Visualisierung von motorischen Axon Navigation und Quantifizierung der Axon Arborization In Mausembryonen mit Fluoreszenz-Lichtblattmikroskopie

Spinale MNs sind der Teil des zentralen Nervensystems aber innervieren peripheren Muskeln, um die Bewegung zu kontrollieren. Entwickelnden Rückenmarks sind nach den Signalen aus der Chorda und angrenzenden Somiten MN Stammväter (pMNs) gegründet. Alle differenziert nach dem mitotischen MNs entstehen dann von pMNs, was schließlich zu einer Reihe von MN Subtypen der Rostrocaudal Achse des Rückenmarks^1,2. Spinale MNs sind topographisch und anatomisch gut organisiert. Ihre morphologische Anordnung korreliert mit der Position von ihrem jeweiligen Ziel in der Peripherie-³. Bei ihren Muskel-Ziele zu erreichen, Axone erhalten zellularen und exogene neurotrophen Faktoren, die bewegen sie zum Erweitern und verzweigen weiter in die Muskeln. Innervation und verzweigte Mängel können zum Versagen, neuromuskuläre Kreuzungen (NMJ) bilden beitragen. Z. B. Glia-derived neurotrophen Faktoren (GDNF)-induzierte Pea3 ist unverzichtbar für Axon Arborization in kutane Maximus (CM) und Latissimus Dorsi (LD) Muskeln^4,5. Darüber hinaus zeigen DINE -Knockout-Maus-Embryonen defekt Arborization phrenicus Nerven des Zwerchfells, wodurch respiratorische Insuffizienz und Sterblichkeit unmittelbar nach Geburt^6,7. Daher ist dieser letzte Schritt der MN Reifung (d.h., axonale Projektion und Verzweigung) entscheidend für die Kommunikation zwischen Neuronen und Zielzellen zu gewährleisten.

Um Arborization Muster zu sehen, führen die Forscher normalerweise konfokale Bildgebung oder zwei-Photonen-Fluoreszenz Lichtmikroskopie geschnitten oder ganz-Mount Proben^8,9,10. Beide dieser Mikroskopie-Techniken erzeugen akzeptable Auflösung und Tiefe Penetration. Zwei-Photonen-Fluoreszenz Lichtmikroskopie beinhaltet Erregung des Fluorophore durch gleichzeitige Aufnahme von zwei energieärmeren Photonen¹¹. Da zwei-Photon Erregung Nah-Infrarot-Strahlung verwendet, trägt die verminderte Erregerfrequenz reduzierte Streuung und bessere Gewebe eindringen bis zu 1 mm im Gewebe, wodurch die Bildgebung mit größerer Tiefe. Konfokalen Mikroskopie wird durch Filter, die der Out-of-Focus-Signale und sammelt nur Licht in die Brennebene^12,entfernt. Mit diesem Ansatz können Bilder von Proben aus verschiedenen fokalen Ebenen kombiniert werden, um ein dreidimensionales (3D) Bild über eine Z-Stapel-Funktion zu produzieren. Dennoch wird Signalintensität reduziert, da die meisten des Lichtes ist blockiert und hohe numerische Öffnungen die Depth of Field verdecken. Noch wichtiger ist, beitragen beide Techniken zur schweren lichtbedingten und Phototoxizität, da die gesamte Probe Beleuchtung erhält, selbst wenn nur in einer Ebene zu einem bestimmten Zeitpunkt abgebildet wird.

Um diese Unzulänglichkeiten zu umgehen, ist LSFM eine bevorzugte Alternative, mit den Vorteilen des Seins schnelle, effiziente Licht- und weniger phototoxische^13,14geworden. Darüber hinaus ermöglicht LSFM MV Bildgebung. Dieser Ansatz eignet sich besonders zur motorischen Axone und ihre Dispergier-Terminals zu visualisieren, wie sie durch den 3D Raum zu verbreiten. LSFM übertrifft die anderen beiden Optionen, weil Proben auf einer Bühne, die Drehung um eine vertikale Achse und Bewegungen entlang der x-, y- und Z-Achsen ermöglicht, montiert sind. Dieses Set-up ermöglicht nicht nur minimal blockierte Blick auf die Probe, sondern auch die Wahl eines Pfades wünschenswert Beleuchtung, ein Manko der zwei-Photonen und konfokale Mikroskopie, beide in der Montage von Proben auf einer flachen Folie benötigen. LSFM ist daher das am besten geeignete Werkzeug für die 3D Darstellung von Axon Arborization und zur Quantifizierung der motorische Nerv Terminals in mausembryonen.

Alle lebende Tiere wurden in einen spezifischen Erreger frei (SPF) Tierhaus, zugelassen und beaufsichtigt durch die IACUC der Academia Sinica gehalten.

1. Fixierung

1. Embryonen von embryonalen Tag 12,5 (E12.5) sammeln dann enthaupten und sie Ausweiden.
2. Befestigen Sie die Embryonen individuell 24-Well-Platten mit 1 mL/auch der frisch zubereitete 4 % Paraformaldehyd in 1 x Phosphat-Puffer Kochsalzlösung (PBS) über Nacht. Inkubieren Sie bei 4 ° C in einen Shaker geben.
3. Die festen Embryonen mindestens 3 x, jeweils für ca. 5-10 min, mit 1 mL 1 X PBS waschen und Inkubation über Nacht bei 4 ° C auf einem Boston-Shaker, der restliche Paraformaldehyd zu entfernen.

2. gesamte-Mount Immunostaining

1. Jeder Embryo in 1 mL 0,5 % permeabilize PBS-Triton-X-100 (PBST) über Nacht bei 4 ° C in einen Shaker geben.
2. Jede Probe mit 1 mL 10 % bereitete FBS in 1 X PBS über Nacht bei 4 ° C auf einem Boston-Shaker zu blockieren.
3. Inkubieren Sie den Embryo mit 1 mL Anti-GFP Primärantikörper (1:1, 000 Verdünnung in 10 % FBS) bei 4 ° C für 72 h mit ständigen Zittern um das GFP-Signal des motorischen Nerven zu intensivieren.
4. Nach der Inkubation Primärantikörper zu waschen, mit 1 mL 0,5 % PBST im Laufe von 1-2 Tagen bei 4 ° C auf einem Shaker, ändern die 0,5 % PBST mindestens dreimal.
5. 1 mL der Sekundärantikörper anwenden (1:1, 000 Verdünnung in 10 % FBS) und inkubieren Sie über Nacht im Dunkeln bei 4 ° C mit konstanter schütteln.
6. 3 X mit 1 mL 0,5 % waschen PBST bei 4 ° C auf einem Boston-Shaker im Laufe von 2-3 Tagen. Halten Sie Proben mit 1 X PBS-Puffer bei 4 ° C bis zum Vortag der Bildgebung.
   Hinweis: Embryonen können in kleinere Segmente vor der Lichtung, seziert werden, je nachdem, welcher Teil der Embryonen abgebildet werden. Vorderbeine sind in diesem versuchsansatz (Abbildung 1A) erhalten.
7. Inkubieren Sie den Embryo in einem kommerziellen Clearing-Reagenz mit einem Brechungsindex von 1,49 nD in einer 1,5 mL Tube, lichtgeschützt bei Raumtemperatur über Nacht, um den Embryo für die Bildgebung transparent zu machen.
   Hinweis: Die Lautstärke des Clearing-Reagenz ist etwa fünf Mal das Probenvolumen.

(3) LSFM (2 – 3 h)

1. Probe-Set-up
   1. Einrichten von 5 X / 0.1 Beleuchtungsoptik und 5 X / 0,16 Erkennung Optik. Montieren Sie der Probenhalter und Probe Kapillare (1,5 mm Innendurchmesser, grün) und legen Sie sie in das Mikroskop.
      Hinweis: Beziehen sich auf des Mikroskops Bedienungsanleitung für detaillierte Set-up-Verfahren.
   2. Montieren Sie den Embryo wie folgt:
      1. Bereiten Sie die PIPETTENSPITZE P200 durch den oberen Teil wegschneiden, so dass es den Durchmesser der Kapillare passt und entfernen Sie den Spitzen Teil (~ 3 mm) für die Beispiel-Anlage.
      2. Schmelzen Sie abgeschnittenen Ende der Pipettenspitze mit einer kleinen Flamme.
      3. Löschen der Flamme und schnell Befestigen des Embryos vertikal auf das geschmolzene Ende.
      4. Passen Sie den oberen Teil des die PIPETTENSPITZE mit der Probe Kapillare.
   3. Erlauben Sie des Kammer-Puffers, mit dem Embryo für 1 min, klar aus Schutt oder Luftblasen equilibrate.
   4. Über die imaging-Software, wählen Sie Locate Kapillare unter der Registerkarte " Suchen " und passen Sie die X, y, Z-Achsen, die Probe Kapillare zu positionieren.
   5. Wählen Sie Locate Probe und Zoomen Sie, um 0,6 X auf den Embryo zu konzentrieren. Drehen Sie den Embryo um sicherzustellen, dass die Längsachse des abgebildeten Gliedes mit den Lichtweg der zwei Lichtquellen (Abbildung 1 b) richtet.
2. Bildaufnahme
   1. Unter der Registerkarte " Übernahme " der Lichtweg Parameter wie Erkennung Ziele definieren, laser-blocking Filter, Strahlteiler, Kameras und Lasern.
      Hinweis: Der GFP-Kanal wird in diesem Experiment verwendet (Erregung Wellenlänge: 488 nm; Emission Filter: BP 505, 545 nm, Strahlteiler: SPS LP 560).
   2. Das Kontrollkästchen Sie Pivot-Scan für Schatten-Reduktion.
   3. Definieren Sie die Einstellungen der Akquisition: bit-Tiefe, 16-Bit; Zoom, 0,36-0,7 X; einseitige Beleuchtung (links/rechts) oder Dual-Side-Beleuchtung.
   4. Klicken Sie auf fortlaufend und legen Sie die Laserintensität, Belichtungszeit, Laserleistung und leichte Blatt Position um schärfere Bilder zu erwerben.
      Hinweis: Die Laserleistung bleibt so gering wie möglich zu lichtbedingten zu minimieren.
   5. Drücken Sie STOP um Ende Bildaufnahme.
3. Mehrdimensionale Erfassung
   1. Definieren Sie die Z-Stapel durch die Z-Position für das erste und letzte Bild verschieben. Klicken Sie auf Optimal um die Slice-Nummer festzulegen.
   2. Klicken Sie auf Experiment starten , um die ausgewählten Z-Stapel zu erwerben.
   3. Wenn es fertig ist, speichern Sie das Bild im .czi-Format.
4. Bildverarbeitung (optional)
   1. Fahren Sie mit der doppelten Seite Fusion unter dem Ärmelkanal Lichtscheibe Verarbeitung , wenn Dual-Side Beleuchtung angewendet wird. MultiView Verarbeitung ist erforderlich, wenn mehrere Ansichten erworben werden, um Bilder aus unterschiedlichen Blickwinkeln zu kombinieren.
   2. Erstellen Sie ein 2D-Bild mit Daten aus der höchsten Intensität Pixel entlang der Projektion-Achse unter der Maximalen Intensität Projektion -Kanal.
   3. Klicken Sie unter Kopie Kanal Teilmenge um Teilmengen von Bildern aus der ursprünglichen Gruppe auszuwählen.

(4) Quantifizierung der Axon Arborization (30 Min für jeden einzelnen Nerv)

1. Öffnen Sie die Bilddatei in der bildgebenden Analysesoftware (standardmäßig das Bild mit den XYZ-Daten ist geöffnet im Surpass-Modus sowie eine 3D-gerenderte Ansicht).
2. Passen Sie das Bildfarbe, Helligkeit und Kontrast Displayanpassung Fenster (Bearbeiten | Displayanpassung zeigen), Filamente, die basierend auf lokalen Intensität Kontrast zu erkennen.
3. Klicken Sie auf das Symbol Hinzufügen neue Filamente und wählen Sie den Autopath (kein Loop) -Algorithmus in der Drop-Down-Menü.
4. Wählen Sie die Region von Interesse (in diesem Fall, die Segmentierung Axon von Interesse). Klicken Sie auf nächste Wenn Sie fertig sind.
5. Definieren Sie die Start- und Samen Punkte zuweisen die größten und dünnste Durchmesser Messungen, die mit dem Slice -Modus gemessen werden kann.
6. Weisen Sie einen Ausgangspunkt am Rand der Region von Interesse. Um manuell hinzufügen oder Entfernen von Ausgangspunkte zu erreichen, ändern Sie zunächst den Zeiger-Modus (Navigate | Wählen Sie) und dann bei gedrückter Umschalttaste mit der rechten Maustaste auf die Punkte des Interesses.
7. Wählen Sie manuelle Schwellenwerte für Kontrollpunkte um sicherzustellen, dass alle sichtbaren Arborization markiert ist. Ändern Sie den Zeiger-Modus (Navigate | Wählen Sie) und dann Shift + Linksklick auf die Punkte des Interesses, manuell hinzufügen oder Entfernen von Ausgangspunkten.
   Hinweis: Es ist wichtig, manuell Hintergrundgeräusche und Signale von benachbarten Nerven entfernen.
8. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Kontrollpunkte um Ansatzpunkte zu entfernen.
9. Überprüfen Sie, um Ausgrenzung von Punkten zu ermöglichen, sind zu weit weg und darstellen, die Hintergrundgeräusche, Entfernen Segmente getrennt . Geben Sie die Maximallänge der Lücke im nächsten Schritt definieren die Obergrenze für den Ausschluss.
10. Passen Sie den Schwellenwert für Hintergrundabzug, die einen Gauß-Filter verwendet, um die hintergrundintensität jedes Voxel zu schätzen.
11. Festlegen Sie automatische Schwellenwert für Dendrit Durchmesser mit dem ungefähren Querschnitt Algorithmus.
12. Überspringen Sie die Schritte für die Berechnung der Wirbelsäule.
13. Beenden Sie den Vorgang, und wählen Sie den gewünschten Stil und Farbe.
14. Deaktivieren Sie die Kontrollkästchen der Lautstärke in Eigenschaften , um nur die rekonstruierten Axone anzuzeigen.
15. Wählen Sie unter der Registerkarte " Statistik " detailliert. Verwenden Sie Filament Nein. Dendrit Terminal Punkte zu die motorischen Nerv Klemmen als Indikator für motor Axon Arborization zu quantifizieren.
    Hinweis: Statistische Anmerkungen hinzugefügt werden kann falls gewünscht.
16. Exportieren Sie das Bild der rekonstruierten Axon als .tif Datei.

LSFM bietet detaillierte 3D Visualisierung von MN Flugbahn und Axon Arborization Maus Embryonen. Unter Hellfeld erscheinen nach dem Eintauchen in das kommerzielle Clearing-Reagenz Gewebe vollständig transparent. Keine Schrumpfung oder Schwellung der Probe wurde nach der Lagerung bei der Aufklärung von Reagenz vor Bildgebung bis zu einer Woche bemerkt. Unter Fluoreszenz Kanal sind Motoneuronen mit Transgen ausgedrückt GFP (Film 1) gekennzeichnet. In einer Instanz sind Details der Axon Struktur gefährdet. Abbildung 2 stellt beispielsweise niedrige Bildqualität. Mehrere Faktoren können Abbildungsqualität behindern. Erstens können nicht genügend Permeabilisierung und Waschschritte zu hohen Hintergrundsignal führen. Zweitens wird Lichtstreuung durch unzureichend geräumte Gewebe in unscharfen Bildern führen. Zu guter Letzt könnte suboptimale Probe Positionierung während der Bildaufnahme Lichtstreuung zu erhöhen oder den Lichtweg zu blockieren.

Zu Bild Axon Arborization ausführlicher und Quantifizierung durchführen Vergrößerung eingestellt werden so dass jede fein verzweigten Struktur offenbart (Movie 2). Bilder von Single - und Dual-Side Beleuchtung sollten verglichen werden, um die optimale Auflösung der Arborization Muster (Abbildung 3) bestimmen. Imaging Analysesoftware kann dann verwendet werden, Axon Arborization Muster für individuelle vordergliedmaße Nerven (Abbildung 4) zu rekonstruieren. Definieren Sie den Startpunkt und den Durchmesser für Saatgut Erkennung, können diese verzweigten Strukturen semi-automatisch erkannt und berechnet während Hintergrund Signale manuell entfernt werden. Wir nutzten die "Filament – No. Dendrit Terminal Pts"Mode-Funktion den gesamten motor nervenausgänge der einzelnen Nerven als Indikator für motor Axon Arborization berechnen. Darüber hinaus können Zweig Länge, Durchmesser und Volumen mit "Filament – Dendrit Länge", "Filament – Dendrit bedeuten Durchmesser" und "Filament – Dendrit Volumen", bzw. berechnet werden.

Abbildung 1: grafische Darstellung des Probe-Set-up. (A) während der Probenvorbereitung, Embryonen sind zunächst enthauptet und ausgeweidet. Vorderbeine sind entlang der gestrichelten Linie durchschnitten. (B) In die Probenkammer Proben sind positioniert, um die gesamte Region of Interest entlang den Lichtweg zu halten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Movie 1: leichte Blech-Fluoreszenz-Mikroskopie eine große Sichtfeld der oberen Hälfte der Embryo E12.5 transgenen Maus (Hb9::GFP). Der Film zeigt deutlich die motorische Nerven aus dem Rückenmark an ihre innervating Ziele zu projizieren. Das 3D-Bild ist zunächst unter 0,3 erworben X Vergrößerung mit Beleuchtung und 30 ms Belichtungszeit einseitig und später zu Video mit Bildanalyse-Software verarbeitet wird. Maßstabsleiste stellt 500 µm. Bitte klicken Sie hier um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)

Abbildung 2: Beispiel für eine niedrige Bildqualität mit hoher Hintergrundsignal und unscharfen Regionen (blaue Pfeile). Die unsachgemäße Schritte während der Probe Vorbereitung und Bild Akquisition führen zu eingeschränkter Bildqualität, die Genauigkeit der alle nachfolgenden Quantifizierung der Axon Arborization zu gefährden. Maßstabsleiste im Bild repräsentiert 200 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Movie 2: Visualisierung der E12.5 vordergliedmaße Nerven unter 488 nm Anregung mit Dual-Side-Beleuchtung bei einer Vergrößerung von 0,6 x. Der vergrößerten Film ermöglicht klare und Panorama Visualisierung jedes fein verzweigten Strukturen auf einzelne Nerven. Maßstabsleiste vertritt 300 µm. Bitte klicken Sie hier um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)

Abbildung 3: Vergleich zwischen Single - und Dual-Side Beleuchtung. Linke und Rechte Illuminationen Detailanzeige bestimmter Regionen nur (rote Pfeile), während ein kombiniertes Bild von Dual-Side Illuminationen ein umfassenderes Bild des Musters Arborization bietet. Einseitige Beleuchtung kann jedoch in kürzerer Zeit bildgebenden und manchmal mit besserer Bildqualität erreicht werden. Dies ist die Beleuchtung Pfade von beiden Seiten nicht perfekt auf einer Ebene, was zu Unschärfe bei Dual-Side Illuminationen liegen können. Bilder werden als maximale Intensität Projektion gezeigt. Maßstabsleiste stellt 200 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 4: Axon Arborization der einzelnen vordergliedmaße Nerven, farblich wie folgt rekonstruiert: suprascapular (rot), axillaris (rosa), Radial (blau), hintere brachial kutane (lila). Arborization Komplexität wurde entsprechend der Anzahl der terminal Endpunkte erkannt, mit unseren semi-automatischen Methode berechnet. Autopath (kein Loop) Algorithmus zeichnet Filamente und erkennt Kontrollpunkte von frei definierbaren Ausgangspunkten. Maßstabsleiste in beiden Bildern stellt 200 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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