Das Ziel dieses Protokolls ist, spektralphotometrisch Trans-Plasma Membran Elektronentransport Nutzung extrazelluläre Elektronen Akzeptoren überwachen und enzymatische Interaktionen zu analysieren, die mit dieser extrazellulären Elektronen-Akzeptoren auftreten können.
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Methodenartikel
Messung der Trans-Plasma Membran Elektronentransport durch C2C12 Myotubes
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Trans-Plasma Membran Elektronentransport (tPMET) spielt eine Rolle im Schutz der Zellen vor intrazellulären reduktiven Stress sowie Schutz vor Schäden durch extrazelluläre Oxidantien. Dieser Prozess für den Transport von Elektronen von intrazellulären Reduktionsmitteln extrazelluläre Oxidantien ist nicht gut definiert. Hier präsentieren wir Ihnen spektralphotometrische Proben von C2C12 Myotubes tPMET unter Verwendung der extrazellulären Elektronen-Akzeptoren zu überwachen: wasserlösliche tetrazoliumsalz Salz-1 (WST-1) und 2,6-Dichlorophenolindophenol (‑Aufklärung oder DCIP). Durch die Reduzierung der diese Elektronen-Akzeptoren sind wir in der Lage, diesen Prozess in eine Echtzeit-Analyse zu überwachen. Mit dem Zusatz von Enzymen wie Ascorbat Oxidase (AO) und Superoxid-Dismutase (SOD) für die Tests können wir bestimmen, welcher Teil des tPMET durch Ascorbat Export oder Superoxid Produktion, bzw. ist. Während WST-1 zu stabilen Ergebnissen mit niedrigen Hintergrund gezeigt wurde, konnte ‑Aufklärung nach der Zugabe von AO und SOD, die photometrische Analyse zeigte wieder oxidiert werden. Diese Methode zeigt einen in Echtzeit, Multi-gut, schnelle photometrische Assay mit Vorteilen gegenüber anderen Methoden verwendet, um tPMET, wie ferricyanid (FeCN) und Ferricytochrome C Reduktion zu überwachen.
Einleitung
Die Fähigkeit des gereinigten Plasmamembranen, Elektronen-Akzeptoren reduzieren führte zu der Ansicht, dass der Plasmamembran ein Redox-inhärente Kapazität1hat. Zuvor in Pilzen, Pflanzen und Tiere gesehen, ist tPMET ein Prozess üblich, mehrere Organismen2,3,4,5. Insbesondere wurde dabei in Saccharomyces Cerevisiae, Karotte Zellen, Erythrozyten, Lymphozyten, Osteosarkom, Melanom, Makrophagen, Skelettmuskel und Neutrophilen2,3, nachgewiesen <....
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Protokoll
Hinweis: Siehe Abbildung 1 für einen schematischen Überblick über die wichtigsten Schritte.
1. Reduzierung der WST-1-Assay
- Wachsen Sie und differenzieren Sie C2C12 adhärente Zellen mit Standardzellen Kultur Verfahren7 in einer 96-Well-Platte mit Zeilen A-F.
- Verwenden Sie eine Differenzierung Medium aus der Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) mit 2 % Pferd Serum, 100 U/mL Penicillin und 0,1 mg/mL Streptomycin ergänzt. Inkubation der Zellen bei 37 ° C mit 5 % CO2.
- Bei der Überwachung von Ascorbat Beteiligung an tPMET ergänzen Sie Differenzierung M....
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Ergebnisse
Statistiken wurden mit ANOVA mit wiederholten Messungen mit RStudio Statistiksoftware25durchgeführt. Stichprobengrößen entnehmen Sie bitte der Abbildung Legenden.
Um tPMET zu überwachen, wurden C2C12 Myotubes zusammen mit extrazellulären Elektronen Akzeptoren, WST-1 und ‑Aufklärung eingesetzt. AO wurde verwendet, um festzustellen, welcher Teil der WST-1 und ‑Aufklärung Reduktion wurde durch Ascorbat Ausfl.......
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Diskussion
Wir haben zwei Methoden zur Nutzung von extrazellulären Elektronen Akzeptoren, WST-1 und ‑Aufklärung, in spektralphotometrische Untersuchungen zur Überwachung von tPMET in C2C12 Myotubes vorgestellt. Mit dem Wachstum von Zelllinien im standard Kultur Verfahren und ein Spektralphotometer Platte Leser ist es möglich, tPMET mit dieser Elektronen-Akzeptoren in einem einfachen Mikrotestplatte Assay zu überwachen. WST-1 Reduzierung ist reproduzierbar aus Brunnen, Brunnen in einen Test, aber es gibt tägliche Variabilität. Die t.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Wir möchten Neej Patel, Thomas Bell, Lyn Mattathil und Mark Mannino für ihre technische Unterstützung zu danken. Diese Arbeit wurde von United States Public Health Service Award R15DK102122 vom National Institute of Diabetes und Magen-Darm und Niere-Krankheiten (NIDDK), Jonathan Fisher unterstützt. Der Manuskript-Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der NIDDK oder die National Institutes of Health.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| C2C12-Myoblasten | American Type Culture Collection | CRL-1772 | |
| Dulbecco's modifizierte Adler-mittlere - niedrige Glukose | Sigma | D6046 | |
| Fetal Plex Tierserum-Komplex | Gemini Bio-Products | 100-602 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | 516106 | |
| Pferdeserum | Gibco Technologies | 16050-130 | |
| Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung | Sigma | D8537 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma | T4049 | |
| 15 cm Kulturschalen | TPP | 93150 | |
| 96 Well-Kulturplatten | TPP | 92096 | |
| 2-(4-Jodphenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium-Natriumsalz (WST-1) | Accela ChemBio Inc | SY016315 | |
| Phenazinmethosulfat | Sigma | P9625 | |
| L-Ascorbinsäure | Sigma | A5960 | |
| Ascorbatoxidase | Sigma | A0157 | |
| Superoxid-Dismutase | Sigma | S5395 | |
| 2,6-Dichlorindophenol-Natriumsalz | ICN Biomedicals | 215011825 | |
| D-(+)-Glukose | Sigma | G7528 | |
| HEPES Natriumsalz | Sigma | H3784 | |
| Natriumchlorid | Sigma | S7653 | |
| Kaliumchlorid | Fisher Scientific | BP366 | |
| Magnesiumsulfat-Heptahydrat | Sigma | M5921 | |
| Calciumchlorid-Dihydrat | Sigma | C7902 | |
| Kaliumphosphat | Fisher Scientific | BP363 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Powerwave X-I Spektralphotometer | Biotek Insturments | nicht mehr erhältlich | |
| Spectronic Genesys 5 Spektralphotometer | Thermo Scientific | 336001 | |
| PureGrade 96-Well-Mikrotiterplatte, F-Boden, klar, unbehandelt, unsteril | MidSci | 781602 | |
| Eisen(II)-chlorid-Tetrahydrat | Sigma | 220299 | |
| Eisen(II)-sulfat-Heptahydrat | Sigma | 215422 | |
| Hypoxanthin | Sigma | H9636 | |
| Xanthinoxidase | Sigma | X4500 | |
| Excel | Microsoft | ||
| R Studio | Rstudio | https://www.rstudio.com/products/rstudio/ | |
| KC4 | Biotek Insturments | eingestellt |
Referenzen
- Kilberg, M. S., Christensen, H. N. Electron-transferring enzymes in the plasma membrane of the Ehrlich ascites tumor cell. Biochemistry. 18 (8), 1525-1530 (1979).
- Crane, F. L., Roberts, H., Linnane, A. W., Low, H. Transmembrane ferricyanide ....
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Nachdrucke und Genehmigungen
