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Eine In vitro- Modell, die Wirkung von 5-Aminolävulinsäure-vermittelten photodynamische Therapie auf Staphylococcus Aureus Biofilm zu studieren

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DOI:

10.3791/57604

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16. April 2018

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1Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, Eye & ENT Hospital, Shanghai Key Clinical Disciplines of otorhinolaryngology, Fudan University, 2Key Laboratory of Medical Molecular Virology of Ministries of Education and Health, Department of Medical Microbiology and Parasitology, School of Basic Medical Science, Shanghai Medical College of Fudan University, 3Department of Dermatology, Huashan Hospital, Fudan University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll, um die antimikrobielle Wirkung von 5-Aminolevulinic Säure-vermittelten die photodynamische Therapie (ALA-PDT) auf Staphylococcus Aureus Biofilm untersuchen. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um ein in-Vitro Modell zur Untersuchung der Behandlung von bakteriellen Biofilmen mit PDT in der Zukunft zu entwickeln.

Zusammenfassung

Staphylococcus aureus (S. Aureus) ist eine gemeinsame menschliche Erreger, wodurch pyogener und systemische Infektionen. S. Aureus Infektionen sind schwer, nicht nur durch die Entstehung von Antibiotika-resistenten Stämme, sondern auch seine Fähigkeit, Form Biofilme zu beseitigen. Vor kurzem hat die photodynamische Therapie (PDT) als eines der möglichen Behandlungen zur Steuerung von Biofilm-Infektionen angegeben wurde. Allerdings sind weitere Studien erforderlich, um unser Wissen über ihre Wirkung auf bakterielle Biofilme sowie die zugrunde liegenden Mechanismen zu verbessern. Dieses Manuskript beschreibt eine in Vitro -Modell der PDT mit 5-Aminolävulinsäure (5-ALA), ein Vorläufer der eigentlichen Photosensitizer Protoporphyrin IX (PpIX). Kurz, Reifen S. Aureus Biofilme mit ALA inkubiert und dann Licht ausgesetzt waren. Anschließend war die antibakterielle Wirkung der ALA-PDT auf S. Aureus Biofilm durch Berechnung der koloniebildenden Einheiten (KBE) quantifiziert und visualisiert durch Lebensfähigkeit fluoreszierende Färbung durch konfokale Laser-scanning-Mikroskopie (CLSM). Repräsentative Ergebnisse zeigten eine starke antibakterielle Wirkung der ALA-PDT auf S. Aureus Biofilmen. Dieses Protokoll ist einfach und kann zur Entwicklung eines in-vitro- Modells um die Behandlung von S. Aureus Biofilme mit ALA-PDT zu studieren. In Zukunft könnte es auch in PDT Studien unter Verwendung anderer Photosensibilisatoren für verschiedene Bakterienstämme mit minimalen Anpassungen verwiesen werden.

Einleitung

S. Aureus ist eine wichtige grampositive Erreger, die der Haut und der Schleimhaut des menschlichen Wirte kolonisiert. Seine Fähigkeit, Form Biofilme gilt als einen wichtigen Aspekt ihrer Pathogenese-1. Bakterielle Biofilme sind eine Gemeinschaft von Bakterien, die eingebettet in eine selbst erstellte Matrix, extrazelluläre Polymere Substanzen, einschließlich Polysaccharid, DNA und Proteinen besteht. Diese Matrix spielt eine bedeutende Rolle in der Persistenz von bakteriellen Infektionen, einen Beitrag zu einem hohen Grad des Widerstands gegen das menschliche Immunsystem und aktuellen antimikrobiellen Therapien2. Antibiotika sind noch die großen Behandlung für Biofilm-Infektionen, obwohl die Wirkung von Antibiotika auf Biofilme begrenzt sind. Bisher hat sich gezeigt, dass Zellen in Biofilmen 10 - 1.000 Mal resistenter gegen Antibiotika, die im Vergleich zu ihrer planktonischen Pendants3. Daher sind alternative Strategien erforderlich, um dieses Problem zu erobern.

PDT, eine alternative Behandlung für bakterielle Infektionen, nutzt das Licht einer geeigneten Wellenlänge Photosensibilisatoren aktivieren. Dies führt zu die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), die tödlich für Ziel-Zellen sind durch die Zellwand stören, Inaktivierung von Enzymen und Beschädigung DNA4. Diese Multi-Target-Eigenschaft macht es schwierig für Bakterien Resistenz gegen die PDT-Behandlung entwickeln.

Die antimikrobielle Wirkung der PDT auf bakterielle und Pilzinfektionen Biofilme mit mehreren Photosensibilisatoren wie Toluidin blau, Malachitgrün, Methylenblau, Chlor e6 und Porphyrine, wurde in vorherigen Berichten5,6untersucht, 7,8,9,10,11,12,13. 5-ALA, zeichnet sich ein Prodrug von der tatsächlichen Photosensitizer PpIX, durch seine kleinen Molekulargewicht und schnelle Abfertigung12,14. Diese Vorteile geben ALA-PDT großes Potenzial als eine therapeutische Anwendung. Obwohl die Wirkung von ALA-PDT auf planktonischen Bakterien durch viele Gruppen12untersucht wurden, hat die antimikrobielle Wirkung der ALA-PDT auf bakterielle Biofilme noch nicht aufgeklärt. Unterdessen ist es schwierig, die Ergebnisse von früheren Studien zu vergleichen. Einer der Gründe ist, dass die verschiedenen Protokolle von verschiedenen Gruppen genutzt werden. Dieses Protokoll beschreibt also, eine in-vitro- Modell eines ALA-PDT-Systems basierend auf unserer bisherigen Arbeit15. Die Wirkung dieses Modells wurde von KBE Berechnung und Lebensfähigkeit Färbung mit CLSM bestätigt.

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Protokoll

1. die Biofilmbildung

  1. Biofilmbildung in 96-Well-Mikroplatten
    1. Abrufen der S. Aureus -Stamm USA300 und 3 Biofilm bilden klinische Stämme (C1 - C3) bei-80 ° c gelagert
      Hinweis: Die Fähigkeit der klinische Stämme zu bilden Biofilme durch die Mikrotiter-Platte-Assay bestimmt war zuvor beschriebenen15.
    2. Das Bakterium in 5 mL Tryptone-Soja-Bouillon (TSB)-Medium zu impfen, und pflegen in einem Inkubator mit schütteln bei 37 ° C über Nacht an der stationären Phase.
    3. Zentrifugieren Sie die Übernachtung Bakterienkultur bei 4.000 x g für 10 min bei 25 ° C und verwerfen Sie den überstand. Aufschwemmen der Pellets in Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS), eine Endkonzentration von 2.0 x 109 KBE/mL.
      Hinweis: Die Konzentration der Bakterien wurde durch Messung der optischen Dichte geschätzt und weiter durch Platte bestimmt zählen16, enthüllt, dass 1 OD600 der Suspension enthaltenen 1,5 x 108 KBE/mL.
    4. Die Bakteriensuspension bis 1: 200 verdünnen (1,0 x 107 KBE/mL) in TSB-Medium mit 0,5 % Glukose. 200 µL Bakteriensuspension in jede Vertiefung eine Zelle-Kultur-behandelten Polystyrol 96-Well Mikrotestplatte zu impfen.
    5. Inkubieren Sie die Mikrotestplatte statisch bei 37 ° C für 24 h in einer gut oxygenierten.
      Hinweis: Die Inkubationszeit für Reife Biofilmbildung variieren für verschiedene Bakterienstämme; Dies sollte festgelegt werden, bevor die PDT experimentieren15.
    6. Entsorgen Sie die Medien in den Vertiefungen und dreimal die Mikrotestplatte Brunnen sanft mit PBS waschen und dann verwerfen des Überstands.
      Hinweis: Der Schritt sollte sehr vorsichtig erfolgen, um nicht zu stören den gebildeten Biofilm.
  2. Biofilmbildung in Gerichten
    1. Beimpfen den S. Aureus -Stamm USA300 in 5 mL TSB Medium, und pflegen in einem Inkubator mit schütteln bei 37 ° C über Nacht an der stationären Phase.
    2. Zentrifugieren Sie die Übernachtung Bakterienkultur bei 4.000 x g für 10 min bei 25 ° C und verwerfen Sie den überstand. Aufschwemmen der Pellets in PBS, eine Endkonzentration von 2.0 x 109 KBE/mL. Dann die Bakteriensuspension bis 1: 200 verdünnen (1,0 x 107 KBE/mL) in TSB-Medium mit 0,5 % Glukose. Impfen Sie 2 mL Bakteriensuspension in der optischen Qualität 35 mm Glas unten Zelle Kulturschale zu und inkubieren Sie statisch bei 37 ° C für 24 h.
      Hinweis: Die Konzentration der Bakterien wurde durch die Messung der optischen Dichte geschätzt.
    3. Aspirieren Sie die Medien mit einer Pipette und dann spülen Sie die Biofilme in der Schale vorsichtig mit PBS dreimal und dann verwerfen des Überstands vorsichtig.
      Hinweis: Berühren Sie die Pipettenspitze auf den Boden der Schale. Schritt 2.2 sollte unmittelbar nach diesem Schritt zu verhindern Austrocknen des gebildeten Biofilms durchgeführt werden.

(2) Lichteinstrahlung

  1. Lagern Sie 5-ALA im Kühlschrank 4 ° C. Verdünnen Sie vor dem Experiment 5-ALA mit PBS bis 10 mM.
    Hinweis: vor dem Experiment sollte 5-ALA Lösung frisch zubereitet werden.
  2. Fügen Sie in der experimentellen Gruppe 200 µL 10 mM ALA in jede Vertiefung der Mikrotestplatte oder 2 mL in der Kulturschale. Die Platte/Schüssel mit Alufolie abdecken und 1 h inkubieren. Dann bestrahlen Sie die Platte/Schale mit einer Leuchtdiode (LED) mit einer Intensität von 100 mW/cm2 für 1 h, eine leichte Dosis der 360 J/cm2 bei einer großen Wellenlänge von 633 ± 10 nm17zu erreichen.
    Hinweis: Um die Lichtenergie effektiv und gleichberechtigt an der Biofilm in alle Wells/Gerichte geliefert werden zu lassen, beheben Sie den Abstand von der Spitze der Lichtquelle in die Brunnen/Schale bei 6,0 cm, und begrenzen Sie die experimentelle Region zum Bereich zentrale Bestrahlung (10 cm x 8 cm). um sicherzustellen, dass die Ergebnisse reproduzierbar sind, sollten die Experimente bei gleicher Raumtemperatur durchgeführt werden.
    In der LED-Bestrahlung-Schritt zur Vermeidung von direkten Kontakt der Platte zu anderen Lichtquellen, wie Sonnenlicht, Raumbeleuchtung oder Lampenlicht, die LED vor dem Verschieben der Platte/Schale zum Bereich Bestrahlung eingeschaltet war, und das Licht war hell genug, um den Vorgang zu beenden.
  3. Richten Sie den Kontrollgruppen (drei Kontrollgruppen wurden in unserem Experiment eingerichtet).
    1. Für das erste Steuerelement hinzufügen Gruppe (ALA - LED-), 200 µL PBS in jede Vertiefung der Mikrotestplatte oder 2 mL in der Kulturschale. Die Platte/Schüssel mit Alufolie abdecken und 2 h inkubieren.
    2. Für die zweite Kontrollgruppe (ALA + LED-), fügen Sie 200 µL 10 mM ALA in jede Vertiefung der Mikrotestplatte oder 2 mL in der Kulturschale. Die Platte/Schüssel mit Alufolie abdecken und 2 h inkubieren.
    3. Für die dritte Kontrollgruppe (ALA-LED +), fügen Sie 200 µL PBS in jede Vertiefung der Mikrotestplatte oder 2 mL in der Kulturschale. Die Platte/Schüssel mit Alufolie abdecken und 1 h inkubieren. Dann setzen Sie die Platte, um die LED mit 360 J/cm2 Lichteinstrahlung bei einer großen Wellenlänge 633 ± 10 nm17.
      Hinweis: Vermeiden Sie direkten Kontakt der Platte mit anderen Lichtquellen, wie Sonnenlicht, Raumbeleuchtung oder Lampenlicht im LED Bestrahlung Schritt.

3. Ermittlung der Wirksamkeit der PDT-Behandlung

Hinweis: Um die Wirkung der ALA-PDT auf der S. Aureus -Biofilme zu bestätigen, wurde die Lebensfähigkeit der Zellen mit oder ohne ALA-PDT KBE zählen sowie Rentabilität Färbung ausgewertet.

  1. Bestimmung der verbleibenden lebensfähigen bakterielle Zellen
    1. Verwerfen Sie nach ALA-PDT-Behandlung die Medien in den Schächten und waschen Sie Brunnen mit PBS zu entfernen alle nicht-anhaftende Zellen für beide experimentelle Gruppen dreimal.
      Hinweis: Dieser Schritt sollte sehr vorsichtig durchgeführt werden.
    2. Kratzen Sie die anhaftenden Bakterienzellen gründlich aus den Brunnen mit der Pipettenspitze und sammeln Sie die Zellen in konischen Rohren.
    3. Die Bakteriensuspension bei 4.000 x g für 10 min bei 4 ° C zentrifugiert, dann verwerfen des Überstands.
    4. Aufschwemmen der Bakterien in 1 mL 0,25 % Pankreatin Enzym mit PBS-Puffer und Inkubation bei 37 ° C für 1,5 h.
    5. 4.000 x g für 10 min zentrifugieren; den überstand verwerfen, dann das Pellet in 200 µL PBS aufzuwirbeln.
    6. 01:10 serielle Verdünnungen der Zelle Lösung mit PBS zu machen; Fügen Sie dann 5 µL jeder serielle Verdünnung Probe auf die Tryptone-Soja-Agar (TSA)-Platte. Die TSA-Platte bei 37 ° C 16 h Inkubation; dann (mit bloßen Auge) die Anzahl der Bakterienkolonien (KBE/mL).
  2. Beobachtung von S. Aureus Biofilmen von CLSM
    1. Waschen Sie Biofilme in der Kulturschale mit PBS nach Lichteinstrahlung dreimal.
      Hinweis: Dieser Schritt sollte sehr vorsichtig durchgeführt werden.
    2. Fügen Sie 1 mL 1 µM grün-fluoreszierende nuklearen und Chromosom Fleck, der in die prokaryotische Zelle Membranen (z.B.SYTO9) und 1 mL 1 µM Propidium Jodid (PI) für 20 min, der Biofilm sowie abgestorbene Zellen zu beflecken durchlässig ist.
    3. Entwicklungsfähigen Zellen zu beobachten (grüne Fluoreszenz, Ex / Em 485 nm/530 nm) und abgestorbenen Zellen (rote Fluoreszenz, Ex / Em 485 nm/630nm) unter einem CLSM mit einem 63 X 1,4-NA Ölimmersion Objektiv.
    4. Generieren Sie Bilder mit Mikroskopie Software.

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Ergebnisse

Die Lebensfähigkeit der Bakterien in den Biofilmen war zurückgegangen, nachdem ALA-PDT-Behandlung im Vergleich zu den Kontrollen (ALA - LED, ALA + LED- und ALA-LED +) in USA300 und die drei klinische Stämme (Abbildung 1).

Zur Bestätigung der Ergebnisse von der KBE assay und beobachten die antibakterielle Wirkung von ALA-PDT auf der S. Aureus Biofilm in Situ, die USA300 Biofilmen wu...

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Diskussion

PDT wurde eine gut untersuchte Therapie für die Behandlung von Krebs, da es mehr als 100 Jahren erfunden wurde18. Im letzten Jahrzehnt PDT als antimikrobielle Strategie angewendet wurde und Wirksamkeit gegen einige Antibiotika-resistente Pathogene Bakterien12gezeigt hat. Im Vergleich zu den planktonischen Zustand, scheinen bakterielle Biofilme resistent gegen Antibiotika-Behandlung3, zu sein, während die Wirkung von ALA-PDT auf Biofilme noch nicht vo...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von National Nature Science Foundation of China für junge Wissenschaftler (Nr. 81300810), Shanghai junge Arzt Trainingsprogramm (Nr. 20141057) und National Natural Science Foundation of China (81671982, 81271791 und 81571955) finanziert. Wir möchten LetPub (www.letpub.com) Danke für die sprachliche Unterstützung bei der Vorbereitung dieser Handschrift.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Trypton-Soja-Bouillon (TSB)OXOIDCM0129B
Trypton-Soja-Agar (TSA)OXOIDCM0131
SYTO9Thermo Fisher ScientificL7012Die LIVE/DEAD BacLight Kits für die bakterielle Lebensfähigkeit 
Propidiumiodid (PI)Thermo Fisher ScientificL7012Die LIVE/DEAD BacLight Kits für die bakterielle Lebensfähigkeit 
PankreatinSigma-AldrichP3292
5-Aminolävulinsäure (ALA)Fudan Zhangjiang Bio-Pharm3.1
Staphylococcus aureus Stamm USA300/Die Quelle von USA 300 Referenzen " Tenover FC, Göring RV. J Antimikrobielle Chemother. September 2009; 64(3):441-6".
Staphylococcus aureus klinische Stämme (C1-C3)//Alle klinischen Stämme wurden von Patienten mit chronischer Rhinosinusitis in der Abteilung für Hals-Nasen-Ohren-Heilkunde-Kopf- und Halschirurgie, Augen- und HNO-Krankenhaus der Fudan-Universität isoliert [Zhang QZ, Zhao KQ, Wu Y, et al. PLoS One. 2017 Mar; 12(3): e0174627].
96-Well-MikrotiterplattenCorning Inc3599Durchsichtige Mikrotiterplatten aus Polystyrol mit flachem Boden, TC-behandelt, einzeln verpackt, mit Deckel, sterile
FluorodishNEST Biotechnologie801001Glasboden, pyrogene
Eppendorf Safe-Lock-Röhrchen, 1,5 mLEppendorf
Eppendorf Mikrozentrifuge 5417EppendorfZ365998 |  SIGMA
InkubatorThermo Fisher ScientificSHKE4000MaxQ 4000 Tisch-Orbitalschüttler
Leuchtdiode (LED)Wuhan Yage Optische und elektronische Technik COLED-IB
Leica TCS SP8 konfokales Laser-Scanning-MikroskopLeica Microsystems
Leica LAS AF SoftwareLeica Microsystems
IMARIS SoftwareBitplane
/ 0030120086

Referenzen

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koloniebildende Einheitenkonfokale LaserstrahlmikroskopieFluoreszenzf rbungbakterielle Viabilit tBiofilmbildungantimikrobieller Effekt

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