Methodenartikel

Polysome Profilerstellung in Leishmaniose, menschliche Zellen und Maus Hoden

DOI:

10.3791/57600

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8. April 2018

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1Department of Cell Biology and Biochemistry, Texas Tech University Health Sciences Center, 2Department of Biological Sciences, Texas Tech University, 3CISER (Center for the Integration of STEM Education & Research), Texas Tech University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Das übergeordnete Ziel der Polysome Profilerstellung Technik ist Analyse der übersetzerischen Tätigkeit der einzelnen mRNAs oder Transkriptom mRNAs während der Proteinsynthese. Die Methode ist für Studien von Protein-Synthese-Verordnung, Übersetzung Aktivierung und Repression in Gesundheit und mehrere menschliche Krankheiten wichtig.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Richtige Protein-Expression zum richtigen Zeitpunkt und in der richtigen Menge ist die Grundlage der normalen Zellfunktion und Überleben in einer sich schnell verändernden Umgebung. Für eine lange Zeit dominierten die genexpressionsstudien Forschung auf transkriptioneller Ebene. Jedoch die Steady-State Ebenen der mRNAs nicht korrelieren gut mit Protein-Produktion und die Übersetzbarkeit von mRNAs variiert stark je nach Bedingungen. In einigen Organismen, wie den Parasiten Leishmaniaist die Proteinexpression vor allem auf der translationalen Ebene geregelt. Jüngste Studien gezeigt, dass dieses Protein Übersetzung Dysregulation mit Krebs, Stoffwechselstörungen, neurodegenerativen und anderen Krankheiten des Menschen verknüpft ist. Polysome Profilerstellung ist eine leistungsfähige Methode, Protein Übersetzung Verordnung zu studieren. Es ermöglicht die translationalen Status der einzelnen mRNAs zu messen oder Übersetzung auf einer genomweiten Skala zu untersuchen. Die Grundlage dieser Technik ist die Trennung von Polysomes, Ribosomen, deren Untereinheiten und kostenlose mRNAs bei der Zentrifugation von einer zytoplasmatischen lysate durch einen Farbverlauf von Saccharose. Hier präsentieren wir Ihnen eine universelle Polysome Profilerstellung verwendete Protokoll auf drei verschiedenen Modellen - Parasiten Leishmania großen, kultivierten Zellen der menschlichen und tierischen Geweben. Leishmaniose Zellen wachsen frei schwebend und kultivierte menschlichen Zellen wachsen in adhärenten Monolage während Maus Hoden eine tierisches Gewebeprobe darstellt. Somit ist die Technik an all diese Quellen angepasst. Das Protokoll für die Analyse der polysomal Brüche beinhaltet Erkennung von einzelnen mRNA-Niveaus von RT-qPCR Proteine durch Western-Blot und Analyse der ribosomalen RNAs durch Elektrophorese. Die Methode kann durch Untersuchung der mRNAs Association mit dem Ribosom auf Transkriptom Ebene durch tiefe RNA-Seq und Analyse des Ribosom-assoziierte Proteine durch Massenspektroskopie der Fraktionen erweitert werden. Die Methode ist leicht zu anderen biologischen Modellen einstellbar.

Einleitung

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Regulation der Genexpression in den Zellen wird durch transkriptionelle, posttranskritionelle und posttranslationale Mechanismen gesteuert. Fortschritte in der Tiefe RNA Sequenzierung ermöglichen die Untersuchung der stationären mRNA-Niveaus auf einer genomweiten Skala auf einem noch nie da gewesenen Niveau. Neuere Erkenntnisse ergaben jedoch, dass stationäre mRNA Ebene nicht immer mit Protein Produktion1,2 korreliert. Das Schicksal eines einzelnen Niederschrift ist sehr komplex und hängt von vielen Faktoren wie interne/externe Reize, Stress, etc.. Regulation der Genexpression während der Proteinsynthese bietet eine weitere Schicht von Expressions notwendig für eine schnelle Reaktion in wechselnden Bedingungen. Polysome (oder "Polyribosome"), die Profilierung, die Trennung und Visualisierung von Ribosomen, aktiv zu übersetzen ist eine leistungsfähige Methode, die Regulierung der Proteinsynthese zu studieren. Obwohl die ersten experimentellen Anwendungen in den 1960er Jahren3erschien, ist Polysome Profilerstellung derzeit eine der wichtigsten Techniken in Protein Übersetzung Studien4. Einzelnen mRNAs kann durch mehrere Ribosomen führt zur Bildung von einem Polysome übersetzt werden. Protokolle können auf Ribosomen mit Cycloheximide5 ins Stocken geraten und mRNAs mit unterschiedlichen Anzahlen von Polysomes getrennt werden können, in den Prozess der Polysome Fraktionierung von Saccharose gradient Ultrazentrifugation6,7 , 8 , 9. RNA Analyse der polysomal Brüche dann erlaubt Messung von Veränderungen in der translationalen Staaten der einzelnen mRNAs auf Genom-weite Skala und bei verschiedenen physiologischen Bedingungen4,7, 10. die Methode wurde auch verwendet, um offenbaren die Rollen von 5' UTR und 3' UTR-Sequenzen in der Steuerung von mRNA Übersetzbarkeit11, untersuchen die Rolle der MiRNAs in translational Repression12, entdecken Mängel im Ribosom Biogenese13 , und die Rolle des Ribosom-assoziierte Proteine mit menschlichen Krankheiten14,15verstehen. Während des letzten Jahrzehnts entstanden eine immer größere Rolle für die Regulation der Genexpression während der Übersetzung, die ihre Bedeutung im menschlichen Krankheiten zeigt. Der Beweis für translational Control in Krebs, Stoffwechselstörungen und neurodegenerativen Erkrankungen ist überwältigend15,16,17,18. Z. B. Dysregulation eIF4E-abhängige translational Steuerung trägt zum Autismus im Zusammenhang mit Defiziten15 und FMRP engagiert sich in der Ribosomen im Zusammenhang mit Autismus14mRNAs abwürgen. Polysomal Profilierung ist somit ein sehr wichtiges Instrument, um Mängel in translational Regelung in mehrere menschliche Krankheiten zu studieren.

Protein-Analyse der polysomal Brüche unter verschiedenen physiologischen Bedingungen seziert die Funktion der Faktoren im Zusammenhang mit Ribosomen während der Übersetzung. Die Polysome Profilerstellungs-Technik ist in vielen Arten wie Hefe, Säugetier-Zellen, Pflanzen und Protozoen10,19,20,21verwendet worden. Protozoen-Parasiten wie Trypanosomen und Leishmanien begrenzte transkriptionelle Kontrolle der Genexpression aufweisen. Ihre Genome sind in Polycistronic Gen-Cluster organisiert, die Promoter-regulierte Transkription22fehlt. Developmental Genexpression wird hingegen überwiegend auf der Ebene der Protein-Übersetzung und mRNA Stabilität in Trypanosomatid Arten23,24gesteuert. Deshalb Verständnis für translationale Kontrolle bei fehlender transcriptional Regelung für diese Organismen besonders wichtig. Polysomal die Profilerstellung ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur posttranskritionelle Regulation der Genexpression in Leishmaniose25,26,27,28zu studieren.

Die jüngste Fortschritte in der Erkennung der einzelnen mRNAs Ebenen von Real time quantitative PCR (RT-qPCR) und volle Transkriptom Sequenzierung der nächsten Generation sowie Proteomics Technologien, Auflösung und Vorteile des polysomal profiling auf ein neues Niveau bringt. Die Verwendung dieser Methoden kann durch Analyse der einzelnen polysomal Fraktionen durch tiefe RNA-Sequenzierung zusammen mit Proteomic Analyse der translationalen Statusüberwachung von Zellen in einer genomweiten Skala erweitert werden. Dies ermöglicht die Identifizierung neuer molekularer Spieler Regulierung Übersetzung unter verschiedenen physiologischen und pathologischen Bedingungen. Hier präsentieren wir eine universelle Polysome Profilierung auf drei verschiedenen Modellen verwendete Protokoll: die Parasiten Leishmania großen, kultivierten menschlichen Zellen und tierischen Geweben. Beratung präsentieren bei der Vorbereitung der Zelle Lysates wir aus verschiedenen Organismen, Optimierung der Gradientenbedingungen, Auswahl von RNase-Inhibitoren und Anwendung von RT-qPCR, Western-Blot und RNA-Elektrophorese Polysome Brüche in dieser Studie zu analysieren.

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Protokoll

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Alle tierischen Behandlungen und Handhabung von Geweben, die in der Studie gewonnen wurden nach Protokolle durch die institutionelle Animal Care and Use Committee an der Texas Tech University Health Science Center in Übereinstimmung mit den National Institutes of genehmigt durchgeführt. Gesundheit Tierschutzrichtlinien, Protokollnummer 96005. Bitte Wirbeltieren zu Opfern und Gewebe nach den Richtlinien von der institutionellen Animal Care und Nutzung vorbereiten. Fehlt einen solcher Ausschuss entnehmen Sie bitte der National Institutes of Health Tierschutzrichtlinien. Erwachsene (> 60 Tage alten) C57BL/6 Mäusen verwendet wurden. Alle Tiere und Geweben wurden nach Protokollen durch die institutionelle Animal Care and Use Committee an der Texas Tech University Health Sciences Center in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Tierschutzrichtlinien genehmigt erhalten. Für Euthanasie, wurde ein einziger Mausklick in eine kleine Kammer platziert, und die Luft wurde allmählich verdrängt, mit ca. 30 % Kohlendioxid zu betäuben und die Not des Tieres zu minimieren. Nach Beendigung der Atmung verwendeten wir zervikale Dislokation um den Tod des Tieres vor der Ernte Gewebe zu bestätigen.

Achtung: Alle Arbeiten mit live Leishmaniose und kultivierten menschlichen Zellen erfolgte im Biosafety Schrank in zertifizierten Labors BSL-2.

1. Vorbereitung der zytoplasmatischen Lysates aus Leishmania große , kultivierten menschlichen Zellen und Geweben Maus

Hinweis: Es gibt einige Unterschiede in der lysate Zubereitungen aus verschiedenen Ausgangsstoffen. Weitere Schritte einschließlich Saccharose gradient Vorbereitung und polysomal Fraktionierung sind identisch und hängen nicht Aufnahmequelle.

  1. Leishmaniose großen zytoplasmatischen lysate Vorbereitung
    1. Impfen Leishmania große (FV1-Stamm) Zellen in 1 x M199 mittlere29 , 10 % fetalen Bovine Serum (FBS) und Penicillin/Streptomycin Mischung enthält 30 mL (100 Einheiten und 100 μg/mL entsprechend)in Dichte von 1 x 105 Zellen/mL .
      Hinweis: Alle Schritte mit Leishmania große Zellen müssen in ein Kabinett Biosafety durchgeführt werden.
    2. Zellen in den Inkubator und wachsen sie bei 27 ° C bis zur logarithmischen Phase (Mitte Log entspricht 5 x 106 Zellen/mL). Es dauert in der Regel etwa zwei Tage um zu wachsen.
    3. Fügen Sie Cycloheximide Leishmania große Kultur, eine Endkonzentration von 100 μg/mL, die Ribosomen auf übersetzten mRNAs zu verhaften. Setzen Sie Zellen wieder in den Inkubator für 10 min bei 27 ° C.
    4. Nachdem Cycloheximide Behandlung abgeschlossen ist, Zellen auf eine 50 mL konische Rohr übertragen und mit 1.800 x g und 4 ° C für 8 min. verwerfen überstand drehen.
    5. Zellen mit 30 mL Dulbeccos Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (DPBS) zu waschen. Zentrifuge bei 1.800 x g und 4 ° C für 8 Minuten.
    6. Verwerfen Sie den überstand. Zellen in 1 mL des DPBS aufzuwirbeln.
    7. Nehmen Sie eine Aliquote von Zellen und mischen Sie es mit 3,5 % Formaldehyd-Lösung.
    8. Zählen von Zellen durch Hemocytometer und ihre Konzentration zu bestimmen. Übertragen Sie die gewünschte Anzahl von Zellen in Microfuge Rohr. Lysate zubereitet aus 0.5x108-2 x 108 Zellen/mL ist ausreichend für eine Saccharose gradient laden.
    9. Drehen Sie die Zellen bei 1.800 x g und 4 ° C für 8 min. Überstands verwerfen.
    10. Aufschwemmen der Zelle Pellet auf Eis in 1 mL Lyse-Puffer mit Protease-Inhibitoren und RNase-Inhibitor (20 mM HEPES-KOH, pH 7,4, 100 mM KCl, 10 mM MgCl2, 2 mM DVB-t, 1 % NP-40, 1 X Proteaseinhibitor cocktail (EDTA-frei), 200 Einheiten/mL RNase-Inhibitor).
    11. Durchlaufen der lysate eine 23-Gauge-Nadel dreimal. Die lysate sollte nach dem Durchtritt durch die Nadel durchsichtig.
    12. Zentrifuge bei 11.200 x g und 4 ° C für 10 min, lysate zu klären. Übertragen die geklärte lysate, eine neue tube und lassen Sie ihn auf Eis bis Saccharose gradient Ultrazentrifugation.
    13. Sammeln 400-500 μL der lysate als Eingabe (für später zu analysieren), fixieren Sie sie sofort in flüssigem Stickstoff für zukünftige Proteinanalytik oder fügen Sie RNA Reinigung Reagenz vor dem Einfrieren für RNA-Analyse.
  2. Zytoplasmatischen lysate Vorbereitung von kultivierten menschlichen HeLa-Zellen
    1. HeLa-Zellen teilen und Säen sie in 20 mL des Mediums DMEM mit 10 % FBS und Penicillin/Streptomycin Mischung (100 Einheiten und 100 μg/mL entsprechend) mit Zelle zählen 2 x 105 Zellen/mL in einer 15 cm-Platte.
    2. HeLa-Zellen bei 37 ° C, 5 % CO2 für 20-24 h. Perform Plasmid DNA Transfektion laut des Herstellers Protokolle zu wachsen.
    3. Zellen für 24 h nach Transfektion bei 37 ° C, 5 % CO2zu propagieren.
    4. Gewachsenen HeLa-Zellen auf die Endkonzentration von 100 μg/mL, die Ribosomen auf übersetzten mRNAs zu verhaften und inkubieren Sie Zellen für 10 min bei 37 ° C, 5 % CO2fügen Sie Cycloheximide hinzu. Aspirieren Sie Medium. Waschen Sie die Zellen zweimal mit kalten DPBS auf Eis.
    5. Die Platte 500 μL der Lyse Puffer (20 mM HEPES-KOH pH 7.4, 100 mM KCl, MgCl2, 1 mM DTT, 0,5 % NP-40, 1 X Proteaseinhibitor cocktail (EDTA-frei), 5 mM 200 Einheiten/mL von RNase-Inhibitor oder 1 mg/mL Heparin) hinzu und kratzen Sie die Zellen auf dem Eis zu.
    6. Übertragen Sie die lysierten Zellen auf das Microfuge Rohr. Passen Sie die Konzentration der NP-40 um 0,5 % und MgCl2 bis 5 mM je nach das erhöhte Volumen der Probe.
    7. Durchlaufen der lysate eine 23-Gauge-Nadel 3 - 6 Mal.
    8. Drehen Sie bei 11.200 x g und 4 ° C für 8 min, lysate zu klären. Übertragen Sie nach Zentrifugation überstand auf einen neuen Schlauch. Verwenden Sie ein Spektralphotometer auszuwertende Zelleffizienz Lyse und Probenmenge für die Verladung auf die Steigung bestimmen. 0,5 mL 0,1 % 10 μl Probe hinzufügen Sodium Dodecyl Sulfat (SDS). Leere gegen 0,1 % SDS. Messung der Absorption bei 260 nm. Erwartete Absorption Wert liegt um 15-20 Einheiten/mL.
    9. Verdünnen Sie alle Proben mit Lyse Puffer auf den gleichen Wert der Extinktion vor Saccharose-Gradienten-Zentrifugierung. Bewahren Sie die Proben auf Eis bis Saccharose-Gradienten-Zentrifugierung.
  3. Zytoplasmatischen lysate Vorbereitung von Maus Hoden
    1. Sezieren Sie die Maus-Hoden. Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Tunica Albuginea und sammeln Sie die seminiferous Röhrchen der Hoden und übertragen Sie sie in einem 15 mL konische Röhrchen mit 5 mL des DPBS mit 0,1 mM Phenylmethylsulfonyl Fluorid (PMSF) ergänzt.
    2. Mischen Sie das Gewebe durch invertieren mehrmals kräftig. Lassen Sie das Gewebe auf Einheit Schwerkraft auf Eis für 5 min zu begleichen.
    3. Entfernen Sie und entsorgen Sie den bewölkten Puffer mit verbindenden Zellen und gewebefragmente. Wiederholen Sie den Vorgang 2-3 mal mehr. Die verbleibenden weißen Pellet wird für seminiferous Röhrchen und Keimzellen bereichert.
    4. Übertragen von seminiferous Röhrchen Pellet zu einem 2 mL Microcentrifuge Schlauch und Spin bei 500 X g für 1 min. Überstands verwerfen.
    5. Die Tubuli 500 µL Puffer Lyse (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 100 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0,5 % NP-40, 1 X Proteaseinhibitor cocktail (EDTA-frei), 1 mg/mL Heparin oder 200 Einheiten/mL RNase-Inhibitor) hinzufügen. Verwenden Sie eine Pipette, um das Gewebe genannte.
    6. Übertragen Sie die Aussetzung zu einem kleinen (0,5-1,0 mL) Dounce-Homogenisator. Das Gewebe mit sieben bis acht Striche von der Glas-Stößel zu stören.
    7. Übertragen Sie die lysate auf einen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch.
    8. Zentrifugieren Sie Probe bei 12.000 x g und 4 ° C für 8 min, der lysate zu löschen. Übertragen Sie den überstand auf eine neue Röhre und speichern auf Eis bis Laden auf der Saccharose-Gradient.
    9. Sammeln Sie 50 μL der lysate als eingabesample, fixieren Sie sie sofort bei-80 ° C für zukünftige Protein-Analyse; oder fügen Sie RNA Reinigung Reagenz vor dem Einfrieren für RNA-Analyse.

(2) Saccharose Gradient Vorbereitung und Ultrazentrifugation

  1. Bereiten Sie zwei Saccharose gradient Lösungen (20 mM HEPES-KOH, pH 7,4, 100 mM KCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DVB-t, 1 X Proteaseinhibitor cocktail), mit 10 % Saccharose oder 50 % Saccharose. (Tris-HCl, pH 7,4, kann anstelle von HEPES verwendet werden). Fügen Sie 200 Einheiten/mL RNase-Inhibitor oder 1 mg/mL Heparin nach dem experimentellen Design. Legen Sie eine Ultrazentrifuge Rohr für SW 41 Rotor in der Marker-Block und zeichnen Sie die Linie entlang der oberen Ebene des Blocks. Übertragen Sie das Rohr in einem stabilen Gestell.
  2. Nehmen Sie eine 10-mL-Spritze mit der Schichtung Gerät angeschlossen und füllen Sie die Spritze mit 10 % Saccharoselösung (wie oben beschrieben vorbereitet). Lassen Sie ihn sanft an der Unterseite des Rohres Ultrazentrifugen, bis die Markierung auf das Rohr erreicht.
  3. Füllen Sie eine weitere Spritze mit 50 % Saccharoselösung und legen Sie seine Schichtung Gerät durch die 10 % Saccharose Schicht auf dem Boden des Röhrchens. Lösen Sie sanft Saccharoselösung von unten beginnend, bis die Markierung auf das Rohr erreicht. Verschließen Sie das Röhrchen mit der mitgelieferten Kappe.
  4. Schalten Sie zur Vorbereitung der Saccharose-Gradient der Farbverlauf Maker Gerät ON. Ebene der Platte mit UP oder DOWN Tasten und drücken Sie Fertig. Nivellierung ist wichtig für die Linearität des Farbverlaufs.
  5. Nach dem Abgleich der plattenpresse GRAD um den Farbverlauf Menü zu öffnen. Zur Liste im Farbverlauf Menü und wählen Sie den Rotor SW 41 Ti. Wählen Sie aus der Liste im Menü mit UP und DOWN Tasten die gewünschte Saccharose Steigung. Presse Verwendung.
  6. Ort der gradient Schlauchhalter auf den Farbverlauf Maker-Platte. Übertragen Sie das Röhrchen in den Halter. Bis zu 6 Steigungen können gleichzeitig zubereitet werden. Drücken Sie auf Ausführen. Die Farbverlauf Maker dreht die Rohre mit der programmierten Geschwindigkeit und Winkel bilden einen linearen Farbverlauf. Es dauert nur ein paar Minuten um den Farbverlauf vorzubereiten.
  7. Wenn der Prozess abgeschlossen ist, legen Sie die Rohre in einem Rack. Nehmen Sie die Kapseln aus. Entfernen Sie das gleiche Volumen wie das Probenvolumen von der Oberseite der Ultrazentrifuge Röhren.
  8. 400-500 μL der lysate mit 15-20260 Einheiten des Polysomes auf der Oberseite sorgfältig zu laden. Legen Sie die Rohre in den Rotor-Eimern und auszugleichen.
  9. Zentrifuge bei 260.000 x g und 4 ° C für 2 h mit SW 41 Rotor.

3. Polysome Fraktionierung und Probenentnahme

Hinweis: Während lysate Vorbereitungen einige Unterschiede je nach Quelle haben, gradient Vorbereitung und Polysome Fraktionierung Protokolle sind die gleichen für alle Arten von Lysaten.

  1. Legen Sie nach Abschluss der Ultrazentrifugation die Rotor-Eimer mit den Rohren auf Eis. Schalten Sie Fraktionssammler und gradient plasmafraktionierer ON. Klicken Sie im Menü plasmafraktionierer Scannen . Genommen Sie eine Rack mit 24 Röhrchen in den Fraktionssammler.
  2. Füllen Sie auf der Seite der plasmafraktionierer mit entionisiertem Wasser spülen Reservoir. Drücken Sie die Taste spülen für 10 s, die Pumpe auf plasmafraktionierer zu spülen. Legen Sie einen spülen-Adapter mit der Spritze mit Wasser gefüllt um die Kolben für die Kalibrierung.
  3. Öffnen Sie die plasmafraktionierer-Software auf dem Computer. Presse zu kalibrieren. Verwenden Sie die Standard- Einstellungen und drücken Sie "OK". Bereit sein, Wasser aus Spritze injizieren.
  4. Drücken Sie "OK" , um die Kalibrierung zu tun. Sofort starten Einspritzen von Wasser für die nächsten 5 s. Während dieser Zeit Wasser fließt durch die UV-Detektor-Durchflusszelle und das Gerät kalibriert werden. Wird erscheinen das Zeichen Null Kalibrierung abgeschlossen . Das Gerät ist bereit für die Fraktionierung.
  5. Entfernen Sie die spülen-Adapter mit der Spritze. Legen Sie einen Tipp auf den Kolben des plasmafraktionierer.
  6. Öffnen Sie die Messing Luft Ventil und Presse AIR -Taste für 10 s zu trockene Schläuche und Messzelle. Schließen Sie das Luftventil.
  7. Schonend Entfernen der Gradienten Röhre aus dem Rotor-Eimer und legen Sie sie in das Rack. Gelten Sie die Rohr-Halter GAP an die Spitze des Rohres und vorsichtig bewegen Sie das Rohr im Rohr-Halter und Position einrasten.
  8. Bringen Sie die Halterung unter dem Kolben der plasmafraktionierer. Oft, können polysomal Bänder mit Auge gesehen werden. Stellen Sie die gewünschten Einstellungen für Bruchteil Zahlen und Volumen (24 Fraktionen zu 500 μL/Bruchteil sind in der Regel ausreichend). Benennen Sie die Datei entsprechend. Drücken Sie "OK"und Gehen zum Diagramm -Taste. Drücken Sie im nächsten Fenster START SCAN. Einstellungen angezeigt werden, drücken Sie "OK". Kollektor wird nach der ersten Fraktion aus der Gosse und der Kolben bewegt sich in die Röhre. Wenn der Kolben die Spitze des Farbverlaufs erreicht wird es langsam zu der gewählten Geschwindigkeit und die Fraktionen werden gesammelt. Nach Fertigstellung, bewegt den Kolben aus dem Farbverlauf Rohr.
  9. Öffnen Sie den Messing Luft Ventil und Presse Luft Schlüssel auf der plasmafraktionierer der letzten Bruchteil abrufen.
  10. Verschieben Sie die Rohre aus dem Rack auf Eis.
  11. Fügen Sie 2 Bände von RNA Reinigung Reagenz zu jedem Bruchteil und Blitz einfrieren in flüssigem Stickstoff bis RNA Reinigung. Alternativ, wenn Protein werden analysiert muss, fügen Sie Trichloressigsäure Säure die Endkonzentration von 10 % für Western blotting (siehe Abschnitt 8) zu konzentrieren hinzu.

4. Vorbereitung der synthetische RNA In vitro- Normalisierung der mRNAs Ebenen bei RT-qPCR Datenanalyse

Hinweis: Die E. Coli OmpA mRNA dient in diesem Protokoll zur Normalisierung. Anderen RNA, die keinen umfassenden Identität mit der mRNAs des untersuchten Organismus (Säugetier oder Leishmaniose) verwendet werden.

  1. Bereiten Sie das OmpA DNA-Fragment mit SP6 promotorsequenz durch eine standard-PCR-Reaktion aus einem Plasmid enthält OmpA gen30.
  2. 100 µL der Mischung vorbereiten: 80 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 16 mM MgCl2, 2 mM Spermidine, 10 mM DTT, 3 mM ATP, CTP, 3 mM 3 mM UTP, 3 mM GTP, 0,5 U/μl RNase-Inhibitor, 1 μg OmpA PCR DNA, 3 μL SP6 RNA-Polymerase , 0,005 U/μl Pyrophosphatase.
  3. Bei 40 ° C für 2 h inkubieren.
  4. Reinigen Sie RNA durch ein RNA-Reinigung-Kit.
  5. Konzentration von Spektralphotometer Messen und prüfen von Agarose-Gelelektrophorese.

(5) RNA isoliert von Gradient Brüche und cDNA Vorbereitung

Hinweis: Fahren Sie direkt mit diesem Protokoll zur Reinigung von RNA, wenn ein RNase-Inhibitor als Ribonuklease-Inhibitor verwendet wurde. Jedoch beim Einsatz als eine Ribonuklease-Inhibitor wird Heparin hemmen Reverse Transkriptase in cDNA Zubereitung verwendet. Zusätzliche Reinigung von RNA wird daher erforderlich sein, wenn Heparin in der Lyse Puffer und Farbverlauf verwendet wurde. Siehe Abschnitt 6, RNA für die cDNA-Synthese vorzubereiten, wenn Heparin verwendet wurde.

  1. Tauen Sie die Proben, die RNA-Reinigung-Reagenz, fügen Sie 20 ng synthetische RNA als interne Kontrolle für die Normalisierung der RT-qPCR Ergebnisse. Gehen Sie mit RNA Zubereitung nach Protokoll des Herstellers mit Ausnahme einer Änderung. Fügen Sie 1 µL RNA Grade Glykogen (20 µg) vorherige Isopropanol Niederschlag. RNA-Pellets in 20-25 µL RNase-freies Wasser auflösen.
    Hinweis: Glykogen als Träger dient und hilft, um Verluste zu vermeiden und RNA Pellet während der Reinigung zu visualisieren. OmpA mRNA dient zur weiteren Normalisierung in RT-qPCR Reaktionen.
  2. Messen Sie RNA-Konzentration mit Spektralphotometer zur angemessenen Ertrag zu gewährleisten. Gleiche Volumina der RNA Brüche mit 40er, 60er und Monosomes als Prepolysomes zu kombinieren. Brüche mit 2-4 Ribosomen zu kombinieren, als leichte Polysomes und Brüche mit 5-8 Ribosomen als schwere Polysomes zu kombinieren.
  3. Verwenden Sie 5-10 µL RNA aus kombinierten Fraktionen cDNAs mithilfe eines Kits und nach Empfehlungen des Herstellers vorbereiten.
  4. 20 µL cDNA 80 µL Nuklease freies Wasser hinzufügen. Einfrieren der cDNA-Proben bei-20 ° C.

(6) RNA-Reinigung von Heparin Kontamination

Hinweis: Heparin hemmt Nukleinsäure Verarbeitung Enzyme wie Reverse Transkriptase. Daher verwenden Sie dieses zusätzliche Reinigung-Protokoll, wenn Heparin im Puffer Lyse und/oder im Farbverlauf verwendet wird.

  1. Hinzu kommt eine Endkonzentration von 1 M zu den gereinigten RNA-Proben LICI.
  2. Mischen Sie die Proben und inkubieren Sie für 1 Stunde auf Eis.
  3. Drehen Sie die Proben bei 16.000 x g und 4 ° C für 15 Minuten.
  4. Den überstand so vollständig wie möglich mit einer Pipette zu entfernen.
  5. Trocknen Sie die Pellets für ca. 5 min an der Luft.
  6. Wieder aussetzen Sie, die Pellets in das Ausgangsvolumen der RNase-freies Wasser.
  7. Führen Sie photometrische Messung bei 260 nm zur Bestimmung der Konzentration der RNA. Der Verlust der Probe ist in der Regel minimal.

(7) RT-qPCR und Datenanalyse der mRNA Distribution

  1. 10.2 μL des Wassers, 20 μL der SYBR Green, 4.8 μL gen spezifische Primer (2,5 μM eingestellt), 5 μl cDNA zu kombinieren, gut mischen und 384-Well-Platte 10 μL pro Well in Triplicates bestücken.
  2. Abdeckplatte mit Klebefilm fest und Platte bei 1.800 x g für 5 min zentrifugieren.
  3. Mit einem Real-Time PCR Instrument einrichten qPCR Reaktion unter Bedingungen, die in Tabelle 1dargestellt.
  4. Mit der Zyklus-Schwelle (C-T) berechnen Werte und die vergleichende CT (ΔΔCT) Methode31 Prozentsatz (%) der mRNA Verteilung in Prepolysomes, Licht und schwere Polysomes wie beschrieben32 mit einer Modifikation. Verwenden Sie synthetische RNA (hier OmpA) für Datennormalisierung in RT-qPCR Datenanalyse. Die synthetische RNA bietet eine Normalisierung-Steuerelement, das relative mRNAs Ebenen berechnen und vergleichen sie in verschiedene Fraktionen eines Verlaufs ermöglicht.

8. Analyse von Proteinen in Polysomal Bruchteilen von Western Blotting

  1. Aus einem 100 % (w/V) bestand hinzu Trichloressigsäure Säure (TCA) ausgewählte Brüche (500 μL), eine Endkonzentration von 10 % halten Sie für mindestens 15 min, Zentrifuge in einer Microfuge für 5 min auf Eis, überstand verwerfen, waschen zweimal mit eiskaltem Aceton und lösen sich in 25 μL der S DS-Seite laden Probenpuffer für Elektrophorese.
  2. Laden auf der SDS-PAGE und standard Elektrophorese mit folgenden Übertragung der PVDF-Membran führen. Fahren Sie mit Western Blot-33.

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Ergebnisse

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In dieser Studie beschreiben wir die Anwendung der polysomal Profilerstellung Technik zu drei verschiedenen Quellen: parasitäre Leishmaniose großen, kultivierten menschlichen Zellen und Maus Hoden. Leishmaniose Zellen frei wachsen in den flüssigen Medien in der Schwebe, kultivierte menschlichen Zellen wachsen in die anhaftende Monolage auf Tellern und Maus Hoden stellt eine Gewebeprobe. Die Methode kann leicht auf andere Arten von frei gewachsene Zellen in Suspension, ve...

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Diskussion

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Polysome Fraktionierung von Saccharose Farbverlauf in Kombination mit RNA und Protein-Analyse der Fraktionen ist eine leistungsfähige Methode, translationale Status der einzelnen mRNAs oder die ganze Translatome sowie Rollen der Protein Faktoren translational Regelung zu analysieren Maschinen während der normalen physiologischen oder Krankheit Zustand. Polysomal die Profilerstellung ist eine besonders geeignete Technik studieren translational Regelung in Organismen wie Trypanosomatids einschließlich Leishmaniose...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren danken für die Hilfe mit Audioaufnahme Ching Lee. Die Forschung wurde durch das Startkapital von Texas Tech University Health Sciences Center unterstützt und durch das Center of Excellence für translationale Neurowissenschaften und Therapeutika (CTNT) gewähren, PN-CTNT 2017-05 AKHRJDHW A.L.K.; Teil von NIH Grant R01AI099380 K.Z James C. Huffman und Kristen R. Baca waren CISER (Zentrum für die Integration von Mint-Ausbildung & Forschung) Gelehrten und wurden vom Programm unterstützt.

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2720 Thermal CyclerApplied Biosystems by Life Technologies4359659
CO2 InkubatorPanasonic Healthcare Co.MCO-170A1CUV
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ZentrifugeEppendorf5424
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Zählobjektträger, Doppelkammer für ZellzählerBio-Rad145-0011
1,5 mL MikrozentrifugenröhrchenUSA Scientific1615-5500
Offene polyklare Zentrifugenröhrchen, (14 mm x 89 mm)Seton Scientific7030
Spritze, 5 mLBD
BD Spritze 3 mL23 Gauge 1 Zoll NadelBD10020439
Nunclon Delta Auflegeplatte, 14 cmThermo Scientific168381
Nunclon Delta Auflegeplatte, 9 cmThermo Scientific172931
Nalgene Schnelldurchfluss 90 mm Filtereinheit, 500 mL, 0,2 aPESThermo Scientific569-0020
BioLite 75 cm3 KolbenThermo Scientific130193
Nunc 50 mL konische ZentrifugenröhrchenThermo Scientific339653
Chemikalien:
Trizol LSAmbion von Life Technologies10296028
HEPESFisher ScientificBP310-500
Trizma baseSigmaT1378-5KG
Dulbecco's Modified Eagle's Medium-High Glucose (DMEM)SigmaD6429-500ML
Fetales Rinderserum (FBS)SigmaF0926-50ML
Penicillin-Streptomycin (P/S)SigmaP0781-100ML
Lipofectamine 2000Invitrogen11668-019
Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung ( DPBS)SigmaD8537-500ML
Magnesiumchlorid-Hexahydrat (MgCl2x6H2O)Acros OrganicsAC413415000
Kaliumchlorid (KCl)SigmaP9541-500G
Nonidet P 40 (NP-40)Fluka (Sigma-Aldrich)74385
Rekombinanter Rnasin-Ribonuklease-InhibitorPromegaN2511
Heparin NatriumsalzSigmaH3993-1MU
cOmplete Mini EDTA-freie ProteasehemmerRoche Diagnostics11836170001
GlykogenThermo ScientificR0551
WasserSigmaW4502-1L
CycloheximidSigmaC7698-1G
ChloroformFisher Scientific194002
Dithiotreitol (DTT)Fisher ScientificBP172-5
EthidiumbromidFisher ScientificBP-1302-10
Ethylendiamintetraessigsäure Dinatriumdehydrat (EDTA)FisherScientific S316-212
OptimemLife Technologies22600050
PuromycindihydrochloridSigmaP8833-100MG
SaccharoseFisher ScientificS5-3KG
Trypsin-EDTA-LösungSigmaT4049-100ML
Hgh Kapazität cDNA Reverse Transkriptase KitAngewandte Biosysteme von life technologies4368814
Power SYBR Green PCR Master MixAngewandte Biosysteme von life technologies4367659
HClFisher ScientificA144SI-212
IsopropanolFisher ScientificBP26324
Kaliumhydroxid (KOH)Sigma221473-500G
Anti-RPL11 AntikörperAbcamab79352
Ribosomales Protein S6 (C-8) AntikörperSanta Cruz Biotechnology Inc.sc-74459
1xM199SigmaM0393-10X1L
Lithium-CloridSigmaL-9650
Dimethylsulfoxid (DMSO)Fisher ScientificD128-500
Gel-Ladepuffer IIThermo ScientificAM8546G
UltraPure AgaroseThermo Scientific16500-100
Trichloressigsäure (TCA)Fisher ScientificA322-100
SuperSignal West Pico PLUS ChemilumineszenzsubstratThermo Scientific34580
FormaldehydFisher ScientificBP531-500
Natriumdodecylsulfat (SDS)SigmaL5750-1KG
Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)SigmaP7626-5G
RNeasy Mini kitQiagen74104
Adenosin 5′-triphosphat Dinatriumsalzhydrat (ATP)SigmaA1852-1VL
Cytosin 5'-triphosphat Dinatriumsalzhydrat (CTP)SigmaC1506-250MG
Uridin 5'-triphosphat trinatriumsalzhydrat (UTP)SigmaU6625-100MG
Guanosin-5'-triphosphat-Natriumsalzhydrat (GTP)SigmaG8877-250MG
SP6 RNA-PolymeraseNEBM0207S
PyrophoshataseSigmaI1643-500UN
SpermidinSigmaS0266-1G
108-Kolben-Gradientenfraktionator 309646

Referenzen

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