A11-positiver β-Amyloid Oligomer Vorbereitung und Bewertung mit Dot-Blot-Analyse

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt, wie Aβ Oligomere aus einem synthetischen Peptid in Vitro vorzubereiten und relative Mengen der Aβ Oligomer durch eine Dot-Blot-Analyse zu bewerten.

Zusammenfassung

Β-Amyloid (Aβ) ist eine hydrophobe Peptid mit innewohnende Tendenz zu Aggregaten selbst zusammenstellen. Unter den verschiedenen Aggregaten Aβ Oligomer ist weithin anerkannt als der führende Nervengift in der Entwicklung der Alzheimer-Krankheit (AD) und gilt als das entscheidende Ereignis in der Pathogenese der AD. Daher könnte Aβ-Oligomer-Inhibitoren verhindern Neurodegeneration und haben das Potenzial, als Disease modifying entwickelt werden Behandlungen von AD. Jedoch führen verschiedene Bildung Protokolle von Aβ Oligomer Oligomere mit unterschiedlichen Eigenschaften. Darüber hinaus gibt es nicht viele Methoden, um effektiv Bildschirm Aβ_1-42 Oligomer-Inhibitoren. Ein A11 Antikörper reagieren mit einer Teilmenge der giftige Aβ-_1-42 -Oligomer mit antiparallele β-Sheet-Strukturen. In diesem Protokoll beschreiben wir, wie zur Vorbereitung einer A11-positiven Aβ_1-42 Oligomer-reiche Probe aus einem synthetischen Aβ_1-42 Peptid in Vitro und relative Mengen der A11-positiven Aβ_1-42 Oligomer in Proben von einem Dot-Blot auswerten Analyse mit A11 und Aβ_1-42-spezifischen 6E10 Antikörper. Unter Verwendung dieses Protokolls, können Inhibitoren der A11-positiven Aβ_1-42 Oligomer auch von semi-quantitativen experimentellen Ergebnisse gezeigt.

Einleitung

Alzheimer-Krankheit (AD) ist eine der wichtigsten neurodegenerativen Erkrankungen bei älteren Menschen weltweit¹. Es ist weithin anerkannt, dass die abnorme Ansammlung von β-Amyloid (Aβ) möglicherweise der führenden pathologischen Faktor von AD. Aβ-Aggregate sind die Hauptbestandteile der senilen Plaques, eines biologischen Markern in den Gehirnen von Alzheimer-Patienten. Darüber hinaus produzieren Aβ-Aggregate, insbesondere Oligomere potente Neurotoxizität, die möglicherweise die Ursache des neuronalen Tod AD Fortschreiten. Daher könnte die Hemmung der Aβ Oligomer Bildung Neurodegeneration verhindern und Aβ-Oligomer-Inhibitoren entwickelt werd....

Protokoll

1. Vorbereitung der Lösung

Hinweis: Siehe Tabelle der Materialien für Reagenz Quellen.

1. Bereiten Sie eine 5 % Rinderserumalbumin (BSA) Lösung durch Zugabe von 5 g BSA zu 100 mL bidestilliertem Wasser. Mischen Sie sie vollständig durch Vortexen sie. Speichern Sie die Lösung bei 4 ° C für bis zu 1 Monat.
2. Bereiten Sie eine Anti-Oligomer Antikörperlösung A11 (1:1 000) durch Zugabe von 10 µL der Stammlösung Antikörper zu 10 mL der Lösung 5 % BSA. Mischen Sie sie vollständig durch Vortexen sie. Speichern Sie die Lösung bei 4 ° C für bis zu 1 Monat.
3. Bereiten Sie eine Anti-Aβ Antikörper 6E10 Lösung (1:1....

Ergebnisse

Um zu untersuchen, ob eine Aβ-_1-42 -Monomer eine Aβ-_1-42 -Oligomer nach der Zubereitung bilden kann, wurde TEM Analyse verwendet. Keine sichtbaren Aggregate wurden in der HFIP aufgelöst Aβ_1-42 Monomer Probe (Abb. 1A) beobachtet. Darüber hinaus vor allem kugelige Aggregate mit einem Durchmesser von rund 10-80 nm beobachtet in der Aβ-_1-42 -Probe nach 48 h schütteln, was darauf hindeutet, dass Aβ_1.......

Diskussion

In diesem Protokoll haben wir eine Methode zur Vorbereitung von Proben mit Aβ_1-42 Oligomer und die Beträge der A11-positiven Aβ_1-42 Oligomer durch einen Punkt Blot Analyse analysieren berichtet. Obwohl unsere Methoden für die Erstellung von Aβ_1-42 Oligomer-reiche Proben ganz einfach, zuverlässig und reproduzierbar sind, gibt es noch einige Punkte zu beachten. Erstens wird HFIP verwendet, um synthetische Aβ-_1-42 -Peptid auflösen. Eine aggregierte Aβ-_1-42 -Peptid kann .......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
A11 (ab126892 Rb pAb zu Amyloid-Oligomeren)	Abcam	GR91739-58
6E10 (Beta-Amyloid-Kaninchen-Ab)	Zelle  Signaltechnologie	2454S
OC (Anti-Amyloidfibrillen OC Antikörper)	Millipore	AB2286
Meerrettichperoxidase (HRP) Marker Ziege Anti Kaninchen IgG (H+L)	Beyotime	A0208
Aβ 1-42	GL Biochem	52487
1,1,1,3,3,3-Hexafiuoro-2-propanol	Aladdin	I1523078
Curcumin	Sigma	C1386
Albumin Rind V	Solarbio	A8020
Natriumchlorid	Sangon Biotech	D920BA0003
Natriumdodecylsulfat	SCR	30166428
TRIS	Solarbio	T8060
Glycin	Solarbio	G8200
Dimethylsulfoxid	Solarbio	D8370
5&fach; nicht-denaturierendes Gel PAGE Protein Marker	Beyotime	P0016
Genshare CFAS anyKD PAGE	Genshare	JC-PE022
Reine Nitrocellulose Blotting Membrane	Pall Corporation	T50189
Methanol	SCR	10014118
Ethanol	SCR	10009218
Super niedriger Bereich  Protein Marker	Solarbio	PR1300
Transfer Membranes	Immobilon-PSQ	ISEQ00010
BeyoECL Star	Beyotime	P0018A
Commassie Blue Schnelle Färbelösung	Beyotime	P0017
All - automatisches Chemilumineszenz-Bildgebungssystem	Tanon	Tanon 5200
Image J	National Institute of Health
Bildverarbeitungssoftware	Adobe	Photoshop CS6
Magnetrührwerk	Shanghai Huxi