
  6. Verdünnen Sie Ziege Alexa 488-konjugierten Anti-Maus IgM oder Anti-Kaninchen IgG Sekundärantikörper (1: 400) in B27NBMA.
  7. Entfernen Sie die 0,05 % Tween-20/1 X PBS aus den Deckgläsern. Inkubieren Sie die Zellen mit Sekundärantikörper für 1 h bei Raumtemperatur im Dunkeln.
  8. Drei Mal für 5 min mit 0,05 % waschen Sie Tween-20/1 X PBS.
  9. Entfernen Sie für doppelte Färbung für die Erkennung von internen Marker (GFAP) die 0,05 % Tween-20/1 X PBS und Block/permeabilize Zellen mit Block/Permeabilisierung Puffer für 15 min bei Raumtemperatur. Fahren Sie andernfalls mit Schritt 6.17.
  10. Entfernen Sie Block/Permeabilisierung Puffer zu, und fügen Sie 250 µL Huhn Anti-GFAP (1: 100) in Block/Permeabilisierung Puffer verdünnt.
  11. Inkubieren Sie die Zellen mit Anti-GFAP für 1 h bei Raumtemperatur. Drei Mal für 5 min mit 0,05 % waschen Sie Tween-20/1 X PBS.
  12. Verdünnen Sie Alexa 594 konjugiert Ziege Anti-Huhn IgG Sekundärantikörper (1: 400) in B27NBMA.
  13. Entfernen Sie die 0,05 % Tween-20/1 X PBS aus den Deckgläsern. Inkubieren Sie die Zellen mit Sekundärantikörper für 1 h bei Raumtemperatur im Dunkeln.
  14. Drei Mal für 5 min mit 0,05 % waschen Sie Tween-20/1 X PBS.
  15. Gegenfärbung mit 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) und montieren Sie die Zellen mit Antifade Montage Medium mit DAPI.
  16. Lassen Sie die Deckgläsern im Dunkeln bei Raumtemperatur über Nacht heilen.
  17. Bild der gefärbten Zellen mit einem Epifluoreszenz-Mikroskop.
    Hinweis: In diesem Protokoll wurden die Zellen bei 40 X Vergrößerung mit einem einheitlichen Belichtungszeit abgebildet.

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Ergebnisse

Der Zweck dieser Studie war es, eine verbesserte Isolationsmethode für O4 etablieren+ primäre Maustaste Oligodendrozyten erfordern die geringst mögliche Manipulation von den Zielzellen. Der gesamte Vorgang von Euthanasie der Welpen auf Beschichtung der Zellen im Deckgläsern dauert ca. 4 Stunden und Darstellung von Daten, die hier gezeigten drei unabhängige Experimenten. Nach Gewebe Dissoziation wurden durchschnittlich 4,3 ± 0,46 x 107 Zellen isoliert für jedes unabhä...

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Diskussion

In dieser Mitteilung präsentieren wir eine Methode für die effiziente Isolierung hochgereinigte unreifen Maus Oligodendrozyt Kulturen. Im Vergleich zu früher veröffentlichten Protokolle39,40, ergab diese Methode eine höhere Reinheit mit einem viel niedrigeren Niveau der Astroglia-positiven Astrozyten und einen sehr geringen Prozentsatz von anderen Zellen nicht gekennzeichnet. Es ist wichtig, darauf hinzuweisen, dass diese unreifen OLs bereits verpflichtet, die ol...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Angaben.

Danksagungen

Diese Studie wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem National Multiple Sclerosis Society (RG4591A1/2) und die National Institutes of Health (R03NS06740402). Die Autoren danken Dr. Ivan Hernandez und seinem Labor-Mitglieder für die Laborfläche, Ausrüstung und Beratung.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
10 ml serologische PipettenFisher Scientific13-676-10J
10 ml Spritze Luer-Loc SpitzeBD, Becton Dickinson309604
15 ml konische RöhrchenFalcon352097
24-Well-GewebekulturplattenFalcon353935
40µ m cell SiebFisher Scientific22368547
50 ml konische RöhrchenFalcon352098
5 ml serologische PipettenFisher Scientific13-676-10H
60 mm GewebekulturplattenFalcon353002
70 mm m-Zell-SiebFisher Scientific22363548
Alexa Fluor 488 Ziegen-Anti-Maus-IgG (H+L)-SekundärantikörperInvitrogenA11001
Alexa Fluor 488 Ziegen-Anti-Kaninchen-IgM (H+L) SekundärantikörperInvitrogenA21042
Alexa Fluor 488 Ziegen-Anti-Kaninchen-IgM (H+L)-SekundärantikörperInvitrogenA11008
Alexa Fluor 594 Anti-Hühner-IgG (H+L) SekundärantikörperInvitrogenA11042
Anti-O4-Kügelchen - Anti-O4MicroBeadsMiltenyi Biotec130-094-543
Apo-Transferrin humanSigmaT1147
Autofil komplette Flaschenaufsatzfilterbaugruppe, 0,22 μm Filter, 250 mlUSA Scientific6032-1101
Autofil kompletter Flaschenaufsatzfilter Montage, 0,22 μm Filter, 250 mlUSA Scientific6032-1102
B27 NahrungsergänzungsmittelInvitrogen17504-044
BorsäureSigmaB7660
Rinderwachstumsserum (BGS)GE Healthcare Life SciencesSH30541.03
BSAFisher ScientificBP-1600-100
CNTFPeprotech450-50
d-BiotinSigmaB4639
Desoxyribonuklease I (DNAse I)WorthingtonLS002007
EDTAFisher ScientificS311
Epifluoreszenzmikroskop mit einer Olympus DP70 KameraOlympusBx51
Feather EinwegskalpelleAndwin ScientificEF7281C
ForskolinSigmaF6886
Deutsche Glasdeckgläser, #1 Dicke, 12mm Durchmesser rundNeuVitroGG-12-oz
GFAP AntikörperAvesGFAP
GlukoseFisher ScientificD16-1
GlutaMAXInvitrogen35050-61
InsulinInvitrogen12585-014
Magnetabscheiderständer - MACS MultistandMiltenyi Biotec130-042-303
Magnetabscheider-MiniMACS AbscheiderMiltenyi Biotec130-042-302
Millex PES 0.22µ m FiltereinheitMilliporeSLG033RS
Eindeckmedien - Prolong Gold mit DAPIThermo FisherP36930
N-Acetyl-Cystein (NAC)SigmaA8199
Natürliches MauslamininInvitrogen23017-015
Neurobasalmedium AInvitrogen10888-022
Neurotrophin-3 (NT-3)Peprotech450-03
NG2 AntikörperMilliporeAB5320
PapainWorthingtonLS003126
PBS ohne Ca2+ und Mg2+SigmaD5652
PDGFPeprotech100-13A
PetrischalenFalcon351029
Poly-D-LysinSigmaP6407
PrimocinInvivogenant-pm-2
ProgesteronSigmaP8783
PutrescineSigmaP5780
Auswahlsäule-LS SäulenMiltenyi Biotec130-042-401
NatriumselenitSigmaS5261
Spurenelemente BCorning25-000-CI
Trijodthyronin (T3)SigmaT6397
Triton-XSigmaT8787
Trypanblau LösungCorning25-900-CI
Tween 20SigmaP1379
B27NBMA487,75 mL Neurobasales Medium A; 10 mL B27 Ergänzung; 1 ml Primocin; 1,25 ml Glutamax; Filter, sterilisieren und bei 4 Grad lagern; C bis zum Gebrauch.
B27NBMA + 10 % BGS27 mL B27NBMA; 3 mL Rinderwachstumsserum
CNTF-Lösungsbestand (10 & Mikro; g/ml; 1000X)Bestellen Sie bei Peprotech (450-50). Auffüllen mit 0,1 bis 1 mg/ml je nach Hersteller. s Anweisung (kann von Charge zu Charge variieren) in Puffer (z. B. DPBS + 0,2 % BSA). Lagern bei -80 °C.
Arbeitslösung (10 & Mikro; g/ml, 1000X)
1. Mit 0,2 % BSA (Fisher scientific BP-1600-100) in DPBS-Lösung herstellen und mit Filter sterilisieren.
2. Verdünnung des Mastermaterials aliquot auf 10µ g/ml in sterilem, gekühltem 0,2 % BSA/DPBS.
3. Aliquot (20µ L/Tube) und Schockfrosten in flüssigem Stickstoff
4. Lagern Sie Aliquots bei -80 °C.
d-Biotin Stammlösung (50 & Mikro; g/ml; 5000X)Resuspendieren Sie d-Biotin (Sigma-B4639) in doppelt destilliertem H2O bei 50 &; Mikro; g/ml (z. B. 2,5 mg in 50 ml ddH2O). Die Resuspension kann ein gewisses Maß an Rührung/Wirbeln oder eine kurze leichte Erwärmung bei 37 °C erfordern. Wenn das d-Biotin immer noch nicht löslich wird, ist es in Ordnung, ein weniger konzentriertes (z. B. 10µ g/ml) und dem B27NBMA ein höheres Volumen hinzuzufügen (1/1000) anstelle von 1/5000). Bei 4°C lagern.
DNase I Stammlösung1. Bei 12.500 U Desoxyribonuklease I/ml in HBSS auf Eis gekühlt auflösen.
2. Filter auf Eis sterilisieren
3. Aliquot bei 200 µ l und über Nacht bei -20°C.
4 einfrieren. Lagern Sie Aliquots bei -20 bis -30 °C.
Dulbecco' s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (ohne Ca2+ und Mg2+)Beutel in 1 Liter Wasser auflösen, um 1 Liter Medium bei 9,6 Gramm Pulver pro Liter Medium zu erhalten. Bei 2-8 °C lagern.
Forskolin Stammlösung (4,2 mg/ml; 1000X)1 ml steriles DMSO zu 50 mg Forskolin in der Flasche (Sigma-F6886) geben und pipettieren, bis es resuspendiert ist. In ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen umfüllen und 11 ml steriles DMSO hinzufügen, um es auf 4,2 mg/ml zu bringen. Aliquot (z. B. 20 & Mikro; l) und bei -20°C lagern.
Hank' s ausgewogene Salze (HBSS) (Sigma1. Messen Sie 900 ml Wasser (Temperatur 15-20 &Grad; C) in einen Zylinder geben und vorsichtig umrühren.
2. Fügen Sie die Leistung hinzu und rühren Sie, bis sie sich aufgelöst hat.
3. Spülen Sie die Originalverpackung mit etwas Wasser aus, um alle Spuren des Pulvers zu entfernen.
4. Fügen Sie der Lösung in Schritt 2.
5 hinzu. Fügen Sie 0,35 g Natriumbicarbonat (7,5 % w/v) pro Liter Endvolumen hinzu.
6. Rühren Sie weiter, bis es sich aufgelöst hat.
7. Stellen Sie den pH-Wert des Puffers unter Rühren auf 0,1-0,3 Einheiten unter pH = 7,4 ein, da er während der Filtration ansteigen kann. Die Verwendung von 1N HCl oder 1N NaOH wird empfohlen, um den pH.
8 einzustellen. Füge zusätzliches Wasser hinzu, um das Endvolumen auf 1L.
9 zu bringen. Sterilisieren Sie durch Filtration mit einer Membran mit einer Porosität von 0,22 μm.
10. Bei 2-8 °C lagern.
Insulin-Stammlösung (4000 µ g/ml)Tauen Sie die Flasche auf und aliquot 25 µ l pro Mikrozentrifugenröhrchen und bei -20 °C lagern.
LamininlösungLaminin in der Kälte langsam auftauen (2°; C bis 8°; C) um Gelbildung zu vermeiden. Dann aliquotieren Sie in Polypropylenröhrchen. Bei 5° lagern; C bis -20°; C in Aliquoten (z.B. 20 µ l) und nicht wiederholt einfrieren/auftauen. Laminin kann bei diesen Temperaturen bis zu sechs Monate gelagert werden.
die magnetische Zellsortierung (MCS)Bereiten Sie die Lösung vor, die phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit einem pH-Wert von 7,2 und 0,5 % Rinderserumalbumin (BSA), 0,5 mM EDTA, 5 & Mikro; g/ml Insulin, 1 g/l Glukose. Sterilisieren und entgasen Sie den Puffer durch Filtration, indem Sie ihn durch einen 0,22 & Mikro leiten; m Millex-Filter. Lagern Sie den Puffer bei 4°; C bis zur Verwendung
N-Acetyl-L-Cystein (NAC)-Stammlösung (5 mg/ml; 1000X)N-Acetyl-L-Cystein (Sigma-A8199) in einer Dosis von 5 mg/ml in DMEM lösen (z. B. 50 mg NAC in 10 ml B27NBMA). Filter sterilisieren und aliquotieren (z.B. 20 & Mikro; l). Bei -20 °C lagern.
NT3 Stammlösung (1 & Mikro; g/ml; 1000X)Stammbestand:
Bestellung bei Peprotech (450-03). Auffüllen mit 0,1 bis 1 mg/ml je nach Hersteller. s Anweisungen (kann von Charge zu Charge variieren), in Puffer (z. B. DPBS + 0,2 % BSA). Lagern bei -80°C.

Arbeitsbestand (1µ g/ml; 1000X):
1. Mit 0,2 % BSA in DPBS-Lösung herstellen und mit dem Filter sterilisieren.
2. Verdünnung des Hauptmaterials aliquot auf 1 & Mikro; g/ml in sterilem, gekühltem 0,2 % BSA/DPBS.
3. Aliquot (z.B. 20µ L/Tube) und Schockfrosten in flüssigem Stickstoff
4. Lagern Sie Aliquots bei -80°C.
PDGF Stammlösung (10 & Mikro; g/ml; 1000X)Stammlager:
Bestellung bei Peprotech (100-13A). Auffüllen mit 0,1 bis 1 mg/ml je nach Hersteller. s Anweisungen (kann von Charge zu Charge variieren) in Puffer (z. B. DPBS) + 0,2 % BSA). Lagern bei -80°C.

Arbeitsbestand (1µ g/ml; 1000X):
1. Mit 0,2 % BSA in DPBS-Lösung herstellen und mit dem Filter sterilisieren.
2. Verdünnung des Hauptmaterials aliquot auf 1µ g/ml in sterilem, gekühltem 0,2 % BSA/DPBS.
3. Aliquot (z.B. 20µ L/Tube) und Schockfrosten in flüssigem Stickstoff
4. Lagern Sie Aliquots bei -80°C.
Poly-D-Lysin (1 mg/ml; 100X)Resuspendieren Sie Poly-D-Lysin, Molekulargewicht 70-150 kD (Sigma P6407) bei 0,5 mg/ml in 0,15 M Borsäure pH 8,4 (z. B. 50 mg in 50 ml Boratpuffer). Filter sterilisieren und aliquotieren (z.B. 100µ l/Rohr). Bei -20 °C lagern. Vor der Verwendung den 100-fachen Vorrat (1 mg/ml) auf 50 μm verdünnen; g/ml in sterilem Wasser.
Oligodendrozyten-Proliferationsmediensiehe Ergänzende Tabelle 1
Oligodendrozyten-Differenzierungsmediensiehe Ergänzende Tabelle 1
Sato-Ergänzung (100X)siehe Ergänzende Tabelle 1
Referenzen: Die Liste der Reagenzien und Rezepte wurde aus den zuvor von Emery et. al. 2013 beschriebenen Protokollen übernommen (Emery, B. & Dugas, J. C. Reinigung von Zellen der Oligodendrozytenlinie aus Mausrinde durch Immunpanning. Kalte Quelle Harb Protoc. 2013 (9), 854-868, doi:10.1101/pdb.prot073973, (2013)) und Dincman et. al. (Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S. & Whittemore, S. R. Isolierung von kortikalen Maus-Oligodendrozyten-Vorläuferzellen. J Neurosci-Methoden. 209 (1), 219-226, doi:10.1016/j.jneumeth.2012.06.017, (2012))
Puffer für

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