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Methodenartikel

Pflanze-Mikroben-Interaktion: Transcriptional Antwort des Bacillus Mycoides auf Kartoffel Wurzelausscheidungen

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DOI:

10.3791/57606

⸱

2. Juli 2018

 ,  , 
1Department of Molecular Genetics, University of Groningen

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das Ziel des hier vorgestellten Protokolls soll die transkriptomischen Reaktion der Endosphere isoliert Bacillus Mycoides auf Kartoffel Wurzelausscheidungen zu studieren. Diese Methode erleichtert die Identifizierung von wichtigen bakteriellen Gene Pflanze-Mikroben-Interaktionen beteiligt und gilt grundsätzlich für andere Endophyten und Pflanzen, mit geringfügigen Anpassungen.

Zusammenfassung

Pflanze-assoziierte Bakterien spielen eine wichtige Rolle bei der Förderung von Wachstum und Verhütung von Krankheiten bei Pflanzen. Die Anwendung der Pflanze wachstumsfördernde standarddüngung (PGPR) als biodüngemittel oder Biocontrol Mittel geworden eine effektive Alternative zu der Verwendung von herkömmlichen Düngemitteln und Ernte-Produktivität bei geringen Kosten zu erhöhen. Pflanze-Mikroben-Interaktionen abhängig Host Pflanze abgesondert Signale und eine Reaktion hereon durch ihre assoziierten Bakterien. Die molekularen Mechanismen der wie nützlichen Bakterien reagieren jedoch auf die damit verbundenen pflanzliche, dass Signale nicht vollständig verstanden sind. Beurteilung der transkriptomischen auf der Bakterien Wurzelausscheidungen ist ein leistungsfähiger Ansatz um die bakterielle Genexpression und Verordnung unter rhizospheric Bedingungen zu bestimmen. Solches Wissen ist notwendig, die zugrunde liegenden Mechanismen Pflanze-Mikroben-Interaktionen zu verstehen. Dieses Whitepaper beschreibt ein detailliertes Protokoll um die transkriptomischen Antwort von B. Mycoides EC18, ein Stamm von der Kartoffel Endosphere, Kartoffel Wurzelausscheidungen isoliert zu studieren. Mit Hilfe der jüngsten Hochdurchsatz-Sequenzierung-Technologie kann dieses Protokoll in mehreren Wochen und produzieren massive Datasets durchgeführt werden. Zunächst sammeln wir die Wurzelausscheidungen unter sterilen Bedingungen, nach denen sie B. Mycoides Kulturen hinzugefügt werden. Die RNA aus diesen Kulturen ist isoliert mit einem Phenol/Chloroform-Methode kombiniert mit einem kommerziellen Kit und durch automatisierte Elektrophorese Instrument einer Qualitätskontrolle unterzogen. Nach der Sequenzierung, Datenanalyse erfolgt mit der Web-basierten T-REx-Pipeline und eine Gruppe von differentiell exprimierten Genen identifiziert. Diese Methode ist ein nützliches Werkzeug, um neue Entdeckungen auf die bakterielle Gene in Pflanzen-Mikroben-Interaktionen zu ermöglichen.

Einleitung

Pflanzen können Exsudat bis zu 20 % des Kohlenstoffs in der Rhizosphäre1, d. h., die schmale Zone des Bodens in der Nähe der Wurzeln während der Photosynthese durch Wurzeln fixiert. Durch die höhere nährstoffverfügbarkeit ist die Rhizosphäre einen geeigneten Lebensraum für verschiedene Mikroorganismen, einschließlich der Förderung des Pflanzenwachstums Bakterien. Die Wurzelausscheidungen enthalten eine Reihe von anorganischen Verbindungen wie Ionen, anorganische Säuren, Sauerstoff und Wasser. Jedoch wird der Großteil der Wurzelausscheidungen von organischen Materialien, gebildet, in niedermolekulare Verbindungen und hochmolekularen Verbindungen unterteilt werden kann. Die niedermolekularen Verbindungen enthalten Aminosäuren, organische Säuren, Zucker, Phenolverbindungen, Fettsäuren und eine Reihe von sekundären Pflanzenstoffen. Die hochmolekularen Verbindungen bestehen aus Schleim und Proteine,2,3. Rhizosphäre Mikroorganismen können einige dieser Verbindungen als Energiequelle für Wachstum und Entwicklung. Die Wurzelausscheidungen spielen eine wichtige Rolle bei der Gestaltung der Wurzelbakterien Gemeinschaft, da die Pflanze produziert Verbindungen in die Exsudate durch Einwirkung auf die Expression bestimmter Gene das Verhalten der Rhizosphäre-assoziierte Bakterien beeinflussen können.

Verständnis der bakteriellen Antwort auf Wurzelausscheidungen ist ein wichtiger Schritt bei der Entschlüsselung wechselwirkungsmechanismen Pflanze-Mikroben. Da die bakterielle Reaktion auf Pflanze-Mikroben-Interaktionen das Produkt der differentiellen Genexpression, kann es durch die Transkriptom-Analyse untersucht werden. Mit dieser Methode, identifiziert frühere Studien mehrere wichtige Gene in Pflanzen-Mikroben-Interaktionen. In Pseudomonas Aeruginosawurden Gene, die im Stoffwechsel, Chemotaxis und Typ II-Sekretion zur Beantwortung von Zuckerrüben Wurzel Exsudate4gezeigt. Ventilator Et Al. 5 studierte die transkriptomischen Profilierung der B. Amyloliquefaciens FZB42 als Reaktion auf Mais Wurzelausscheidungen. Ihre Ergebnisse zeigen, dass die Gene, die stark durch die Wurzelausscheidungen induziert, Stoffwechselwege in Bezug auf Nährstoff Auslastung, Chemotaxis, Motilität und nicht-ribosomale Synthese von antimikrobiellen Peptiden und Polyketides mehrere Gruppen beteiligt sind.

Die Genauigkeit dieser Studien stützt sich auf die Sammlung von Wurzelausscheidungen. Obwohl mehrere Methoden der Sammlung von Wurzelausscheidungen für verschiedene Zwecke beschrieben haben, entweder verlangen ausgeklügelte Instrumente oder sind nicht in kontrollierten Bedingungen6,7,8durchgeführt. Darüber hinaus können Hemmung der Rhizosphäre Mikroorganismen Wurzel Exsudat Zusammensetzung beeinflussen, indem Pflanze Zellmembran Durchlässigkeit beeinträchtigen und schädigen die Wurzel Gewebe, insbesondere im Falle von Konsortien von Mikroorganismen9. Bei der Untersuchung der mikrobiellen auf Wurzelausscheidungen ist es wichtig, genau definierte Bedingungen zu verwenden, um Veränderung der Verbindungen durch andere Mikroorganismen10zu vermeiden. Darüber hinaus ist qualitativ hochwertige RNA erforderlich für RNA-Seq Transkriptom-Studien. Jedoch haben beim Umgang mit nicht-Modell-bakterielle Belastungen, die standard-Protokolle oder kommerziellen Kits in der Regel eine geringe Effizienz durch unbekannte Faktoren oder spezielle Wachstumseigenschaften.

Das hier beschriebene Protokoll wurde mit B. Mycoides, das ist ein grampositives, Spore bildet Bakterium Firmicute Phylum überprüft. Es ist allgegenwärtig in der Rhizosphäre der verschiedenen Pflanzenarten. Für diese Spezies, einschließlich Induktion des systematischen Widerstandes (ISR) in Zuckerrüben11, Hemmung der Dämpfung-off-Erregers Pythium Gurke12sowie Stickstoff wurden mehrere Pflanze Förderung Wachstumseigenschaften gemeldet. Fixierung in der Sonnenblume Rhizosphäre13. Allerdings sind die molekularen Mechanismen der Interaktion mit einer Wirtspflanze nicht gut untersucht.

Das Ziel der hier vorgestellten Experimente ist es, die transkriptomischen Reaktion der Endosphere isoliert B. Mycoides auf Kartoffel Wurzelausscheidungen zu studieren. Kurzum, das Protokoll besteht aus den folgenden Schritten: zunächst sammeln Kartoffeln Wurzelausscheidungen unter sterilen Bedingungen. Ziehen Sie dann, qualitativ hochwertige RNA aus Bakterienzellen mit Wurzelausscheidungen behandelt. Der letzte Schritt ist die Analyse der Daten mithilfe der webbasierten T-REx Pipeline14. Dieses Protokoll wurde verwendet, um B. Mycoides Gene zu identifizieren, die zeigen eine Verschiebung im Ausdruck Niveaus beim Kontakt mit Wurzelausscheidungen und damit möglicherweise eine wichtige Rolle in Pflanze-Mikroben-Interaktionen.

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Protokoll

(1) keimenden Kartoffel unter sterilen Bedingungen

  1. Spülen Sie die Kartoffel-Oberfläche mit sterilem Wasser. Baden Sie die Kartoffel in 70 % igem Ethanol und dann in 3 % Natriumhypochlorit für 5 min. Spülen Sie ihn wieder mit sterilem Wasser, alle übrigen Natriumhypochlorit zu entfernen.
  2. Bereiten Sie die Materialien für das Keimen und wachsen Kartoffelknollen benötigt; die Kunststoff-Töpfe, Engraftment Körbe, Vermiculit, sterilisieren und wässern durch Autoklavieren bei 121 ° C für 20 Minuten.
    Hinweis: Stellen Sie sicher, dass alle verwendeten Materialien autoklavierbar sind. Andernfalls verwenden Sie andere Sterilisation Methoden.
  3. Setzen Sie die Oberfläche sterilisiert Kartoffel in den Engraftment Korb, und platzieren Sie diese in einem Autoklaven Pot mit nassen Vermiculit.
  4. Halten Sie den Topf in einer Klimakammer bei 24 ° C für drei Wochen. Setzen Sie ihn auf Zyklen von 16 h Licht (120 µmol m-2s-1) und 8 Stunden der Dunkelheit. Um mikrobielle Kontaminationen zu vermeiden, verwenden Sie ein großes Glasfaser Feld um den Pot zu decken.

2. Sammeln von Kartoffel Wurzelausscheidungen

  1. Wenn die Triebe sprießen, Transfer der Korb mit die ganze Kartoffel in einen sterilen Becher mit 150 mL autoklaviert deionisiertes Wasser gefüllt, mit der Kartoffel Knollen platziert oberhalb der Wasseroberfläche und die Wurzeln in das Wasser getaucht (siehe Abbildung 1). Halten Sie den Keimling in der Klimakammer, und verwenden Sie dieselben Einstellungen wie zuvor [24 ° C; Zyklen von 16 h Licht (120 µmol m-2s-1), 8 h der Finsternis].
  2. Ab dem zweiten Tag auf sammeln Sie das Wasser mit den Ausscheidungen und Nachfüllen Sie den Becher mit sterilem deionisiertes Wasser. Führen Sie die Probenahme jeden Tag bis zum siebten Tag nach der Übertragung des Keimlings.
  3. Jede Probe separat bei 4 ° c Lagern Für jede Probe verteilt 100 µL auf ein Luria-Bertani (LB; 1 % Tryptone, 0,5 % Hefeextrakt, 0,5 % NaCl) nährbodenplatte für mikrobielle Kontaminationen zu überprüfen. Entsorgen Sie die kontaminierten Proben.
  4. Kombinieren Sie die gesammelten Proben von einem Sämling, und durch Gefriertrocknung sie bei-40 ° C zu einem Endvolumen von 150 mL zu konzentrieren.

(3) wachsenden Bakterien

  1. Streifen Sie eine B. Mycoides Belastung aus einem-80 ° C Glycerin bestand auf eine LB-Agar-Platte, und inkubieren Sie die Platte bei 30 ° C über Nacht.
  2. Impfen Sie eine LB-Flüssigmedium mit eine einzige Kolonie von der Platte zu, und wachsen Sie die Kultur in einem schütteln Inkubator bei 200 u/min über Nacht bei 30 ° C.

4. Behandlung und Beprobung von Bakterien

  1. Um die Wachstumskurve der Bakterien mit Wurzelausscheidungen behandelt, um eine Negativkontrolle zu vergleichen, bereiten Sie eine Reihe von Flaschen mit 50 mL LB-Flüssigmedium. Alle Flaschen 0,5 mL die Übernachtung Bakterienkultur hinzu, und fügen Sie 0 %, 5 %, 10 % oder 15 % (V/V) Wurzel Exsudat oder sterilen deionisiertes Wasser bzw. auf das Medium.
  2. Verwenden Sie eine Kultur mit entionisiertem Wasser anstelle von Wurzelausscheidungen als Kontrolle. Messung die optische Dichte bei 600 nm (OD600) jeweils 1 h danach. Generieren einer Wachstumskurs von Plotten die OD600 Werte im Vergleich zur Zeit.
    Hinweis: Wir haben gesehen, dass 10 % der die Wurzelausscheidungen keinen Einfluss auf das Wachstum von B. Mycoides (siehe Abbildung 2). Dieses Verhältnis wurde für RNA-Seq Experimente verwendet.
  3. Verdünnen Sie eine Übernachtung B. Mycoides -Kultur mit 90 mL vorgewärmten LB-Medium auf die anfängliche OD600 von ~ 0,05 in eine 300 mL Flasche. Die Kultur 10 mL Wurzelausscheidungen hinzu und bei 30 ° C für 1 h inkubieren.
  4. Verwenden Sie eine 10 mL sterilem deionisiertes Wasserbehandlung als Kontrolle. Sammeln Sie Zellen aus der Kultur durch Zentrifugation bei 9.000 x g für 2 min bei 4 ° C. Den überstand verwerfen und sofort das Pellet in flüssigem Stickstoff eingefroren, dann bis zur Verwendung bei-80 ° C lagern.

(5) RNA-Isolation

Hinweis: Bevor Sie beginnen die Isolation, bereiten Sie die Werkbank, Racks und Pipetten mit einer RNase Dekontaminationslösung reinigt (siehe Tabelle der Materialien). Tragen Sie Handschuhe bei aller Zeiten, und sicherstellen, dass alle Rohre, Tipps und Lösungen sind RNase-freie. Halten Sie die Proben auf Eis wenn möglich.

  1. Reinstwasser (100 µL DEPC pro 100 mL Lösung) 0,1 % (V/V) von Diethyl-Pyrocarbonate (DEPC) hinzufügen, gut vermischen und über Nacht bei Zimmertemperatur aufbewahren. Autoklaven die Mischung, die DEPC nach Behandlung über Nacht zu inaktivieren. Diese DEPC-behandeltem Reinstwasser zur Vorbereitung der TE-Puffer verwenden [10 mM Tris-HCl (pH = 8), 1 mM EDTA] und einer 10 % igen SDS (w/V) Lösung.
  2. Die Zelle-Pellets auf dem Eis Auftauen und jeweils in 400 µL TE (DEPC) Puffer auszusetzen. Übertragen Sie die Suspensionen in 2 mL Schraubverschluss Rohre.
  3. Premix 300 µL Chloroform Isoamyl Alkohol (24:1 V/V) und 300 µL Phenol (saure Phenol, RNA-Klasse), und die Mischung für 5 min stehen lassen. Nehmen Sie 500 µL der oberen organischen Phase die resuspendierte Zellen hinzu. Dann fügen Sie 50 µL 10 % SDS und 0,5 g Glasperlen (0,5 µm) in die Röhre.
  4. Schließen Sie den Deckel fest und legen Sie das Rohr in eine Rührwerksmühle Homogenisator (siehe Tabelle der Materialien). Führen Sie eine 3 × 45 s Puls Homogenisierung mit einem Intervall von 1 min auf Eis.
  5. Zentrifugieren Sie Proben für 10 min bei 11.000 x g (4 ° C) und übertragen Sie die obere Phase auf einen neuen Schlauch.
  6. Die obere Phase ab Schritt 5.5 500 µL Chloroform Isoamyl Alkohol (24:1) hinzu und Zentrifugieren Sie die Mischung für 5 min bei 11.000 x g (4 ° C).
    Hinweis: Die folgenden Schritte wurden geändert von Anweisungen des Herstellers eine kommerzielle Glasfaser filterbasierte RNA Isolation kit (siehe Tabelle der Materialien).
  7. Übertragen Sie 500 µL der oberen Phase auf einem frischen Rohr, fügen Sie 2 Bände (1 mL) eines Puffers Lyse/Bindung hinzu und mischen Sie es durch pipettieren rauf und runter.
  8. Kombinieren Sie die Filter und Sammlung Röhrchen (aus dem RNA-Isolierung-Kit) und pipette die Mischung aus Schritt 5.7 mit dem Filter-Rohr. Zentrifugieren Sie die Rohre für 15 s bei 8.000 x g und entsorgen der durchströmten.
  9. Bereiten Sie 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen mit 100 µL DNase Puffer, 10 µL der DNase I und 5 µL RNase-Inhibitor (siehe Tabelle der Materialien). Fügen Sie die fertige Lösung mischen auf dem Filter der Filter-Röhre, und 20-30 Minuten bei 15-25 ° c inkubieren
  10. Der Wasch-Schritte nach Anweisungen des Herstellers. Verwenden Sie 50 µL eines Puffers Elution, um die RNA zu eluieren.
  11. Speichern der eluierten RNS bei-80 ° C und einen Kunststoff Paraffin Film um ihn herum. Zum gleichen Zeitpunkt übertragen Sie wenige Mikroliter der Probe zu einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch einen Qualitäts-Check durchführen.

(6) RNA-Qualitäts-Check und Sequenzierung

  1. Überprüfen Sie die RNA mit einem Microvolume Spektrophotometer.
    Hinweis: Extinktion Verhältnisse bei 260/280 sollte über 1,8 und Kennzahlen auf 260/230 sollte über mindestens 1,8, vorzugsweise über 2.0.
  2. Lauf die gereinigte RNA in automatisierte Elektrophorese Instrument mit der empfehlen-RNA-Analyse kit (siehe Tabelle der Materialien); die RNA-Integrität-Anzahl (RIN) muss mindestens über 7 um fortzufahren.
  3. Verwenden Sie einen Gesamtbetrag von 3 µg RNA pro Probe, um Bibliotheken mit einer RNA-Seq-Bibliothek-Vorbereitung zu generieren kit (siehe Tabelle der Materialien) nach den Empfehlungen des Herstellers.
    Hinweis: Die Bibliothek Vorbereitungen wurden auf einer Plattform von Hochdurchsatz-Sequenzierung sequenziert und gepaart Ende liest generiert wurden.

(7) Datenanalyse mit Hilfe den Web-basierten Pipeline T-REx

  1. Führen Sie eine Qualität Filterung mit dem FASTX-Toolkit Version 0.0.13 (Phred Qualitätsfaktoren von > 20). Schneiden Sie die rohen RNA-Seq liest aus dem Adapter-Sequenzen mit dem Trimmomatic-Werkzeug.
    Hinweis: Die nachfolgenden Analysen beruhten auf saubere Daten mit hoher Qualität.
  2. Laden Sie die B. Mycoides ATCC 6462 NCBI-Genom-Datenbank (NCBI Beitritt Nr.: CP009692.1) und verwenden Sie es als eine Referenz-Genom für die Zuordnung der sauberen liest mit Bowtie2/2.2.3.
  3. Verwendung HTSeq v0.6.1 liest Zahlen zählen, jedes Gen zugeordnet und die Lesevorgänge pro Kilobase Abschrift pro million zugeordneten liest (RPKM) jedes Gens basierend auf der Länge der Anzahl der Gene und liest dieses Gen zugeordnet.
  4. Für die Analyse der Daten von der T-REx-Pipeline, verwenden Sie die RPKM-Tabelle als Eingabe sowie drei beschreibenden Dateien: (i) eine Datei Faktoren zu beschreiben, das Experiment in Faktoren, (Ii) eine Kontraste-Datei zu definieren, welche Faktoren für differenzielle Genexpression verglichen werden , und (Iii) eine Klassendatei um Gruppen von Genen von Interesse zu beschreiben.
    Hinweis: Die beschreibenden Dateien sind in.txt Format. Beispiele finden Sie auf der Webseite von T-REx (http://genome2d.molgenrug.nl/). Eine detaillierte Anleitung für die Datenanalyse mit T-REx finden Sie in einer früheren Publikation von de Jong Et al. 14.

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Ergebnisse

Pflanze-assoziierten Mikroorganismen können Wachstum und die Gesundheit positiv beeinflussen. Allerdings sind die Mechanismen die komplexen Wechselwirkungen zwischen Pflanzen und ihre mikrobiellen Symbionten nicht vollständig geklärt. Wurzelausscheidungen spielen eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Wurzelbakterien Aktivität und Verhalten, und es wird in der Regel postuliert, dass die mikrobielle Besiedlung der Wurzeln mit dem Reiz der Mikroben zu Wurzelausscheidungen initiiert. Da...

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Diskussion

Pflanze-Mikroben-Interaktionen haben vermutet, um durch ein fein abgestimmtes Gleichgewicht zwischen Bakterien und Pflanzen bestimmt werden. Solche Interaktionen sind sehr komplex und schwierig zu studieren in ein natürliches System, umfasst verschiedene Mikrobenarten, potenziell als Konsortien. Dieses Whitepaper beschreibt ein vereinfachtes Protokoll, um die bakterielle Reaktion auf Wurzelausscheidungen unter kontrollierten Bedingungen zu studieren. Das Transkriptom-Profil des standarddüngung, bei Kontakt mit Wurzelauss...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Danksagungen

Wir danken Jakob Viel für seine hilfreichen Kommentare und Vorschläge. Wir danken auch Anne de Jong für seine Hilfe bei der Analyse der Bioinformatik. Yanglei Yi und Zhibo Li werden von der China Scholarship Council (CSC) unterstützt. Wir bedanken uns bei NWO-TTW Perspectief Programma Back2Roots (TKI-AF-15510) für ihre finanzielle Unterstützung auf OPK.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
NatriumhypochloritSigma  CAS: 7681-52-9 10-15%  aktives Chlor
Luria-Bertani (LB)
New Brunswick ScientificInnova 4000
SpektralphotometerThermo Fisher ScientificGenesys 20
Flüssigstickstoff-Glasperlen
SigmaG88930,5 µ m
2,0 ml Röhrchen mit SchraubverschlussRNasefrei
1,5 ml und 2,0 ml Eppendorf RöhrchenRNase frei
Kugelmühlen-HomogenisatorBioSpec607Mini_beadbeater
ZentrifugeEppendorf5430
Diethyl pyrocarbonat (DEPC)sigmaCAS: 1609-47-8
Natriumdodecylsulfat (SDS)sigmaCAS: 151-21-3 10%ige Lösung, hergestellt mit DEPC-behandeltem MQ-Wasser
TE-Puffer10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH=8
PhenolSigmaRNA-Qualität
Chloroform-Isoamylalkohol24:1 Chloroform:Isoamylalkohol herstellen, bei Raumtemperatur lagern
Isolationskit für hochreine RNARoche11828665001
RNase DekontaminationslösungInvitrogenAM9780RNase-Zap
Automatisiertes ElektrophoresegerätAgilent2100Bioanalysator
Mikrovolumen-SpektralphotometerThermo Fisher ScientificNanodrop ND-1000
RNA-Qualitätsanalyse-KitAgilentRNA 6000 Nano-Kit 
RNase-InhibitorThermo Fisher ScientificRiboLock
Gerichtete RNA-Bibliothek VorbereitungskitNEBUltrafür Illumina
Bouillon-Inkubator

Referenzen

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Schlagwörter

Transkriptomische AntwortRNA IsolierungHochdurchsatz SequenzierungT REx Pipelinedifferentielle GenexpressionSammlung von WurzelexsudatenBehandlung von Bakterienkulturen
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