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Methodenartikel

Adeno-assoziierten Virus-vermittelte Lieferung von CRISPR für kardiale gen Bearbeitung bei Mäusen

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DOI:

10.3791/57560

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2. August 2018

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1Department of Surgery, Davis Heart and Lung Research Institute, Biomedical Sciences Graduate Program, Biophysics Graduate Program, Ohio State University Wexner Medical Center

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll zur Durchführung kardiale gen bearbeiten in Vivo in Mäusen mit rekombinanten Adeno-Associated Virus (rAAV)-Lieferung von CRISPR vermittelt. Dieses Protokoll bietet eine vielversprechende therapeutische Strategie zur Behandlung von Dystrophischen Kardiomyopathie in Duchenne-Muskeldystrophie und kann verwendet werden, um Herz-Kreislauf-spezifische ko in postnatale Mäuse zu erzeugen.

Zusammenfassung

Die gruppierte, regelmäßig dazwischen, kurze, palindromische wiederholende (CRISPR) System hat Genom Engineering in kultivierten Zellen und Organismen aus einer Vielzahl von Arten erheblich erleichtert. Die CRISPR-Technologie ist auch als neuer Therapeutika für eine Reihe von Krankheiten beim Menschen untersucht worden. Proof-of-Concept-Daten sind sehr ermutigend, wie jüngste Studien, die die Machbarkeit und Wirksamkeit von gen bearbeiten-basierte Therapieansatz für Duchenne-Muskeldystrophie (DMD) mit einem Mausmodell zeigen. Intravenöser und intraperitonealer Injektion von recombinant Adeno-assoziierte Virus (rAAV) Serotyp rh.74 (rAAVrh.74) hat vor allem effiziente kardiale Bereitstellung von Staphylococcus Aureus CRISPR-assoziierten Protein 9 (SaCas9) und zwei aktiviert. Guide RNAs (gRNA) um eine genomische Region mit einem mutierten Codon in Exon 23 der Maus Dmd gen zu löschen. Diese Vorgehensweise kann auch verwendet werden, knock out das Gen des Interesses und ihrer Herzfunktion bei postnatalen Mäusen zu studieren, wenn die gRNA der kodierende Region des Gens ansprechen soll. In diesem Protokoll zeigen wir im Detail, wie rAAVrh.74-CRISPR Vektor zu konstruieren und hocheffiziente kardiale Lieferung bei Neugeborenen Mäusen zu erreichen.

Einleitung

Die gruppierte, regelmäßig dazwischen, kurze palindromische wiederholende (CRISPR) Technologie stellt die neueste Weiterentwicklung im Genom Engineering und revolutioniert die derzeitige Praxis der Genetik in Zellen und Organismen. CRISPR-basierte Genom-Bearbeitung nutzt einen einzigen Leitfaden RNA (gRNA) eine CRISPR-assoziierten Endonuklease wie CRISPR-assoziierten Protein 9 (Cas9) leiten und Cpf1 zu einem genomische DNA-Ziel, die in Folge der Protospacer ergänzt durch die gRNA mit kodiert ein spezifische Protospacer angrenzenden Motiv (PAM)1,2. PAM ist abhängig von der bakteriellen Spezies des Gens Cas9 oder Cpf1. Die am häufigsten verwendeten Cas9-Nuklease abgeleitet von Streptococcus Pyogenes (SpCas9) erkennt eine PAM-Sequenz von NGG, die direkt hinter der Zielsequenz in der genomischen DNA auf Nichtziel-Strang gefunden wird. An der Ziel-Site generieren die Cas9 und Cpf1 Proteine eine Doppel-Strang-Pause (DSB), die dann über intrinsische zelluläre DNA-Reparaturmechanismen einschließlich nicht-homologe Ende verbinden (NHEJ) und unter der Regie von Homologie Reparatur (HDR) Wege3repariert wird, 4. In Ermangelung einer DNA-Vorlage für homologe Rekombination der DSB in erster Linie Reparaturen durch die fehleranfällige NHEJ Weg, die Einfügungen oder Löschungen (Indels) führen kann von Nukleotiden Frameshift-Mutationen verursacht, wenn die DSB in der Kodierung erstellt wurden Region ein gen5,6. So hat das CRISPR-System verbreitet, Verlust der Funktion Mutationen in verschiedenen zellmodellen und ganze Organismen zu entwickeln um die Funktion eines Gens zu untersuchen. Darüber hinaus die katalytisch inaktive Cas9 und Cpf1 wurden entwickelt, um einen transcriptionally und epigenetisch modulieren Ausdruck Ziel Gene7,8.

In jüngerer Zeit, SpCas9 und SaCas9 (abgeleitet von Staphylococcus Aureus) verpackt in recombinant Adeno-assoziierte Virus (rAAV) Vektoren für postnatale gen Korrektur im Tiermodell von menschlichen Krankheiten, insbesondere Duchenne Muskeldystrophie (DMD)9,10,11,12,13,14,15. DMD ist eine tödliche X-chromosomal rezessiv-Krankheit verursacht durch Mutationen im DMD -gen, das Dystrophin-Protein16,17kodiert, betrifft etwa 1 in 3500 männlichen Geburten nach Neugeborenen-Screening18 , 19. zeichnet sich durch fortschreitende Muskelschwäche und verschwenden. Die DMD-Patienten verlieren in der Regel die Fähigkeit, zwischen 10 und 12 Jahre alt und sterben der Atemwege und/oder kardiale Versagen im Alter von 20-30 Jahre20gehen. Insbesondere entwickelt Kardiomyopathie > 90 % der DMD-Patienten und stellt die führende Ursache des Todes in DMD-Patienten21,22. Obwohl Deflazacort (ein Anti-Entzündung Medikament) und Eteplirsen (ein Exon-skipping Medizin zum Skippen von Exon 51) vor kurzem für DMD durch die Food and Drug Administration (FDA)23,24, keine dieser Behandlungen genehmigt wurden den genetischen Defekt auf der genomischen DNA-Ebene zu korrigieren. Die MDX-Maus, die eine Punktmutation in Exon 23 das Dystrophin-gen trägt, wurde weithin als eine DMD Modell25eingesetzt worden. Darüber hinaus haben wir zuvor gezeigt, dass funktionelle Dystrophin Ausdruck durch-Frame Löschen der genomic DNA für Exons, 21, 22 und 23 in der Skelettmuskulatur Mdx Mäuse mit intramuskulären Ad-SpCas9/gRNA9 wiederhergestellt wurde , und in der Herzmuskulatur Mdx/Utrophin+ /- Mäuse mit intravenöser und intraperitonealer rAAVrh.74-SaCas9/gRNA Lieferung26.

In diesem Protokoll beschreiben wir im Detail jeden Schritt bei der postnatalen kardiale gen Bearbeitung um Dystrophin in Mdx/Utrophin+ /- Mäuse mit rAAVrh.74-SaCas9/gRNA Vektoren von gRNA Design Dystrophin-Analyse in den Herz-Muskel-Abschnitten wiederherzustellen.

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Protokoll

Die in diesem Protokoll verwendeten Tiere wurden an der Ohio State University Labor Tier Ressourcen entsprechend Tiernutzung Richtlinien gewartet. Alle Tierversuche wurden von den institutionellen Animal Care, Verwendung und Review Committee der Ohio State University genehmigt.

1. Design und Klonen von gRNAs in den CRISPR-Vektor

  1. Wählen Sie 2 gRNAs targeting Dystrophin Intron 20 und Intron 23 (i20 und i23) für SaCas9: i20: 5'-GGGCGTTGAAATTCTCATTAC CAGAGT und i23: 5'-CACCGATGAGAGGGAAAGGTC CTGAAT (die PAM-Sequenz ist unterstrichen und kursiv).
    Hinweis: Die Ziel-Sites für i20 und i23 sind etwa 23 Kilo Basenpaare (Kbp) entfernt. Um eine kodierende gen stören, zwei gRNAs Ausrichtung auf den gemeinsamen Exons mit der NNGRRT PAM Sequenz für SaCas9 (vorzugsweise NNGAAT, NNGGGT und NNGAGT) und Entfernung innerhalb 20 Kbp empfohlen.
  2. Verwenden Sie die folgenden PCR-Parameter um zu tempern gRNA Oligos (100 µmol/L) 1 x glühen Puffer (5 x glühen ausgleichslagers enthält 0,5 Mol/L K-Acetat, 150 Mmol/L HEPES-KOH, 10 Mmol/L Mg-Acetat, pH7.4): 95 ° C 10 min 90 Zyklen von 95 bis 59 ° C mit einem 0,4 ° C sinken pro Zyklus für 20 s, 90 Zyklen von 59 bis 32 ° C mit einem Rückgang um 0,3 ° C pro Zyklus für 20 s, 20 Zyklen von 32 bis 26 ° C mit einem Rückgang um 0,3 ° C pro Zyklus für 20 s.
  3. Verbinden der geglühten gRNA Oligos in der pX601-CMV-SaCas9-mPA-U6-gRNA mit BsaI und T4 DNA-Ligase in einer Reaktion (1 µL 50 ng/µL pX601-CMV-SaCas9-mPA-U6-gRNA, 1 µL 1 µL geglüht Oligos, 1,5 µL 10 X T4 DNA-Ligase Puffer, 0,5 µL T4 DNA-Ligase BsaI, 10 µL DdH2O ), mit der folgenden Reaktion Bedingung in einem PCR Cycler: 5 Zyklen von [37 ° C 5 min und 16 ° C 10 min.]; 37 ° C 20 min; 80 ° C 5 min.
  4. 15 µL Ligatur Produkt in 30 µL kompetente Zellen verwandeln, die Zellen in der Agarplatte mit 100 µg/mL Ampicillin und Kultur bei 37 ° C für 24 h-Platte.
  5. 5-10 Kolonien und Kultur in LB-Medium mit 100 µg/mL Ampicillin bei 37 ° C, 250 u/min in einem Shaker-Inkubator für ca. 3-4 h abholen.
  6. Die Kolonien durch PCR-Bildschirm: 10 µL 2 x PCR-master-Mix, 8 µL DdH2O, 1 µL E. Coli Kultur, 1 µL 10 µmol/L U6-Forward Primer, 1 µL i20 oder i23 gRNA-rückwärts-Primer. Die PCR-Radsport-Parameter: 95 ° C 5 min, 35 Zyklen von 95 ° C 30 s, 61 ° C 30 s, 72 ° C 30 s.
  7. 5 mL Kultur der positive Klone durch Hinzufügen von 4 mL frisches LB mittlere containing100 µg/mL Ampicillin und Kultur über Nacht bei 37 ° C, 250 u/min vorzubereiten.
  8. Das Plasmid DNA mit dem entsprechenden Plasmid Extraktion Kit zu reinigen, und überprüfen Sie das Plasmid von Sanger-Sequenzierung mit der U6-Forward Primer.
  9. Kultur C2C12 Zellen in DMEM mit 10 % FBS und 1 % ergänzt Pen-Strep bis ~ 70 % Konfluenz zu Testzwecken das Gen Wirksamkeit der Plasmide Bearbeitung zu erreichen.
  10. Electroporate insgesamt 5 µg SaCas9/gRNA Plasmid Mischung im Molverhältnis 1:1 in 1 x 106 C2C12 Zellen laut Protokoll des Herstellers.
  11. Ernten Sie nach 48 h nach Transfektion die C2C12 Zellen und extrahieren Sie genomischen DNA.
  12. Einsatz 100 ng genomischer DNA als Vorlage die PCR-Reaktion für Maus Dystrophin Locus durchführen: forward Primer 5'-GGCCAAAGCAAACTCTGGTA (1 µL 10 µmol/L), reverse Primer 5'-TTTAATCCCACGTCATGCAA (1 µL 10 µmol/L), 10 µL 2 x Grüne PCR master Mix, 7 µL ddH2O, genomische DNA (1 µL 100 ng). Verwenden Sie PCR Radfahren Bedingungen als 95 ° C 5 min, 35 Zyklen [95 ° C 30 s, 61 ° C 30 s, 72 ° C 30 s], 72 ° C 2 min.

(2) rAAV Produktion

  1. Um die Zellen zu Kultur, seed AD293 Zellen auf 20 bis 40 15 cm Gerichte und pflegen in DMEM mit 10 % FBS und 1 % ergänzt Pen-Strep bis hin zu ca. 90 % Konfluenz zur Transfektion.
  2. Verdünnen Sie 3 Plasmide mit 200 µL reduziert Serum Medium (pro Schale): 1) 10 µg pHelper; (2) 5 µg pXR (rh.74 oder andere Serotypen) und 3) insgesamt 5 µg pX601 i20 und pX601-i23-Gemisch (Verhältnis 1:1). Führen Sie Polyethylenimine (PEI) Transfektion durch Mischen mit 80 µL PEI und Inkubation bei Raumtemperatur für 10 min. hinzufügen die Mischung auf die AD293-Zellkulturen in gewissem Sinne tropfenweise.
  3. Verwenden Sie für AAV Virus Produktion, nach 72 h Post Transfection Schabeisen Zelle, um die Medien und die AD293 Zelle Pellets durch Zentrifugation bei 1100 X g für 10 Minuten zu sammeln.
  4. Aufzuwirbeln Sie die Zelle-Pellets in 15 mL rAAV Lyse Puffer (50 Mmol/L Tris-Base, 150 Mmol/L NaCl, pH 8,5), gefolgt von 3 Gefrier-tau-Zyklen mit abwechselnden Inkubation in flüssigem Stickstoff und 42 ° C Wasserbad. Speichern Sie die Zelle Lysates bei-80 ° C für die zukünftige Bearbeitung, wenn sie nicht sofort verarbeitet werden.
  5. Filtern Sie die Nährmedien mit einem 0,45-µm-Filter und fügen Sie eine 40 % PEG8000 in 2,5 Mol/L NaCl, eine Endkonzentration von 8 %. Inkubieren Sie die Mischung bei 4 ° C für 1 h und Zentrifuge bei 1100 X g für 15 min.
  6. Aufschwemmen Sie die Pellets in rAAV Lyse Puffer und kombinieren Sie mit Zelle Lysates aus Schritt 2.3, gefolgt von Benzonase (50 U/mL) Behandlung bei 37 ° C für 1 h.
  7. Zentrifugieren Sie der Benzonase behandelt rAAV mit Mischung 1100 X g für 15 min bei 4 ° C, und speichern Sie den überstand (grobe rAAV-Vorbereitung).

(3) rAAV Reinigung und Konzentration

  1. Laden Sie die grobe rAAV-Vorbereitung auf einer Iodixanol Steigung in einer Ultrazentrifuge Röhre in der folgenden Reihenfolge von oben nach unten: grobe AAV lysate (~ 15 mL), 8 mL 15 % Iodixanol, 6 mL 25 % Iodixanol, 5 mL 40 % Iodixanol, 5 mL 58 % Iodixanol. Füllen Sie die leeren Restvolumen des Rohres an der Spitze mit 1 X DPBS.
  2. Zentrifugieren Sie die Proben bei 230.000 x g in einer Ultrazentrifuge Rotor für 120 min. bei 10 ° C und sammeln Sie 3 – 4 mL der 40 % Steigung Bruch mit den rAAV-Partikeln mit einer 18 G-Nadel zu.
  3. Verdünnen Sie die rAAV-Partikel mit 1 X DPBS und Zentrifuge mit Hilfe der Zentrifugalkraft Filtereinheit (MWCO 100 kDa). Wiederholen Sie diesen Schritt für 3 - 5 Mal und schließlich die rAAV-Vorbereitung, 300-500 µL zu konzentrieren.

4. rAAV verschoben

  1. Extrahieren Sie die genomische DNA aus 2 µL konzentriert rAAV, Niederschlag mit 3 M NaOAc in Ethanol und in 20 µL DdH2O. Aufschwemmen
  2. Die Standardkurve für rAAV Quantifizierung durch serielle Verdünnung des Plasmids pX601 erhalten: 1 x 109, 1 x 108,1 x 107, 1 x 106, 1 x 105 Exemplare in jeweils 10 µL DdH2O. verdünnt DNAase behandelt rAAV Proben als 01:10, 01:50, 1: 100 und 1: 1000.
  3. RAAV-Titer durch quantitative Echtzeit-PCR (qPCR) mit qPCR Kit nach Anweisungen des Herstellers in einem Real-Time PCR System zu bestimmen: 1 µL 10 µmol/L jeweils Fibel (5'-GGATTTCCAAGTCTCCACCC und 5'-TCCCACCGT ACACGCCTAC), 5 µL 2 x PCR-master-Mix, 1 µL verdünnt rAAV Proben und 2 µL DdH2O. laufen die Reaktion mit den folgenden Parametern Radsport: 95 ° C-3 min., 45 Zyklen [95 ° C 5 sec und 61 ° C 20 sec].

(5) intravenös und intraperitoneale Injektion von rAAVrh.74-CRISPR in Neugeborenen Mdx/Utrophin+ / Mäuse

  1. Immobilisieren Sie die Mdx/Utrophin+ / Maus Welpen (Tag 3) zu, indem man für 1 min auf Eis, und dann mit 1 x 1012 Viruspartikel in 50 µL pro Maus systemisch über einen Retro-Orbital-Ansatz oder eine intraperitoneale Injektion verabreichen.
  2. Lassen Sie die Mäuse zu erholen und setzen Sie wieder in ihre Heimat Käfige. Zehn Wochen nach rAAV Verwaltung einschläfern Sie die Mäuse durch CO2 Belichtung für Gewebe-Sammlung.
  3. Snap-Freeze Gewebe für genomische DNA und RNA Gewinnung und Verwendung Kühlung Isopentane in flüssigem Stickstoff, Gewebe mit optimale Arbeitstemperatur für Kryoschneiden zusammengesetzten einzufrieren.

6. Analyse der Zielgen Ergebnisse bearbeiten

  1. Genomische DNA-PCR-Analyse
    1. Isolieren Sie die Summe genomischer DNA aus dem Herz-Gewebe von Mdx/Utrophin+ /- Mäuse mit oder ohne rAAV behandelt.
    2. Verwenden Sie das gleiche Protokoll in Schritt 1.12 für PCR-Analysen.
  2. RT-PCR-Analyse Dystrophin Ausdrucksform
    1. Gesamt-RNS aus dem Herz-Gewebe mit dem RNA-Extraktion-Kit nach Anleitung des Herstellers zu extrahieren.
    2. Reversen Transkription, die gesamte-RNS mit einer RNase-freie DNase vorzubehandeln und 5 µg behandelten RNA als Vorlage für erste Strang cDNA Synthese mit der reversen Transkription-Kit verwenden.
    3. Verwenden Sie das Produkt der reversen Transkription für RT-PCR-Analyse von Dystrophin Ausdruck mit Dystrophin cDNA Primer: 5'-GGCTAGAGTATCAAACCAACATCAT und 5'-TGGAGGCTTACGGTTTTATCC.
  3. Schätzen Sie das Gen Bearbeitung Wirksamkeit von qPCR-Analyse
    1. Schätzen Sie das Gen Bearbeitung Wirksamkeit mittels quantitativer RT-PCR, die Reduktion von Exon 22-haltige Protokolle mit dem forward Primer (Exon 21) zu erkennen: 5'-TTGTCAGCTCTTCAGCCTCAAA und die rückwärts-Primer (Exon 23): 5'-AAACTCTCCTTCACAGTGTCACT. Gapdh als Referenz-gen mit dem forward Primer verwenden: 5'-AGGTTGTCTCCTGCGACTTC und die rückwärts-Primer: 5'-GGTGGTCCAGGGTTTCTTACT.
    2. Führen Sie die quantitative Echtzeit-PCR (qPCR) mit qPCR Kit nach Anweisungen des Herstellers in einem Real-Time PCR-System und die 2-stufige Reaktionsbedingungen: 95 ° C-3 min., 45 Zyklen von 95 ° C 5 sec und 61 ° C 30 sec.
  4. Immunfluoreszenz-Färbung Dystrophin Ausdruck zu analysieren
    1. Schneiden Sie die gefrorenen Gewebe mit einem Kryostaten bei einer Dicke von 10 µm. Fix Gefrierschnitte mit 4 % Paraformaldehyd bei Raumtemperatur 15 Minuten.
    2. 2 X mit PBS waschen und mit der Blockierung Lösung (10 % Pferd Serum) für 1 h inkubieren.
    3. Inkubieren Sie die Anti-Dystrophin Primärantikörper, bei 4 ° C über Nacht.
    4. Waschen Sie die Folien mit PBS 3 x 5 min und inkubieren Sie mit fluoreszierenden Sekundärantikörper (1: 500) bei Raumtemperatur für 1 h.
    5. Montieren Sie die Folien mit der Eindeckmittel mit DAPI und Bildgebung mit einem inversen confocal Mikroskop.

7. off-Target-Analyse von T7E1 assay

  1. Vorhersagen der potenziellen Ziel-Websites mit Online-CRISPR design-Tools wie z. B. < Http://crispr.mit.edu>.
  2. Verstärken die genomischen Regionen abdecken oben 5-10 potenzielle Ziel Standorte durch PCR: Genomische DNA 200 ng, 1 µL High-Fidelity-DNA-Polymerase, 5 µL 10-fach Puffer PCR Mischung 1,5 µL 10 µmol/L ortsspezifische vorwärts- und Zündkapseln, total zu 50 µL mit Lautstärke DdH2O.
  3. Laufen Sie die PCR-Produkte von Elektrophorese, zu extrahieren Sie und zu reinigen Sie die DNA mit einem Gel Extraction Kit. Messen Sie die Konzentration mit Spektralphotometer.
  4. Heteroduplex-Bildung durch Denaturierung und wieder glühen die gereinigten Amplifikate langsam in den Puffer 2.1 mit einem PCR Cycler zu fördern. Verwenden Sie die gleichen Radsport Bedingungen wie in Schritt 1.2.
  5. Verdauen Sie die neu geglühten Produkte für 30 min bei 37 ° C mit 0,5 µL T7E1 Enzym zu, und analysieren Sie die Reaktion durch mit 1-2 % Agarosegel Elektrophorese.
    Hinweis: Der Amplifikate kann auch durch gezielte Tiefe Sequenzierung analysiert werden.

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Ergebnisse

Die Wirksamkeit von gRNAs induzieren die Streichung der Zielregion für genomische DNA sollte in Zellkulturen vor dem Verpacken in rAAV für in vivo Studien ausgewertet werden. Zu diesem Zweck die gRNAs und SaCas9 exprimierenden Konstrukte wurden elektroporiert in C2C12 Zellen und die genomische DNA wurde durch PCR analysiert, mit dem Primer flankieren die Ziel-Sites (Abbildung 1). Ein PCR-Produkt von ~ 500 bp zeigt erfolgreiche Löschung das Ziel genomic DNA au...

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Diskussion

In diesem Protokoll zeigen wir die Schritte, die zur Erreichung der in Vivo kardiale gen Bearbeitung in postnatale Mäuse mit rAAVrh.74-vermittelte Lieferung von SaCas9 und zwei gRNAs. Wie bereits erwähnt, dieser Ansatz kann verwendet werden, um Dystrophin Ausdruck in Dystrophischen Mäuse wieder herzustellen, wie in unserer Arbeit27beschrieben, aber es könnte auch schnelle reverse Genetik Studien kardial bedingte Gene in Mäusen ohne den langwierigen Prozess der ermöglichen die traditionell...

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Offenlegungen

Kein Interessenkonflikt besteht.

Danksagungen

R.h. wird vom U.S. National Institutes of Health Zuschüsse (R01HL116546 und R01 AR064241) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Alexa Fluor 555 Anti-Kaninchen-IgGThermo Fisher ScientificA-21428
Benzonase-NukleaseSigma-AldrichE1014
Bio-SicherheitswerkbänkeThermo Fisher Scientific13471300 Serie A2 Klasse II, Typ A2
BsaINew England BioLabs IncRO535S Kompetente
ZellenAgilent Technologies
Zellkulturschalen, 150 mmNest Scientific USA715001
KryostatLeica BiosystemsLeica CM3050S
DMEMThermo Fisher ScientificMT10017CVCorning cellgro
Dystrophin AntikörperSpring BioscienceE2660
Fast-Ion Midi Plasmdi KitsIBI ScientificIB47111
FBSThermo Fisher Scientific26-140-079
Filtereinheit, 0,45 μm mThermo Fisher Scientific166-0045
GoTaq Master MixesPromegaM7122
Hochgeschwindigkeits-Plasmid-Mini-KitIBI ScientificIB47102
PferdeserumAbcamab139501
Isotemp 2239 WasserbadThermo Fisher Scientific15-460-11Q
Isotemp WärmeblockThermo Fisher Scientific11-718
Konfokales InversmikroskopCarl Zeiss Microscopy, LLCLSM 780
LightCycler 480 InstrumentRoche5015243001LightCycler 480 Instrument II
GroßraumzentrifugeThermo Fisher Scientific46-910Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus
MikrozentrifugeThermo Fisher Scientific75002445Sorvall Legend Micro 21R
Nanodrop-SpektralphotometerThermo ScientificND2000CLAPTOPNanoDrop&trade 2000/2000c
Oligos für i20-FIntegrated DNA TechnologiesCACCgGGCGT
TGAAATTCTCATTAC
Oligos für i20-RIntegrated DNA TechnologiesAAAC GTAATGAGAATTTCAACGCCc;
Oligos für i23-FIntegrated DNA TechnologiesCACCgCACCGATGAGAGGG
AAAGGTC
Oligos für i23-RIntegrated DNA TechnologiesGACCTTTCCCTCTCTCGGTGc
OligosIntegrated DNA Technologies
OptiPrep Density Gradient MediumSigma-AldrichD1556-250ML
OptiMEMThermo Fisher Scientific
PEG8000Sigma-Aldrich89510-1kg-F
PolyethyleniminPolysciences23966
Proteinase KSigma-AldrichP2308
Quick-Seal ZentrifugenröhrchenBeckman Coulter Inc342414
QIAquick Gel-ExtraktionskitQiagen28704
Radiant SYBR Green Hi-ROX qPCR-KitsAlkali ScientificQS2005
RevertAid RT Reverse TranskriptionskitThermo Fisher ScientificK1691
RotorBeckman Coulter Inc337922Typ 70Ti
T4 DNA-LigaseNew England BioLabs IncM0202S
ThermocyclerBiorad1861096
TRIzol ReagenzThermo Fisher Scientific15596026
UltrazentrifugeBeckman Coulter Inc8043-30-1192Optima le-80k
Ultra ZentrifugalfiltereinheitMilliporeSigmaUFC510096
VECTASHIELD Eindeckmedium mit DAPIVector Laboratories, IncH-1200
20031431985070

Referenzen

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