Quantitative Micro-CT-Analyse der Aortopathy in einem Mausmodell der β-Aminopropionitrile-induzierte Aortenaneurysma und Dissektion

Summary

Dieser Artikel beschreibt eine detaillierte Methode mit einem röntgendichten bleihaltigen Silikon-Kautschuk zu das murine Gefäßsystem zur Quantifizierung der Aorta Durchmesser in einem Mausmodell der Aortenaneurysma und Dissektion durchspülen.

Abstract

Aortenaneurysma und Dissektion ist verbunden mit erheblicher Morbidität und Mortalität in der Bevölkerung und sehr tödlich sein können. Während Tiermodelle der aortenerkrankungen vorhanden sind, wurde in Vivo Bildgebung des Gefäßsystems beschränkt. In den letzten Jahren entstanden als eine bevorzugte Modalität für große und kleine Schiffe imaging Mikro-Computer-Tomographie (Mikro-CT) in Vivo und ex Vivo. In Verbindung mit einer Methode der vaskulären Gießen haben wir Mikro-CT erfolgreich eingesetzt, um die Häufigkeit und Verteilung der aortalen Pathologie in β-Aminopropionitrile-behandelten C57/Bl6 Mäusen zu charakterisieren. Technische Einschränkungen dieser Methode sind Variationen in der Qualität der Durchblutung von Armen Tier Vorbereitung, die Anwendung der richtigen Methoden zur Quantifizierung der Schiff Größe und die Überlebensfähigkeit dieses Verfahren eingeführt. Dieser Artikel beschreibt eine Methode für die intravasale Perfusion der einem bleihaltigen röntgendichten Silikon-Kautschuk für die quantitative Charakterisierung von Aortopathy in einem Mausmodell der Aneurysma und Dissektion. Neben der Visualisierung von aortalen Pathologie, kann diese Methode verwendet werden, für die Prüfung von anderen vaskulären Betten in Vivo oder Post-Mortem-vaskulären Betten entfernt.

Introduction

Die Inzidenz der Aortendissektion ist 3 Fälle pro 100.000 pro Jahr¹. Aortendissektion und aneurysmal Krankheiten entfallen mehr als 10.000 Todesfälle in den Vereinigten Staaten jedes Jahr 1-2 % aller Todesfälle in westlichen Ländern²entfallen. Aortendissektion wird durch einen Riss in der Intima Schicht des Schiffes mit der Ausbreitung des Blutes durch die Schichten der aortalen Wand unter physiologischen Druck initiiert. Erhöhter Puls Patienten Drücke sind mit einer erhöhten Inzidenz der Dissektion und Komplikationen verbunden. Erhöhte Wand Scherspannung ist verbunden mit der aortalen Wand-Ausbau führt zu einem Aneurysma Bildung^3,4. Folgen der Aortendissektion gehören die Okklusion des Blutflusses zu entfernten Organen, einschließlich Gehirn, Nieren, Darm, und Gliedmaßen, die Bildung von chronischen Aneurysmen, Bruch oder Tod^5,6,7.

Zur Zeit sind die biochemischen und zellulären Vorgänge bei der Initiierung und Progression von Aortenaneurysmen und Dissektionen immer noch schlecht verstanden. Reproduzierbare Tiermodelle Aortenaneurysma und Dissektion sind Schlüssel zum Verständnis der Pathophysiologie. Β-Aminopropionitrile (BAPN) ist ein Lysyl-Oxidase-Hemmer, die verhindert, dass die Vernetzung von Elastin und Kollagen und hat gezeigt, dass die Struktur des Schiffes Wand extrazellulären Matrix und seine biomechanischen Integrität^{6wesentlich zu verändern, 8}. Nager mit BAPN behandelt wurden als eine gemeinsame Tiermodell Aortenaneurysma und Dissektion^9,10genutzt.

Vaskuläre bildgebende Verfahren sind maßgeblich an der Festlegung vaskulären Pathologie, bestätigt Schiff Durchgängigkeit und Evaluierung Organ Perfusion. Mikro-Computertomographie (Mikro-CT) ist vor kurzem verwendet worden, um das Gefäßsystem von Mäusen und ähnlich große Tiere zu studieren. Im Gegensatz zu Knochen beschränkt sich die axiale Darstellung der Blutgefäße durch Computertomographie, wie Intraluminal Blut von Natur aus relativ strahlendurchlässig ist. In Kombination mit intravaskulären Kontrastmittel ermöglicht Mikro-CT jedoch detaillierte dreidimensionale Rekonstruktionen der tierischen Vasculatures für das Studium der vaskulären Makro-anatomische Pathologie¹¹.

Die ausgewählten Kontrastmittel ist (siehe die Tabelle der Materialien) ein röntgendichten Silikon-Kautschuk, die Bleichromat und Bleisulfat enthält. Bei der Perfusion in Anwesenheit eines Katalysators, es schnell aushärtet, um eine Besetzung des Gefäßsystems mit minimalen Änderungen in der Makro-anatomische Architektur der Gefäße, wodurch das Gefäßsystem sehr röntgendichten im Gegensatz zu den Hintergrund-Gewebe zu bilden wenn Röntgenologisch untersucht. Dieses Kontrastmittel ist vorteilhaft, weil es einfach ist zu handhaben und vermeidet die Zerstörung von Gewebe und Schiff Verlust durch Bruch oft im Zusammenhang mit vaskulären Besetzung Korrosion. Wie es mit minimale Schrumpfung¹²Kuren, Schiffe von Blut geräumt bleiben patent und ermöglichen eine genaue Beurteilung der das Tier Makro-Gefäßsystem in Experimenten nicht überleben. Bisherige Arbeit röntgendichten Silikon-Kautschuk-Kontrast in einer Vielzahl von Untersuchungen an Tieren erfolgreich eingesetzt. Insbesondere hat die Anwendbarkeit bei der Visualisierung der Koronararterien, glomeruläre, Plazenta, und zerebralen Zirkulationen^{11,12,13,14,15} gezeigt. In diesem Papier ausführlich wir die Methodik der offenen Links-ventrikuläre Punktion für die intravasale Perfusion der bleihaltigen röntgendichten Silikon-Kautschuk, quantitativ charakterisieren BAPN-induzierte aortalen Pathologie in einem Mausmodell durch Mikro-CT.

Protocol

Die Protokolle für Tier Handhabung wurden durch die institutionelle Animal Care and Use Committee von der University of Maryland, Baltimore (tierische Protokoll-Nummer 0116024) genehmigt und nach AAALAC International Standards durchgeführt.

1. Vorbereitung der Reagenzien

1. Heparin
   1. Verdünnen Sie 250 µL von 1000 U/mL Heparin Sulfat in 50 mL Phosphat gepufferte Kochsalzlösung, eine Endkonzentration von 5 U/mL zu machen.
   2. Wärmen die heparinisierten (5 U/mL) Phosphat gepufferte Kochsalzlösung, die das Blut in das Gefäßsystem in einem Wasserbad, eingestellt auf 37 ° c ersetzen soll
   3. Bereiten Sie die druckgesteuerte Pumpe durch den Anschluss der erforderlichen Schläuche und 2 leeren 10-mL-Spritzen, 1 für den heparinisierten Kochsalzlösung Puffer und 1 für das Kontrastmittel.
   4. Füllen Sie den Schlauch mit der warmen heparinisierten Phosphat gepufferte Kochsalzlösung und entfernen Sie die Luftblasen aus den Schlauch von der Pumpe zu.
2. Kontrastmittel
   Hinweis: Bitte beziehen sich auf die Tabelle der Materialien für die Kontrast-Agent-Kit-Bestandteile.
   1. Mischen Sie eine pigmentierte Verbindung mit einem Verdünnungsmittel, eine 1:6-Farb Verdünnungsmittel-Verhältnis zu erreichen.
   2. Unmittelbar vor Gebrauch (Schritt 2.3.12) fügen Sie 200 µL Härtemittel, jedes 5-mL-aliquoten der verdünnten pigmentierten Verbindung und mischen sie gut (4 Volumenprozent).
      Hinweis: Der Hersteller berichtet, dass die Arbeitszeit beträgt 40 Minuten. Wie das Silikon-Kautschuk-Kontrastmittel beginnt, 20 min nach der Zugabe der Härtemittel polymerisieren, ist es wichtig, die Lösung unmittelbar vor der Infusion vorzubereiten.
3. BAPN Trinkwasser
   1. Lösen Sie β-Aminopropionitrile (BAPN auf) in Trinkwasser, eine Endkonzentration von 3 g/L (adaptiert von Protokollen, die bisher in der Literatur beschrieben)^9,16,17schaffen.
   2. Das BAPN-haltigen Trinkwasser zu einer Gruppe von Mäusen zu verwalten, sobald sie 4 Wochen alt bis zum Zeitpunkt der Perfusion für Mikro-CT sind.

2. chirurgische Verfahren

1. Tierische Vorbereitung
   1. Entwöhnen Sie die Mäuse im Alter von 3 Wochen zu, auf einem 12 h Licht/12 h dunklen Zyklus zu halten Sie und füttern Sie standard Nagetier Chow. Verwalten Sie für die BAPN-behandelten Gruppe frisch zubereitete BAPN Trinkwasser für 16-26 Wochen Ad Libitum. Bieten der Kontrolltiere mit standard trinken Wasser Ad Libitum.
2. Narkose-Technik
   Hinweis: 24 h vor der CT-Analyse, das folgende Verfahren wird durchgeführt. Chirurgische Eingriffe werden erlassen, um die Probe für eine Post-mortem intrakardialen Perfusion vorzubereiten.
   1. Induzieren Sie eine Narkose über eine Induktion Tank mit 100 % O₂ und 3 % Isofluran über eine Präzisions-Verdampfer geliefert. Unterbrechen Sie nach der Induktion der Anästhesie die Isoflurane und spülen Sie die Kammer mit O₂. Pflegen Sie die Narkose mit 2-2,5 % Isofluran und 1 L/min O₂ über eine Nase Kegel.
   2. Eine Kohle Schnitzeljagd für Abgas Adsorption zum Schutz des Personals zuordnen Sie der Induktion-Kammer und die Gesichtsmaske. Gewährleisten Sie eine ausreichende Narkose Flugzeug durch den Nachweis, dass gibt es keine Reaktion auf Schmerzreize (Zehe Prise).
   3. Bereiten Sie einen operativen Bereich, bestehend aus einem OP-Tray und die notwendige chirurgische Instrumente.
   4. Übertragen Sie das Tier, das OP-Feld zu und positionieren Sie es im dorsalen liegen.
3. Operationstechnik
   1. Mit Schere, machen Sie einen Mittellinie Schnitt durch die Haut und Weichgewebe von auf halbem Weg zwischen der Schambeinfuge, der sternalen Kerbe, erstreckt sich durch die Haut und Weichgewebe über dem Brustbein.
   2. Mit Schere, erstellen Sie ein Loch in der Membran am Xiphoid Prozeß der Brusthöhle eingeben.
   3. Mit einer Schere um die Membran der ventralen Brustwand, bilateral zu sezieren.
   4. Schnitt durch die kostalen Knorpel des Brustbeins an der Grenze rechts sternale Rippen getrennt.
   5. Anwenden einer feinen blutstillende Klemme an der Spitze des Brustbeins (in der Nähe der Xiphoid Prozeß) und der Gefäßklemme cranially zu bewegen, so dass es über den Kopf der Maus positioniert ist. Dies wird die Thymusdrüse und Brustbein vom Herzen, auszusetzen, das Herz und die großen Gefäße für weitere Manipulation zurückziehen.
   6. Sezieren Sie scharf Anlagen zwischen dem Herzen und der Brustwand.
   7. Verbinden Sie die 27-IV Katheter Nadel mit einer Spritze mit 10 mL heparinisierten Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (5 U/mL) vorinstalliert und füllen Sie alle Schläuche mit dem Puffer, um die Luftblasen aus den Rohren der Druckpumpe zu entfernen.
   8. Seien Sie vorsichtig bei der Vorbereitung der Flüssigkeit wie Seifenblasen in der Flüssigkeitsleitung kann die Füllung der kleineren Schiffe behindern. Beschränken Sie die Anzahl der Schiffe, die während der tierischen Vorbereitung beschädigt werden, dadurch wird das Kontrastmittel, aus den abgetrennten Schiffe auslaufen Ändern der Lautstärke für eine komplette Füllung und Einführung von Artefakten, die endgültige Bildgebung erforderlich.
   9. Punktion des linken Ventrikels mit einer 27-Gauge-Nadel, die mit einer rechtwinkligen Klammer stabilisiert wird. Sofort Einschneiden der rechten Herzkammer oder der minderwertigen Vena Cava, die Heparin-Lösung und das Blut abzulassen.
      Hinweis: Heparin wird als ein Antigerinnungsmittel verwendet, um zu verhindern, dass das Blut Blutgerinnung in den Gefäßen nach dem Tod des Tieres.
   10. Durchspülen Sie das Tier mit einer Konstanten Rate von 2 mL/min mit einem einzigen Spritzenpumpe. Beachten Sie die sichtbaren Blanchieren der Organe. Die Durchblutung weiter, bis die Perfusat ablassen aus dem venösen Kreislauf des Blutes (ca. 5-6 mL) frei ist. Stoppen Sie die Pumpe.
   11. Die 10-mL-Spritze, kümmert sich nicht um die Nadelposition in der linken Herzkammer unterbrechen trennen Sie den IV Katheter Schlauch.
   12. Sofort nach der kompletten Entbluten Agent kontrastmittellösung in 5-mL-aliquoten trennen und fügen Sie zu diesem Zeitpunkt die Härtemittel (siehe Schritt 1.2). Mischen sie gut. 5 mL des Kontrast-Agent-Mix in eine 10-mL-Spritze erarbeiten Sie und durchspülen Sie des Tieres mit sich.
   13. Für eine komplette Füllung der Gefäße (Arterien und Venen), weiter die Infusion über den Punkt, wenn es verlassen die venöse Lösung gesehen werden kann. Suchen Sie nach Anzeichen für eine erfolgreiche Perfusion einschließlich der Visualisierung von einem Casting-Agenten in den Koronararterien Pulmonalarterien, Darm und Leber Gefäßsystem.
   14. Das Kontrastmittel wird nach circa 20 min bei Raumtemperatur zu heilen. Ernten Sie nach Aushärtung die einzelnen Organe zu, je nach Bedarf, und in 10 % neutral gepuffertem Formalin fixieren. Ganze Schlachtkörper zu beheben, wenn die Proben nicht für Mikro-CT-Scan des Folgetages verwendet werden. Wenn die Kadaver am nachfolgenden Tag verwendet werden, positionieren Sie sie auf einem metalltablett und legen Sie sie im Kühlschrank bei 4 ° C über Nacht heilen.

3. Mikro-CT-Scan und Parameter

Hinweis: Die spezifischen Erwerb Bildparameter werden abhängig von der Maschine im Einsatz.

1. Berechnet-Tomographie Röntgenbilder von jeder Maus am Folgetag der Perfusions mit einem Mikro-CT-Scanner mit einer Röntgenröhre Spannung von 55 "KVP", einem Strom von 150 μA und einem System Vergrößerungsfaktor von 2.19 CCD Kamera Pixel binning Faktor 2 zu erwerben. Daraus ergibt sich eine effektive Pixelgröße von 29 µm.
   1. Die Maus-Karkasse Rückenlage auf dem Mikro-CT-Scanner-Tisch lag und erhalten ein Scout Röntgen-Scan.
   2. Der Detektor Sichtfeld von 57,4 mm (axial) x 37,1 mm (2D-Einzelschicht) auf dem Oberkörper auf die gesamte Länge der Aorta Bild zu konzentrieren.
   3. 180 Bildprojektionen mit einer Drehung Inkrement von 2 Grad und eine Zeit pro Projektion von 2800 ms zu erwerben.
2. Die Bilder mit Hilfe eines modifizierten Feldkamp Algorithmus zu rekonstruieren; Die rekonstruierte Voxel-Größe beträgt 29 x 29 x 29 µm³ (dicke Scheibe = 29 µm) mit der multimodalen 3D-Visualisierung Plug-in für die hier verwendete Software.

4. Nachbearbeitung und Rendern

1. Konvertieren Sie die CT-Daten in ein DICOM-Format unter Verwendung der entsprechenden Software.
2. Analysieren Sie die Bilder, um festzustellen, ob ein Aneurysma anwesend war. Messen des Nebenachse Durchmessers an der breitesten Stelle der Aortenbogen, thorakalen Aorta, absteigend und Bauchaorta wie oben beschrieben¹⁸ (Abbildung 1).
   Hinweis: In unserer Studie waren Bilder von zwei unabhängigen Beobachtern (eine geblendet) analysiert Nutzung einen DICOM-Viewer zu ermitteln, ob ein Aneurysma anwesend war. Gemessen wurde der Nebenachse Durchmesser an der breitesten Stelle der Aortenbogen, absteigende thorakale Aorta und Bauchaorta als zuvor beschriebenen¹⁹ (Abbildung 1). Bedeutet, dass nicht-aneurysmal arteriellen Segmente von BAPN unbehandelten Mäusen normalen Schiffs Durchmesser als die Alter abgestimmt Kontrollwerte gegründet.
3. Aneurysmen sind definiert als eine lokalisierte oder diffuse Dilatation der Aorta Segmente zu Durchmesser größer als 50 % von der Referenz-Durchmesser. Suchen Sie diese anhand der oben genannten Messungen.

Results

Für die Beurteilung dieses Protokolls wurden 20 männlichen Erwachsene Mäusen, gemischten Hintergrund als zuvor beschriebenen¹⁹ und 20-30 Wochen alt, mit oder ohne BAPN Behandlung mit einem bleihaltigen röntgendichten Silikon-Kautschuk durchblutet (siehe die Tabelle der Materialien ) unter Verwendung des oben genannten Protokolls. Sie unterzog sich Mikro-CT Scan am Folgetag (Abbildung 1 und

Discussion

Mikro-CT-Bildgebung kann verwendet werden, sehr detaillierte und dreidimensionale Rekonstruktionen von vaskulären Pathologie in Tiermodellen zu bieten. Durch den Einsatz von intravaskulären Kontrast verstärkt Medien können nicht verbessert Weichteile, z. B. das Lumen der Blutgefäße, von denen unterschieden werden, die stärken. Während Laser Doppler, Microangiography, Magnetresonanz-Angiographie, Histologie mit konfokale oder zwei-Photonen-Mikroskopie einzuschätzen vaskuläre Betten verwendet werden, sie in der Regel konze...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microfil	Flow Tech, Inc	MV-122	Wir verwenden Gelb, eine andere Farbe kann nach Wunsch bestellt werden. Das Kit enthält MV-Compound, MV-Diluent und MV-Curing Agent.
Heparin (1000 U/ml)	Sagent Pharmaceuticals	25021-400-10
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Corning	21-031-CV
Isofluran	Vet One, MWI	502017
3-Aminopropionitrilfumaratsalz	Sigma-Aldrich	A3134
Einzelspritzenpumpe	Fisher Scientific	14-831-200
27-Gauge Kopfhautvenen-Set Nadel	Exel Int	26709	27G x 3/4", 12" Schlauch
Inveon Micro-CT Scanner	Siemens Medical Solutions
Osirix MD	Pimxmeo SARL		Version 8.0.2
Inveon Research Workplace	Siemens Medical Solutions		Version 4.2
Nagetierfutter	Harlan Teklad	2018sx