Method Article

Die Wurzel Mikrobiom zu erkunden: Extrahieren von Bakteriengemeinschaft Daten aus dem Boden, die Rhizosphäre und die Wurzel Endosphere

DOI:

10.3791/57561

⸱

May 2nd, 2018

 ,  ,  , 
1Department of Plant and Microbial Biology, University of California, Berkeley, 2Plant Gene Expression Center, USDA ARS

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Amplikons Sequenzdaten von Boden, Rhizosphäre und Wurzel Endosphere mikrobiome zu erhalten. Diese Informationen kann verwendet werden, um die Zusammensetzung und Vielfalt der Anlage verbundenen mikrobieller Gemeinschaften zu untersuchen, und eignet sich für den Einsatz mit einer Vielzahl von Pflanzenarten.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die intime Interaktion zwischen Pflanze Host und dem damit verbundenen Mikroorganismen ist von entscheidender Bedeutung bei der Bestimmung der Pflanze Fitness und verbesserte Toleranz gegenüber abiotischem Stress und Krankheiten fördern kann. Als die Pflanze Microbiome hochkomplexe, Low Cost sein, werden Hochdurchsatz-Methoden wie Amplikons-basierte Sequenzierung der 16 s rRNA-gen oft bevorzugt zur Charakterisierung der mikrobiellen Zusammensetzung und Vielfalt. Allerdings ist die Auswahl der geeigneten Methodik bei der Durchführung von solchen Experimenten entscheidend zur Reduzierung von Verzerrungen, die die Analysen und Vergleiche zwischen Proben und Studien erschweren können. Dieses Protokoll beschreibt im Detail eine standardisierte Methodik für die Erfassung und Extraktion von DNA aus Boden, Rhizosphäre und Wurzelproben. Darüber hinaus wir markieren eine etablierte 16 s rRNA Amplikons Sequenzierung Pipeline, die für die Erforschung der Zusammensetzung der bakteriellen Gemeinschaften in diesen Proben erlaubt, und kann leicht für andere Markergene angepasst werden. Diese Pipeline wurde für eine Vielzahl von Pflanzenarten, darunter Sorghum, Mais, Weizen, Erdbeere und Agave, validiert und kann helfen, Probleme im Zusammenhang mit der Kontamination von pflanzlichen Organellen zu überwinden.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pflanze-assoziierten mikrobiome bestehen aus dynamischen und komplexen mikrobieller Gemeinschaften bestehend aus Bakterien, Archaeen, Viren, Pilze und andere eukaryotischen Mikroorganismen. Neben ihrer gut untersuchte Rolle bei der Entstehung von Pflanzenkrankheiten können Anlage-assoziierten Mikroben auch Pflanzengesundheit positiv durch Verbesserung der Toleranz gegenüber biotischen und abiotischen Stress, Förderung der nährstoffverfügbarkeit und Pflanzenwachstum durch Verbesserung die Produktion von Phytohormonen. Aus diesem Grund besteht besonderes Interesse bei der Charakterisierung der Taxa, die Pflanze Wurzel Endospheres, rhizosphären und das umgebende Erdreich zugeordnet. Während einige Mikroben isoliert im Labor erzeugten Medien kultiviert werden können, viele nicht, zum Teil, weil sie auf Symbiotische Beziehungen mit anderen Mikroben berufen können, wachsen sehr langsam, oder erfordern Bedingungen, die in einer Testumgebung nicht repliziert werden können. Weil es die Notwendigkeit für den Anbau umgeht und relativ kostengünstig und hohem Durchsatz ist, Sequenz-basierte phylogenetische Profilierung der Umwelt- und Host-assoziierten mikrobielle Proben eine bevorzugte Methode für die Untersuchung der mikrobiellen Gemeinschaft geworden Zusammensetzung.

Die Auswahl der geeigneten Sequenziertechnologien zur Verfügung gestellt von verschiedenen nächste Generation sequencing (NGS) Plattformen1 richtet sich auf die Bedürfnisse der Nutzer, mit wichtigen Faktoren wie: gewünschte Abdeckung, Amplifikate Länge erwartet Gemeinschaft Vielfalt sowie Sequenzierung Fehlerquote lesen-Länge und die Kosten-pro-Lauf/Megabase. Eine weitere Variable, die in Amplikons-basierte Sequenzierung Experimenten berücksichtigt werden muss ist welches gen verstärkt werden und welche Primer verwendet werden. Bei der Gestaltung oder der Wahl der Primer, sind Forscher oft gezwungen, Kompromisse zwischen der Universalität der Verstärkung und die taxonomische Auflösung aus der daraus resultierenden Amplifikate erreichbar machen. Aus diesem Grund wählte diese Arten von Studien oft Primer und Marker, die selektiv bestimmte Teilmengen der das Mikrobiom abzielen. Beurteilung der Zusammensetzung der bakteriellen Gemeinschaften geschieht häufig durch Sequenzierung eine oder mehrere der hypervariablen Regionen der bakteriellen 16 s rRNA gen2,3. In dieser Studie beschreiben wir eine Amplikons basierte Sequenzierung Protokoll entwickelt für eine NGS-Plattform dieser Ziele der 500 bp V3-V4 Region der bakteriellen 16 s rRNA-gen, ermöglicht eine breite Verstärkung der bakteriellen Taxa und gleichzeitig ausreichend Variabilität, unterscheiden Sie zwischen verschiedenen Taxa. Darüber hinaus kann dieses Protokoll problemlos für die Verwendung mit anderen Primer-Sets, wie die Ausrichtung auf die ITS2 Marker von Pilzen oder 18 s rRNA Untereinheit der Eukaryoten angepasst werden.

Während andere Ansätze wie Schrotflinte Metagenomik, Metatranscriptomics und einzellige Sequenzierung, andere Vorteile einschließlich gelöst mikrobieller Genome und mehr direkte Messung des Community-Funktion bieten, sind diese Techniken in der Regel mehr teuer und rechenintensiven als die phylogenetische Profilierung hier4beschrieben. Darüber hinaus sind durchführen Schrotflinte Metagenomik und Metatranscriptomics auf Wurzelproben ergibt sich einen großen Prozentsatz der Zugehörigkeit zu dem Host Pflanzengenom liest, und Methoden, um diese Einschränkung zu umgehen immer noch entwickelten5,6.

Wie bei jeder experimentelle Plattform kann Amplikons-basierten profiling eine Reihe von potenziellen Verzerrungen einführen, die bei der experimentellen Design und Daten-Analyse berücksichtigt werden sollten. Dazu gehören die Methoden der Probenentnahme, DNA-Extraktion, Auswahl der PCR Primer und wie Bibliothek Vorbereitung durchgeführt wird. Verschiedene Methoden können die nutzbare erzeugte Datenmenge erheblich beeinträchtigen und können auch behindern die Bemühungen, Ergebnisse von Studien zu vergleichen. Zum Beispiel die Methode zur Entfernung von Rhizosphäre Bakterium7 und die Verwendung von verschiedenen Fördertechniken oder Wahl der DNA Extraktion Kits8,9 haben gezeigt, dass erhebliche Auswirkungen nachgelagerte Analyse führt zu unterschiedlichen Schlussfolgerungen in Bezug auf die Mikroben Gegenwart und ihrer relativen Häufigkeiten sind. Seit der Amplifikate basierende Profilerstellung angepasst werden kann, kann es schwierig sein, Vergleiche über Studien. Die Erde Microbiome Projekt hat vorgeschlagen, dass die Entwicklung eines standardisierten Protokolls als Mittel zur Minimierung der Variabilität, verursacht durch die Anwendung der Forscher komplexe Systeme wie die Pflanze-assoziierten Microbiome profitieren würden verschiedene Methoden zwischen Studien10,11. Hier diskutieren wir viele der oben genannten Themen und bieten Anregungen, best practices-wo angebracht.

Das Protokoll zeigt den Prozess der Erhebung Boden, Rhizosphäre und Wurzelproben aus Sorghum bicolor und Extraktion von DNA mit Hilfe einer etablierten DNA-Isolierung Kit11. Darüber hinaus enthält unser Protokoll einen detaillierte Amplikons Sequenzierung Workflow, mit Hilfe einer häufig eingesetzten NGS-Plattform zur Bestimmung der Struktur der bakteriengemeinschaften12,13,14. Dieses Protokoll wurde für den Einsatz in einer Vielzahl von Pflanze-Hosts in einer kürzlich veröffentlichten Studie der Rhizosphäre, Wurzeln und verbundenen Böden 18 Monocot Arten einschließlich Sorghum bicolor, Zea Mays, und Triticum Aestivum15validiert. Diese Methode ist auch für die Verwendung mit anderen Markergene validiert worden, wie durch seine erfolgreiche Bewerbung zum Studium der Pilzen ITS2 Markergens in Studien der Agave Microbiome16,17 und Erdbeer Microbiome 18.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Sammlung und Trennung von der Wurzel Endosphere, Rhizosphäre und Bodenproben

  1. Vor dem Betreten des Feldes, Autoklaven Reinstwasser (mindestens 90 mL Wasser pro Probe) zu sterilisieren. Bereiten Sie Epiphyten Entfernung Puffer (mindestens 25 mL pro Probe vor) durch Hinzufügen von 6,75 g KH2PO4, 8,75 g K2HPO4und Triton x-100, 1 mL bis 1 L steriles Wasser. Sterilisieren Sie den Puffer mit einem Vakuum-Filter mit 0,2 µm Porengröße.
    1. Für Schritte 1.2 bis 1.5 saubere Handschuhe sterilisiert mit Ethanol zu allen Zeiten und ersetzen die Handschuhe zwischen jeder Probe um Kontaminationen zu vermeiden. Sterilisieren Sie alle Geräte mit 70 % Ethanol zu und wischen Sie alle Geräte zwischen Proben. Bestimmen Sie vor der Probenahme die optimale Sampling-Tiefe für den Test, und entsprechen allen Boden- und Wurzel Sammlungen.
  2. Um lose Bodenproben zu sammeln, verwenden einen Ethanol-sterilisierte Erde Kern Sammler Boden zu erhalten, die frei von Pflanzenwurzeln ist durch das Sammeln von einem Kern etwa 23 bis 30 cm von der Basis der Pflanze.
  3. Übertragen Sie den Boden auf eine Plastiktüte, Homogenisieren des Bodens durch sanftes schütteln und übertragen ein Aliquot der Bodenprobe (etwa 600 mg), eine 2 mL-Tube zu füllen. Stellen Sie sofort die 2 mL-Tube auf Trockeneis oder Blitz einfrieren das Rohr in Flüssigkeit N2 bis bereit zum Fortsetzen der DNA-Extraktion (Schritt 2).
    1. In einigen Umgebungen kann das umgebende Erdreich Pflanzenmaterial enthalten. In diesem Fall verwenden Sie ein sterilisierte 2 mm Sieb, um die Pflanzenreste aus dem Boden vor dem einsetzen es in die Plastiktüte zu trennen.
  4. Um die Wurzel und der Rhizosphäre sammeln, verwenden Sie eine Ethanol sterilisiert Schaufel zu um Graben, bis die Pflanze kümmert sich um so viel von der Wurzel wie möglich zu erhalten. Tiefe ist abhängig von der Pflanze. Während kleine Pflanzen wie Weizen durch graben einige Zentimeter entfernt werden können, erfordern größere Pflanzen wie Sorghum 30 cm oder mehr. Schütteln Sie sanft überschüssige Erde von den Wurzeln bis ca. 2 mm des Bodens an der wurzeloberfläche ist.
    Hinweis: Achten Sie darauf, beim Arbeiten mit kleinen Pflanzen mit empfindlichen Wurzeln oder in trockenen, hohen Ton Inhalt Böden. Im Idealfall sollte nur eine dünne Schicht des Bodens, die noch auf die Wurzeln nach dem schütteln. Wenn große Aggregate des Bodens bleiben, kann ein Gummihammer, den Boden zu verdrängen, indem Sie sanft auf der Basis des Sprosses verwendet werden. Wenn der Betrag des Bodens bleibt nach diesem Prozess überschreitet oder 2 mm hinter dem zurückbleibt, ist die ungefähre Dicke anzumerken.
  5. Verwenden Sie für große Anlagen sterile Schere und/oder Scheren, schneiden Sie einen repräsentativen Teilbereich der Wurzeln und ein Minimum von 500 mg Wurzel Gewebe in ein 50 mL konische Fläschchen. Legen Sie für kleinere Gräser das gesamte Wurzelsystem in das Fläschchen. Fügen Sie genügend Epiphyten Entfernung Puffer, um die Wurzeln zu decken, dann legen Sie die Probe sofort auf Trockeneis oder Blitz Einfrieren der Probe in Flüssigkeit N2.
    Hinweis: Achten Sie darauf nicht die 50 mL konische Durchstechflasche Überfüllsicherung wie Waschen Schritt erschweren wird. Es sollte genug Leerraum so sein, dass der Epiphyten-Puffer in der Lage ist, nach unten fließen, umgibt die Wurzeln in das Fläschchen und decken Sie die Spitze. Da einige Gräser mehr Wurzel Biomasse haben als in ein 50 mL konische Fläschchen passen, sollten ein Unterabschnitt der Wurzeln gesammelt werden. Allerdings ist anzumerken, dass Schneiden der Wurzeln endophytische Bakterien in der Rhizosphäre Bruch ausgewaschen werden könnte, also Wurzeln brechen sollte minimiert werden. Wenn die Proben nicht unmittelbar nach seiner Rückkehr nach Labor verarbeitet werden, können sie bei-80 ° c gelagert werden
  6. Um die Rhizosphäre von den Wurzeln zu trennen, die Wurzel-Probe auf dem Eis Auftauen, dann beschallen die Wurzelproben bei 4 ° C für 10 min mit Pulsen von 160 W für 30 s, getrennt durch 30 S. Übertragung der Wurzeln in einem gekühlt (4 ° C), 50 mL-Tube mit steriler Pinzette zu reinigen. Bewahren Sie den original Schlauch mit Puffer und des Bodens, die die Rhizosphäre Bruchteil (Abbildung 1).
  7. Zentrifugieren Sie die Röhrchen mit Puffer und Rhizosphäre für 10 min bei 4 ° C, 4.000 x g. Dekantieren des Überstandes flash Einfrieren das Röhrchen mit der Rhizosphäre Bruch in Flüssigkeit N2und speichern den Rhizosphäre Bruch bei-80 ° C bis bereit zum Fortsetzen der DNA Extraktion (Schritt 2).
  8. Fügen Sie ca. 20 mL steriles Wasser gekühlt (4 ° C hinzu) um die Wurzeln zu waschen, die Wurzel Bruchteil. Waschen Sie die Wurzel durch Schütteln energisch (per Hand oder Mixer für 15-30 s), und dann lassen Sie das Wasser ab.
  9. Wiederholen Sie diesen Schritt mindestens zweimal, bis keine Erde auf der wurzeloberfläche bleibt. Wenn die DNA-Extraktion (Schritt 2) nicht sofort ausgeführt wird, die Wurzeln in sterile Alufolie wickeln, Blitz Einfrieren der Wurzeln in Flüssigkeit N2und laden die Proben bei-80 ° C bis bereit zum Fortsetzen der DNA-Extraktion.

(2) DNA-Extraktion

Hinweis: In Schritt 2 und 3, saubere Handschuhe sterilisiert mit Ethanol sollte getragen werden, zu allen Zeiten und alle Arbeiten durchgeführt werden, auf einer Oberfläche mit Ethanol sterilisiert.

  1. Die Boden- und Rhizosphäre Proben extrahieren Sie DNA.
    1. Verwendung eines sterilen Spatel schnell 250 mg des Bodens und der Rhizosphäre von Schritte 1,3 und 1,7 in getrennten Röhren übertragen in den kommerziellen DNA-Isolierung-Kit zur Verfügung gestellt zur Extraktion aus dem Boden, dann fahren Sie mit DNA-Isolierung mit dem Ausrüster Protokoll.
    2. Nach eluierenden DNA in der Elution Puffer durch die DNA-Isolierung-Kit, speichern die DNA bei-20 ° C bis bereit zu fahren Sie mit Schritt 3 fort.
  2. Die Wurzelproben extrahieren Sie DNA.
    1. Chill, einem sterilisierten Mörser und Stößel mit Flüssigkeit N2. 600 bis 700 mg Wurzel Gewebe Messen Sie ab und legen Sie das Gewebe in den Mörtel. Fügen Sie sorgfältig, genug Flüssigkeit N2 um die Wurzeln zu decken.
    2. Schleifen Sie die Wurzeln in kleine Stücke. Fahren Sie fort, Hinzufügen von Flüssigkeit N2 und Schleifen (mindestens zwei Mal zwischen Proben konsequent sein), bis die Wurzeln ein feines Pulver sind. Sicherstellen Sie, dass das Gewebe der Wurzel während dieses Schrittes nicht Auftauen.
      Achtung: Verwenden Sie geeignetsten persönlichen Schutzausrüstung (Laborkittel, Schutzbrille und Kryo-Handschuhe) beim Arbeiten mit Flüssigkeit N2.
      Hinweis: Für eine minderwertige DNA-Extraktion, kann es vorteilhaft sein, überschüssige Wurzeln zu Pulver zermahlen und das Pulver bei-80 ° c Lagern
    3. Schnell, vor der Wurzel beginnt Pulver zu tauen, übertragen die Wurzel-Pulver in vorgewogene 1,5 mL Röhrchen auf Eis mit einem sterilen Spatel. Nehmen Sie das Gewicht des Rohres und Pulver. In der Regel ist die 300-400 mg Pulver übertragen.
    4. Verwendung eines sterilen Spatel übertragen schnell 150 mg Wurzelpulver auf dem Sammelrohr in den kommerziellen DNA-Isolierung-Kit zur Verfügung gestellt für die Extraktion aus dem Boden ausgelegt, dann gehen mit DNA-Isolierung mit dem Ausrüster-Protokoll.
      Hinweis: Für einige Wurzelproben, es kann eine hohe Konzentration organischer Stoffe noch in das DNA-Pellet, die die Amplifikation der DNA während der PCR, vor allem, wenn ein anderes DNA-Extraktion-Protokoll verhindert (zB., CTAB Extraktion) dient. Reinigen Sie gegebenenfalls die DNA anhand der Anweisungen im ökologischen DNA-Aufräum Kit enthalten.
  3. Messen Sie die Konzentration aller DNA-Proben mit einem hochempfindlichen Benchtop-Fluorometer.
    1. Fügen Sie 1-20 µL jeder eluierten DNA-Probe in Röhren im DsDNA hochempfindlichen Assay Kit enthalten. Fluorometer funktionierende Lösung (1: 200 Farbstoff: Puffer) bis zu 200 µL hinzufügen.
    2. Bereiten Sie zwei zusätzliche Röhrchen mit 10 µL DNA standard 1 (0 ng/µL DNA) oder 10 µL standard 2 (100 ng/µL), und jede Norm fügen Sie 190 µL Arbeitslösung Fluorometer hinzu.
    3. Messen Sie die Konzentration des Standards und jede Probe. Wenn es nicht automatisch geschieht, berechnen Sie die DNA-Konzentration aus der Extinktion Ausgabe durch eine lineare Regression der beiden Standards.

(3) Amplikons Bibliothek Vorbereitung und Einreichung

  1. Materialien für die Amplifikation Reaktion eingerichtet.
    1. Tauen Sie DNA-Proben bei 4 ° C auf und halten sie auf dem Eis in Schritt 3. Zufällige Reihenfolge der DNA-Proben zu minimieren Verzerrungen aufgrund der Lage auf die PCR-Platte (Tabelle 2).
    2. Verdünnen Sie in einer 96-Well-PCR-Platte DNA von jeder Probe in molekularen Grade Wasser bis 5 ng/µL in einem Gesamtvolumen von 20 µL. Fügen Sie 20 µL des molekularen Grade Wasser in die vier Ecken Vertiefungen als Negativkontrollen für Verstärkung (leere) (Tabelle 2).
    3. Ordnen Sie die Barcode-Primer (10 µM) in PCR-Streifen Röhren oder einer 96-Well-Platte, so dass sie mit einem Multi-Kanal-Pipette (Abbildung 2) hinzugefügt werden können.
    4. Bereiten Sie genügenden PCR-master-Mix, jede DNA-Probe in dreifacher Ausfertigung zu verstärken. Bereiten Sie 1,5 µL der BSA (20 mg/mL), 37,5 µL vorgefertigte 2 x master-Mix (bestehend aus PCR-Puffer, MgCl2, dNTPs und Taq -DNA-Polymerase), 0,57 µL der Chloroplasten PNA (100 µM), 0,57 µL der mitochondrialen PNA (100 µM), und 25.86 µL Molekulare Grade Wasser.
    5. Gießen Sie den master-Mix in einem sterilen 25 mL Mehrkanal-Pipette Reservoir und verteilen Sie 66 µL des master-Mix in jede Vertiefung eine neue 96-Well-PCR-Platte mit einer Mehrkanal-Pipette zu.
      Hinweis: Bei der Berechnung der Reagenz Bände für den master-Mix stellen Sie sicher, dass auch die 4 leere Brunnen pro Platte.
    6. Fügen Sie mithilfe einer Multi-Kanal-Pipette 6 µL 5 ng/µL DNA (von der normalisierten DNA-Platte) auf den master-Mix-Teller. Fügen Sie auf der master Platte 1,5 µL 10 µM vorwärts Grundierung, derart, daß jede Spalte hat, einem anderen vorwärts Barcode und 1,5 µL 10 µM Grundierung rückgängig zu machen, so dass jede Zeile einen anderen reverse Barcode (Abbildung 2).
      Hinweis: Vor dem Hinzufügen von Grundierungen, die randomisierte Platten und master-Mix ließe sich die ITS oder ITS2 Pilz Gene zu verstärken, wenn verschiedene Primer hinzugefügt wurden. Wenn dies der Fall ist, kann ein ähnliche besser gekleideteres Design verwendet werden.
    7. Spin-down die Platte kurz auf 3.000 x g. verwenden eine Multi-Kanal-Pipette vorsichtig mischen, dann teilen Sie in drei Platten mit 25 µL des Reaktionsgemisches.
      Hinweis: Obwohl drei Wiederholungen nicht unbedingt notwendig sind, verringert es die Auswirkungen der technischen Variabilität.
  2. Verstärken die DNA in jeder Platte mit einem Thermocycler legen Sie mit den nachfolgenden Bedingungen: 180 s bei 98 ° C, 30 Zyklen: 98 ° C für 45 s (Denaturierung), 78 ° C für 10 s (PNA glühen), 55 ° C für 60 s (Primer annealing) und 72 ° C für 90 s (Erweiterung) , dann 600 s bei 72 ° C, gefolgt von einer 4 ° C halten Schritt. Nach der Verstärkung bündeln Sie die drei replizieren Platten in einem einzigen 96-Well-Platte.
  3. Quantifizieren Sie die DNA mit Hilfe hoher Empfindlichkeit Fluorometer Reagenzien in einem 96-Well-Platte-Reader.
    1. Fügen Sie 2 µL des PCR Produktes zu einer 96-Well-Mikrotestplatte zusammen mit 98 µL Arbeitslösung Fluorometer (Farbstoff: Puffer 1: 200). 4 Brunnen als Standards gehören: 5 µL DNA standard 1 (0 ng/µL DNA), 1 µL standard 2 (10 ng/µL), 2 µL standard 2 (20 ng/µL) und 5 µL standard 2 (50 ng/µL). Dann fügen Sie Fluorometer funktionierende Lösung für ein Endvolumen von 100 µL.
      Hinweis: Jede Probe ist messbar mit einem Benchtop-Fluorometer, wie im Schritt 2.3 beschrieben, wenn ein Platte Leser nicht verfügbar ist.
    2. Berechnen Sie die DNA-Konzentration aus der Extinktion Ausgabe durch eine lineare Regression der vier Standards.
    3. Für die erfolgreich verstärkte Barcode Produkten (diejenigen, die eine größer als 15 ng/µL Konzentration), pool 100 ng jeder Probe in ein einzelnes 1,5 mL Röhrchen (Tabelle 2).
    4. Berechnen Sie die durchschnittliche Lautstärke von Proben, die dem Pool mithilfe der =AVERAGE()-Funktion in einem Tabellenkalkulationsprogramm hinzugefügt. Die gepoolten Proben das Volumen der "leere" PCR-Produkte hinzufügen.
      Hinweis: Da die "leere" PCR-Produkte ihre eigenen eindeutigen Barcode-Kombinationen haben, können sie sequenziert um Verunreinigungen Labor überprüfen.
  4. Messen der Konzentration der gepoolten Ware mit einem Benchtop-Fluorometer, wie in Schritt 2.3 und nehmen 600 ng DNA beschrieben und im molekularen Grade Wasser zu einem Endvolumen von 100 µL in einem 1,5 mL Röhrchen verdünnen. Bewahren Sie die restlichen gepoolte Produkt bei-20 ° C.
  5. Waschen Sie die 600 ng DNA aliquoten durch Anschluss an die etablierten PCR Reinigungsprozess mit paramagnetischen Reinigung Perlen in einem 96-Well-Format mit ein paar Ausnahmen.
    1. Machen Sie einen frischen 600 µL aliquoten von 70 % Ethanol. Schütteln Sie die Flasche des magnetischen Beads, Perlen wieder auszusetzen, die nach unten zu begleichen.
    2. Die 600 ng aliquoten DNA 1 X Volumen (100 µL) der Perle Lösung hinzufügen. Mischen Sie durch pipettieren 10 mal gründlich. 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
    3. Legen Sie das Rohr auf dem magnetischen Ständer für 2 min (oder bis die Lösung klar ist), Perlen von Lösung zu trennen. Während das Rohr noch in die Magnetstativ, Aspirieren des klare Überstands vorsichtig ohne Berührung der magnetischen Beads, und den klare überstand verwerfen.
      Hinweis: an dieser Stelle sind die Amplifikate Produkte an die magnetische Beads gebunden. Alle Perlen, die gestört oder verloren während der Aspiration sind führt zu einem Verlust der DNA.
    4. Lassen Sie das Rohr in die Magnetstativ und das Rohr 300 µL 70 % Ethanol hinzu; 30 S. Aspirat aus Ethanol und verwerfen bei Raumtemperatur inkubieren. Wiederholen Sie diesen Vorgang, und entfernen Sie alle Ethanol nach der zweiten Wäsche. Entfernen Sie den Schlauch aus der Magnetstativ, und an der Luft trocknen für 5 Minuten.
    5. Die getrockneten Perlen 30 µL Molekulare Grade Wasser hinzu und mischen Sie, indem Sie 10 mal pipettieren. Inkubation bei Raumtemperatur für 2 min. Rückkehr das Rohr in die Magnetstativ für 1 min um die Perlen von Lösung zu trennen. Übertragen Sie das Eluat auf einen neuen Schlauch.
      Hinweis: Magnetische Beads werden nachgeschaltete Reaktionen nicht beeinträchtigen.
  6. Messen Sie die Endkonzentration von gereinigt, gepoolte DNA mit Hilfe einer Benchtop-Fluorometer, wie unter Punkt 2.3 beschrieben. Verdünnen Sie eine Aliquote bis 10 nM in einem Endvolumen von 30 µL oder zur Konzentration und Volumen durch die Sequenzierung Anlage bevorzugt.
  7. Nutzen Sie die Dienste einer Einrichtung der Sequenzierung die DNA auf einer Plattform NGS, 2 x 300 bp gepaart-End Sequenzierung sequenziert.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Durchführung der empfohlenen Protokoll sollte in einem Dataset indizierten gepaart Ende liest, die zurück zu jeder Probe angepasst und entweder eine bakterielle zugewiesen werden können führen operative taxonomischen Einheiten (OTU) oder genaue Reihenfolge Variante (ESV, auch bezeichnet als Amplifikate Sequenz-Variante (ASV) und ineffektiv taxonomischen Einheit (sOTU)), abhängig von nachgelagerten Analyse. Um qualitativ hochwertige Daten zu erhalten, muss darauf geachtet werden, bei jedem...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll zeigt eine etablierte Pipeline Wurzel Endosphere, Rhizosphäre und Boden mikrobiellen Gemeinschaft Kompositionen aus Bereich Probenahme, Probenaufbereitung und nachgelagerte Sequenzierung zu erkunden. Studium Wurzel-assoziierten mikrobiome präsentiert einzigartige Herausforderungen aufgrund teilweise die Schwierigkeiten bei der Probenahme aus dem Boden. Böden sind sehr variabel in Bezug auf die physikalischen und chemischen Eigenschaften und unterschiedlichen Bodenverhältnissen können von nur wenigen Mill...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde durch die USDA-ARS (CRIS 2030-21430-008-00D) finanziert. TS wird durch die NSF Graduate Research Fellowship Program unterstützt.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,1-10/20 & Mikro; L gefilterte MikropipettenspitzenUSA Scientific1120-3810Kann durch ein Äquivalent von anderen Anbietern ersetzt werden.
1,5 mL MikrozentrifugenröhrchenUSA Scientific1615-5510Kann durch Äquivalente von anderen Anbietern ersetzt werden.
10 & Mikro; L MehrkanalpipetteEppendorf3122000027Kann durch Äquivalente anderer Anbieter ersetzt werden.
10 & Mikro; L, 100 &Mikro; L und 1000 µ L MikropipettenEppendorf3120000909Kann durch Äquivalente von anderen Anbietern ersetzt werden.
100 &Mikro; L MehrkanalpipetteEppendorf3122000043Kann durch Äquivalente anderer Anbieter ersetzt werden.
1000 &Mikro; L gefilterte MikropipettenspitzenUSA Scientific1122-1830Kann durch ein Äquivalent von anderen Anbietern ersetzt werden.
2 mL MikrozentrifugenröhrchenUSA Scientific1620-2700Kann durch Äquivalente von anderen Anbietern ersetzt werden.
2 mm BodensiebForstwirtschaft Lieferanten60141009Kann durch Äquivalente von anderen Anbietern ersetzen.
200 & Mikro; L gefilterte MikropipettenspitzenUSA Scientific1120-8810Kann durch ein Äquivalent von anderen Anbietern ersetzt werden.
25 mL ReservoirsVWR International LLC89094-664Kann durch Äquivalente von anderen Anbietern ersetzt werden.
Konische 50-ml-FläschchenThermo Fisher Scientific352098Kann durch Äquivalente anderer Anbieter ersetzen.
500 mL Vakuumfilter (0,2 & Mikro; m Porengröße)VWR International LLC156-4020
96-Well-MikrotiterplattenUSA Scientific655900
96-Well-PCR-PlattenBioRadHSP9631
Agencourt AMPure XP-KügelchenThermo Fisher ScientificNC9933872Gebrauchsanweisung:
https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/ajax/downloadDocument/B37419AA.pdf?autonomyId=TP_DOC_150180
&documentName=B37419AA.pdf
AluminiumfolieBoardwalk7124Kann durch ein Äquivalent von anderen Lieferanten ersetzt werden.
Analysenwaage mit 0,001 g AuflösungOhaus PioneerPA323Kann durch Äquivalente anderer Anbieter ersetzt werden.
Bioruptor Plus UltraschallgerätDiagenodeB01020001
Rinderserumalbumin (BSA) 20 mg/mlNew England BiolabsB9000S
ZentrifugeEppendorf5811000908Einschließlich 50 ml und 96-Well-Platteneimeradapter,
KryohandschuheMillipore SigmaZ183490Kann durch Äquivalente von anderen Anbietern ersetzt werden.
DNeasy PowerClean-Kit (optional)Qiagen Inc.12877-50Ehemals MoBio
DNeasy PowerSoil BausatzQiagen Inc.12888-100Früher MoBio
TrockeneisBeliebigerNA
DynaMag-2 MagnetThermo Fisher Scientific12321DEthanol nicht ersetzen
VWR International LLC89125-188Kann durch Äquivalente von anderen Anbietern ersetzen.
GallonengrößeGefrierbeutel ZiplocNAKann durch Äquivalente von anderen Lieferanten ersetzt werden.
Gemini EM Microplate ReaderMolecular DevicesEMKann ein anderes Fluorometer verwenden, das 96-Well-Platten von oben liest.
K2HPO4Sigma-AldrichP3786
KH2PO4Sigma-AldrichP5655
LaborkittelWorkriteJ1367Kann durch ein Äquivalent von anderen Lieferanten ersetzt werden.
Flüssigkeit N2AnyNAKann durch Äquivalente von anderen Lieferanten ersetzt werden.
Flüssigkeit N2 DewarThermo Fisher Scientific4150-9000Kann durch Äquivalente anderer Anbieter ersetzt werden.
Milli-Q ReinstwasseraufbereitungssystemMillipore SigmaSYNS0R0WW
Mini-ZentrifugeEppendorf5404000014
Wasser in molekularer QualitätThermo Fisher Scientific4387937Kann durch gleichwertige Produkte anderer Anbieter ersetzt werden.
MörserVWR International LLC89038-150Kann durch Äquivalente von anderen Lieferanten ersetzt werden.
NitrilhandschuheThermo Fisher Scientific19167032BKann durch Äquivalente von anderen Anbietern ersetzt werden.
PapierhandtücherVWR International LLCBWK6212Kann durch Äquivalente von anderen Lieferanten ersetzen.
PCR-PlattenversiegelungsfolieThermo Fisher ScientificNC9684493
PCR-StreifenröhrchenUSA Scientific1402-2700
StößelVWR International LLC89038-166Kann durch Äquivalente von anderen Lieferanten ersetzt werden.
KunststoffspatelLevGo, Inc.17211
Platinum Hot Start PCR Master Mix (2x)Thermo Fisher Scientific13000014
PNAs - Chloroplasten und mitochondrialePNA BioNAStellen Sie sicher, dass die Sequenz bioinformatisch überprüft
wird SchutzbrilleMillipore SigmaZ759015Kann durch ein Äquivalent von anderen Anbietern ersetzt werden.
Qubit 3.0 FluorometerThermo Fisher ScientificQ33216
Qubit dsDNA HS Assay KitThermo Fisher ScientificQ32854
Gummihammer (optional)Ace Hardware2258622Kann durch ein Äquivalent von anderen Anbietern ersetzt werden.
Schere oder SchereVWR International LLC89259-936Kann durch Äquivalente von anderen Lieferanten ersetzt werden.
SchaufelHome Depot2597400Kann durch Äquivalente von anderen Lieferanten ersetzt werden.
Bodenkernsammler (kleiner Durchmesser: < 1 Zoll)Ben Meadows221700Kann durch ein Äquivalent von anderen Lieferanten ersetzt werden.
SprühflaschenSanta Cruz Biotechnologysc-395278Kann durch Äquivalente von anderen Anbietern ersetzt werden.
Entsalzte Standard-Primer mit Barcode (10 & Mikro; M) (Tabelle 1)IDTNA4 nmol Ultramer DNA Oligo mit Standard-Entsalzung. Der NGS-Adapter und der Sequenzierungsprimer (Tabelle 1) sind für die Verwendung mit Illumina MiSeq unter Verwendung der v3-Chemie konzipiert.
ThermocyclerThermo Fisher ScientificE950040015Kann durch Äquivalente anderer Anbieter ersetzen.
Triton X-100Sigma-AldrichX100Kann durch Äquivalente anderer Anbieter ersetzt werden.
WägeschiffchenSpectrum ChemicalsB6001WKann durch Äquivalente von anderen Anbietern ersetzt werden.

References

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